梁方圓，布仁，楊利，陸景坤，廖園紅，王躍武*

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古庫倫蒙藥有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

三味檀香散原方載于《四部醫(yī)典》，是蒙古族、藏族醫(yī)治療心熱病的常用方，由廣棗Choerospondiatis Fructus、肉豆蔻Myristicae Semen 和檀香Santali Albi Lignum 3 味藥組成，其中廣棗為方中君藥[1]。三味檀香散具有清熱、祛風(fēng)、養(yǎng)心之功效，臨床用于治療冠心病、心絞痛、心力衰竭等缺血性心臟病[2]。本課題組前期研究表明，三味檀香散能通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和FoxO 信號通路顯著降低模型大鼠心肌缺血-再灌注損傷，但是3種藥味的配伍作用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[3-4]。

三味檀香散中君藥廣棗是蒙古族醫(yī)治療心血管疾病的特色藥材，為漆樹科植物南酸棗Choerospondias axillaris（Roxb.）B.L.Burtt &A.W.Hill的干燥成熟果實。廣棗中的黃酮、有機酸、酚酸能夠減輕心肌缺血再灌注損傷[5]。本課題組前期運用Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜結(jié)合指紋圖譜法評價了10 批廣棗藥材質(zhì)量，以鞣花酸為參照物建立了指紋圖譜，并對其共有峰進行化學(xué)成分歸屬，鑒定出廣棗中的37 個化合物，發(fā)現(xiàn)主要為酚酸類和有機酸類成分[6]。

為了探討廣棗在三味檀香散配伍中的作用，本研究采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（HPLC-Q-Exactive-MS/MS）對三味檀香散和廣棗的化學(xué)成分進行了歸屬鑒定；觀察廣棗和三味檀香散對斑馬魚血栓模型、小鼠巨噬細胞RAW246.7 炎癥模型和大鼠心肌細胞H9c2 氧化損傷模型的干預(yù)作用；采用灰色關(guān)聯(lián)度分析探究廣棗在三味檀香散中配伍的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TB-214 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SB25-12DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；離心濃縮裝置（UT200 型冷阱、CVE-3110 型離心濃縮儀，日本東京理化器械株式會社）；DFC450C 型智能光學(xué)正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 試藥

一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；細胞增殖及毒性檢測CCK-8 試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（LPS，北京索萊寶科技有限公司）；苯肼（北京百靈威科技有限公司）；鄰聯(lián)茴香胺（阿法埃莎天津化學(xué)有限公司）；對照品鞣花酸（批號：11959-201903）、沒食子酸（批號：110831-201906）、槲皮素（批號：100081-201610）、檸檬酸（批號：110831-201906）、肉豆蔻醚（批號：190180-201701）、macelignan（批號：111844-201603）、去氫二異丁香酚（批號：111838-201403）、甲基丁香酚（批號：111642-200301）、丁香酚（批號：110725-201917）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品兒茶素（批號：DETDE000101，樂美天醫(yī)藥德斯特生物公司）；對照品欖香素（批號：487-11-6，北京英萊克發(fā)展有限公司）；對照品3,3?-O-二甲基鞣花酸（批號：DE002001）、奎寧酸（批號：QMC-102733）、黃樟素（批號：SFL-966522）均購自北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院；所有對照品純度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜純（美國Fisher Chemical 公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

三味檀香散分別為內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司（批號分別為1908006、1912052、2003059、200014、2101061）、內(nèi)蒙古庫倫蒙藥有限公司（批號分別為181235021、200621040、201049076、201049029）、國際蒙醫(yī)醫(yī)院（批號：20210505）、內(nèi)蒙古凱蒙藥業(yè)有限公司（批號：20051401.1586、20051401.1639、20051401.1683、19121701.0853、19121701.0853、19121701.0833、19121701.0804）生產(chǎn)；廣棗藥材（批號：302843）購于內(nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定為漆樹科植物南酸棗Choerospondias axillaris（Roxb.）B.L.Burtt &A.W.Hill 的干燥成熟果實；鄰聯(lián)茴香胺染色液由0.6 mg·mL-1鄰聯(lián)茴香胺、0.01 mol·L-1醋酸鈉、0.65% H2O2、40%乙醇配制而成。

1.3 實驗動物與細胞

無特定病原體（SPF）級健康SD 大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量（230±20）g，由斯貝福北京生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）-2019-0010。經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，符合倫理原則（審批號：YKD2018056）。斑馬魚（AB/TU 品系）體長（3.0±0.3）cm，由上海斑馬魚科研服務(wù)中心提供。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7、大鼠心肌細胞H9c2 均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 HPLC-Q-Exactive-MS/MS定性分析三味檀香散和廣棗的化學(xué)成分

