王清，武立偉，范潘慧，徐志超，羅紅梅，孫偉，王瑀，鄭司浩，宋經(jīng)元，5，姚輝，5*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193；2.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；4.中國(guó)中藥有限公司，北京 102600；5.中藥資源教育部工程研究中心，北京 100193

甘草為我國(guó)大宗藥材，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、調(diào)和諸藥的功效，素有“十方九草”之說(shuō)。甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.是甘草藥材的主要來(lái)源，其主要成分是黃酮類和三萜類化合物[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版規(guī)定甘草藥材含甘草苷不少于0.50%，甘草酸不少于2.0%[2]。甘草酸屬于三萜皂苷類化合物，目前學(xué)界內(nèi)認(rèn)為該類化合物的生物合成是以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為起始物質(zhì)，經(jīng)過(guò)甲羥戊酸（MVA）途徑合成。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）、鯊烯合酶（SQS）、β-香樹(shù)脂醇合酶（β-AS）被認(rèn)為是甘草酸合成途徑中的3 個(gè)關(guān)鍵限速酶。隨著甘草酸合成下游途徑細(xì)胞色素P450 單加氧酶CYP88D6、CYP72A154 及纖維素合成酶超家族衍生的糖基轉(zhuǎn)移酶CSyGT、糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73P12 的發(fā)現(xiàn)[3-6]，甘草酸的主要合成通路已完全解析。甘草苷屬于黃酮類化合物，查耳酮合成酶（CHS）是其合成途徑上的第1 個(gè)關(guān)鍵酶，3 分子的丙二酰輔酶A 和1 分子的香豆酰輔酶A 經(jīng)過(guò)CHS 催化生成查耳酮后，經(jīng)過(guò)查耳酮還原酶（CHR）催化生成異甘草素，再經(jīng)過(guò)查耳酮異構(gòu)酶（CHI）催化生成甘草素，最后經(jīng)過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT的催化生成甘草苷[7-9]。

植物次生代謝產(chǎn)物的主要功能是為了保護(hù)植物免受脅迫的傷害，反之這些脅迫也可用來(lái)誘導(dǎo)次生代謝物的產(chǎn)生。脫落酸（ABA）屬于倍半萜類激素，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起到重要的作用，是植物發(fā)育和脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10-12]。徐鵬等[13]以甘草為材料，以外源鈣葉面噴施濃度、噴施季節(jié)與干旱脅迫程度為因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，檢測(cè)不同處理下的甘草酸與ABA量的變化，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫對(duì)甘草酸和ABA的量均有極顯著的影響，且兩者量之間具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系。此外，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的ABA 脅迫處理甘草可以顯著提高甘草中甘草酸和甘草苷的含量[14-15]。

堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子作為最大的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控家族之一，在植物脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16-17]。Zhong 等[18]從青蒿中克隆得到1 個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子AaABF3，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)AaABF3 在ABA 誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯增高；特別是在青蒿素合成和積累的腺毛中，AaABF3 通過(guò)直接調(diào)控青蒿素生物合成基因ALDH1，在ABA調(diào)控的青蒿素生物合成中發(fā)揮了重要作用。Shi 等[19]從丹參中分離得到一種響應(yīng)ABA 誘導(dǎo)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子SmWRKY34，其對(duì)酚酸和丹參酮具有負(fù)調(diào)控作用；并從SmWRKY34 轉(zhuǎn)錄組中篩選得到顯著表達(dá)的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子SmbZIP3，發(fā)現(xiàn)SmWRKY34 負(fù)調(diào)控SmbZIP3，而SmbZIP3 在酚酸和丹參酮的生物合成中起正向調(diào)控作用，從而得出ABA 信號(hào)可以通過(guò)WRKY34-bZIP3 轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)酚酸和丹參酮的生物合成。有關(guān)bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物生物合成在青蒿、丹參等藥用植物中已有較多研究，但在甘草中的研究還不夠深入。Han 等[20]鑒定得到了66 個(gè)甘草bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因，并對(duì)烏拉爾甘草在ABA、紫外線（UV）、茉莉酸甲酯（MeJA）等非生物脅迫下bZIP 的表達(dá)進(jìn)行了研究，認(rèn)為GubZIP基因在烏拉爾甘草的各種生物學(xué)過(guò)程和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期基于已發(fā)表的甘草全基因組數(shù)據(jù)共鑒定到69 個(gè)甘草