2.1.1 樣品溶液的制備 取4 個不同廠家生產(chǎn)的三味檀香散按照臨床等效劑量等比混合，精密稱定三味檀香散混合物0.627 g、廣棗細粉（過100 目篩）0.209 g 分別置于15 mL 離心管，加入甲醇10 mL，渦旋混勻，超聲30 min（頻率為40 kHz），離心10 min（4 ℃，1 612.8×g），37 ℃減壓干燥，加入甲醇100 μL復(fù)溶，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別稱取對照品適量，加甲醇配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對照品儲備液，分析前分別取適量配成混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 ACEEXCEL3 C18-PFP 色譜柱（100 mm×3 mm，3 μm）；流動相為0.2%甲酸甲醇溶液（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.8 min，2%～5%A；0.8～1.7 min，5%～10%A；1.7～2.5 min，10%～18%A；2.5～3.3 min，18%～23%A；3.3～4.2 min，23%～28%A；4.2～5.8 min，28%～33%A；5.8～9.2 min，33%～43%A；9.2～11.2 min，43%～46%A；11.2～14.3 min，46%～60%A；14.3～16.0 min，60%～65%A；16.0～17.7 min，65%～68%A；17.7～19.2 min，68%～75%A；19.2～20.0 min，75%～80%A；20.0～20.8 min，80%～2%A；20.8～24.0 min，2%A）；流速為0.3 mL·min-1；4 ℃自動進樣，柱溫為35 ℃。

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），MSdd-MS2掃描模式，正、負離子2 種模式下獲取質(zhì)譜信息。負離子質(zhì)譜條件：鞘氣流速為35 L·min-1；輔助氣流速為10 L·min-1；噴霧電壓為2.8 kV；毛細管離子傳輸管溫度為350 ℃；S-lens電壓為50 kV；加熱溫度為150 ℃；質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1000。正離子質(zhì)譜條件：噴霧電壓為3.5 kV，其余條件同負離子模式。

2.1.5 HPLC-Q-Exactive-MS/MS 定性分析 按2.1.3、2.1.4 項下條件對各樣本進行分析，結(jié)果導(dǎo)入到Compound Discoverer 3.0 軟件，選擇軟件內(nèi)置Workflow“Impuroties w Stats Expected w FISh and Unknown Compound Class Scoring and Searches”，在“Search MassLists”中選擇自建的三味檀香散化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫[3]，依據(jù)軟件分析獲得的MassLists、mzCloud結(jié)果（mzCloud Best Sim.Match>85）。

2.2 三味檀香散和廣棗的藥效學(xué)研究

2.2.1 含藥血清的制備 SD 大鼠隨機分為對照組、三味檀香散組和廣棗組，每組4 只，雌、雄各半。其中三味檀香散組將不同廠家和批號的三味檀香散混合均勻后，用0.05%羧甲基纖維素鈉配制，劑量為8.1 g·kg-1（為臨床等效劑量的10 倍）；廣棗組將廣棗細粉（過100 目篩）用0.05%羧甲基纖維素鈉配制，給藥劑量為2.25 g·kg-1（為臨床等效劑量的10 倍）。各組大鼠連續(xù)7 d 灌胃給予相應(yīng)藥物，對照組大鼠給予等量0.05%羧甲基纖維素鈉，末次給藥1 h后用戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，收集血清分裝，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 受試物對LPS 誘導(dǎo)的RAW246.7 細胞NO 分泌的影響 將RAW246.7 細胞接種到96 孔板，接種密度為5×104個/孔，每孔100 μL，用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，分為對照組、模型組（LPS 5000 ng·mL-1）、三味檀香散和廣棗含藥血清干預(yù)組，每100 μL 培養(yǎng)體系加入含藥血清10 μL，空白組與模型組加入正常動物血清后，模型組和各含藥血清組加入LPS，使終質(zhì)量濃度為5000 ng·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取上清液，用NO 試劑盒分析各組細胞上清液中NO 含量，考察三味檀香散和廣棗對RAW246.7 細胞分泌NO 的抑制作用。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.2.3 受試物對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細胞氧化損傷的影響 取生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)于10% FBS DMEM 的H9c2 細胞，以1×105個/孔密度接種于96 孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為空白組、對照組、模型組（H9c2 900 μmol·mL-1）、三味檀香散和廣棗含藥血清組，含藥血清加入比例同2.2.2 項下。培養(yǎng)24 h 后，按CCK-8 試劑盒說明書處理，采用酶標儀在490 nm 檢測H9c2 細胞活力。每組5 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次，按照公式（1）計算細胞活力。

2.2.4 受試物對苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型的影響 常規(guī)觸發(fā)斑馬魚產(chǎn)卵，2～4 h后吸取胚胎并置于表面皿中在孵化箱中孵化，每天換營養(yǎng)液2 次，移除死胎，72 h 后將其移入培養(yǎng)皿中。發(fā)育至5 d 時，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，移入12孔板中，隨機分為4 組，即對照組、模型組（苯肼8 μmol·L-1）、廣棗含藥血清組（225 μg·mL-1）、三味檀香散含藥血清組（800 μg·mL-1），每組3 孔，每孔10 條。藥物干預(yù)16 h 后，用鄰聯(lián)茴香胺染液對斑馬魚染色10 min 后，每組隨機挑選10 尾斑馬魚用二甲基亞砜（DMSO）快速清洗，在體視顯微鏡（60×）觀察心臟紅細胞染色情況、尾靜脈血栓并拍照記錄；用ImagePro Plus 6.0 圖像處理軟件對心臟紅細胞染色強度進行定量分析，分別按照公式（2）、公式（3）計算心臟紅細胞染色強度、血栓形成率和抗血栓藥效。

2.3 譜-效灰色關(guān)聯(lián)度分析

基于藥效有效性結(jié)果，以RAW246.7 細胞釋放NO 抑制率和H9c2 細胞活性為2 組參考序列，以三味檀香散、廣棗色譜圖峰面積Xi(k) 為比較序列，將變換后的藥效數(shù)據(jù)記為Y(k)，按照公式（4）計算絕對差序列[Δi(k)]，按照公式（5）計算關(guān)聯(lián)系數(shù) [ξi(k)]，按照公式（6）計算關(guān)聯(lián)度（r）。

式中，對于參考數(shù)列Y(k) 有若干個比較數(shù)列Xi(k)，Δ(min)和Δ(max)分別為所有比較序列絕對差中的最小值與最大值；Δi(k)表示比較數(shù)列與參考序列的絕對差；ρ為分辨系數(shù)，取0.5[7-8]；n表示比較序列的數(shù)據(jù)個數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 三味檀香散和廣棗成分鑒定及歸屬

負離子模式下廣棗和正、負離子模式下三味檀香散樣品UPLC-ESI-MS/MS 總離子流圖見圖1。Xcalibur 軟件提取二級質(zhì)譜裂解碎片離子信息，結(jié)合三味檀香散自建數(shù)據(jù)庫、MassBank 公共數(shù)據(jù)庫，通過對照品及文獻比對[6]，共分析和鑒定出三味檀香散中48 個成分，包括18 個木脂素、3 個苯丙素、5個黃酮、8個有機酸、7個酚酸、6個倍半萜、1個氨基酸。共分析鑒定廣棗中22個成分，包括8個酚酸、8 個有機酸、6 個黃酮。廣棗與三味檀香散的共有成分有20 個，包括3,3?-二氧甲基鞣花酸、3,8-二-O-甲基鞣花酸-2-O-葡萄糖苷、鞣花酸、沒食子酸、檸檬酸、蘋果酸、兒茶素、檸檬酸單甘酯、柚皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素、奎寧酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、檸檬酸甲酯、水楊酸、檸檬酸三乙酯、6-羥基吲哚乳酸、甲基鞣花酸葡萄糖苷、訶子酸、原兒茶酸。其中12 個化合物為對照品比對確定。所鑒定的化合物分子式、保留時間（tR）、質(zhì)譜數(shù)據(jù)和來源歸屬見表1。

表1 三味檀香散化學(xué)成分鑒定及歸屬

圖1 三味檀香散和廣棗總離子流圖

廣棗成分多為有機酸、無機酸和黃酮類成分，主要在負離子模式下解析，因此本研究主要針對三味檀香散和廣棗的負離子模式下離子流圖進行解析。

3.2 三味檀香散和廣棗的藥效學(xué)研究結(jié)果

3.2.1 受試物對LPS 誘導(dǎo)的RAW246.7 細胞NO 分泌的影響 結(jié)果見圖2，與模型組比較，廣棗和三味檀香散含藥血清均能顯著抑制NO 分泌（P<0.01），且三味檀香散組細胞NO 分泌量顯著低于廣棗組（P<0.05）。

圖2 三味檀香散和廣棗對LPS誘導(dǎo)的Raw246.7細胞NO分泌的影響（,n=3）

3.2.2 受試物對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細胞氧化損傷的影響 實驗結(jié)果見圖3，與模型組比較，廣棗和三味檀香散含藥血清均能減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷（P<0.01），且三味檀香散組抗氧化損傷作用顯著低于廣棗組（P<0.01）。

圖3 三味檀香散和廣棗對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷的影響（,n=3）

3.2.3 受試物對苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型的影響 實驗結(jié)果見圖4，與對照組比較，血栓模型組斑馬魚心臟紅細胞染色較弱（P<0.01），尾靜脈血栓明顯，提示模型制備成功，見圖4A、圖4B。三味檀香散組斑馬魚心臟染色強度較模型組顯著增強（P<0.01），但廣棗組斑馬魚心臟染色強度與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4C。血栓形成率分別為模型組24.7%、廣棗組15.3%、三味檀香散組-29.6%（抑制血栓形成）；抗血栓藥效分別為廣棗組84.9%、三味檀香散組165.8%，見圖4D、圖4E。結(jié)果顯示三味檀香散有較強抗血栓作用，廣棗無抗血栓作用。

圖4 三味檀香散和廣棗對苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型的影響（,n=10）

3.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

本實驗中參考序列為RAW246.7 細胞NO 抑制率時，Δ(min)=0.007 2，Δ(max)=1.104 4，參考序列為H9c2 細胞活性時，Δ(min)=0.199 5，Δ(max)=1.208 4。r計算結(jié)果見表2。當(dāng)r>0.6 認為化合物對相應(yīng)藥效有貢獻，廣棗中對H9c2 細胞氧化損傷r>0.6的化合物有10個，r由大到小依次為兒茶素、柚皮素、3,8-二-O-甲基鞣花酸-2-O-葡萄糖苷、3,3?-二氧甲基鞣花酸、槲皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、甲基鞣花酸葡萄糖苷、6-羥基吲哚乳酸、檸檬酸甲酯、檸檬酸三乙酯。廣棗中僅柚皮素、兒茶素對RAW246.7細胞釋放NO 抑制率有貢獻，關(guān)聯(lián)度分別為1.000 0和0.840 6。

表2 三味檀香散中化學(xué)成分的譜-效灰色關(guān)聯(lián)度分析

4 討論

復(fù)方新藥中各藥味的多元藥效取其與適應(yīng)證相關(guān)的功效，所謂用其所長，并在配伍環(huán)境中發(fā)揮協(xié)同作用。其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)亦隨之關(guān)聯(lián)，進而作為制備工藝（有效性獲?。┖唾|(zhì)量標準制定的依據(jù)。本研究通過HPLC-Q-Exactive-MS/MS 檢測到三味檀香散中48 個成分，其中以木脂素為主，有機酸、酚酸、黃酮次之，還有少量萜類和氨基酸成分；廣棗中22 個成分，以有機酸、酚酸、黃酮成分為主。其中黃酮類成分柚皮素對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，可通過上調(diào)PI3K/Akt/Nrf2 通路促進血紅素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化物質(zhì)的表達和活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）等氧化物質(zhì)的清除[9]。兒茶素能改善老年冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MEK/ERK）信號通路，抑制大鼠機體炎性因子[10]。通過灰色關(guān)聯(lián)度法對廣棗和三味檀香散中色譜圖峰面積和藥效數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)兒茶素、柚皮素與抗炎、抗心肌氧化損傷藥效關(guān)聯(lián)度均大于0.8，表明兒茶素和柚皮素可能是廣棗在三味檀香散方劑中發(fā)揮抗炎、保護心肌細胞的主要藥效成分。

通過藥效實驗發(fā)現(xiàn)，廣棗保護心肌細胞功效優(yōu)于三味檀香散，抗炎作用次于三味檀香散，廣棗對斑馬魚血栓沒有顯著影響。三味檀香散中三味藥材等量入藥，說明廣棗在抑制心肌氧化損傷方面和抗炎方面發(fā)揮重要作用。而三味檀香散抗血栓、抗炎功效強于廣棗，則可能是三味檀香散中肉豆蔻和檀香的成分起到協(xié)同作用。研究表明，肉豆蔻中揮發(fā)油成分能明顯減慢心率、降低心律失常發(fā)生率，肉豆蔻中四氫呋喃類木脂素machilin B 能活化絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），治療2 型糖尿病等代謝綜合征；丁香酚是苯丙烷類的酚類化合物，是肉豆蔻揮發(fā)油的重要成分，有研究表明丁香酚可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥信號傳導(dǎo)，減少NO、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達，且可以減輕大鼠缺血/再灌注（I/R）損傷[11]；苯并四氫呋喃類木脂素myrisfrageal B 能抑制NO，發(fā)揮抗炎作用[12]。檀香中α-檀香醇、β-檀香醇是檀香揮發(fā)油的主要成分，具有中樞鎮(zhèn)靜作用，反式-4-羥基脯氨具有抗氧化、調(diào)節(jié)脂肪乳化、抗菌、抗腫瘤、抗高血壓等作用[13]。但由于肉豆蔻與檀香均以揮發(fā)油成分為主，在HPLC-Q-Exactive-MS/MS 不易測定，后續(xù)需要進一步研究。

綜上分析，本研究通過灰色關(guān)聯(lián)度分析法得到廣棗的譜效關(guān)聯(lián)性，探討了廣棗在三味檀香散中的配伍作用，初步衡量各成分對藥效的貢獻程度，可為研究三味檀香散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制提供依據(jù)。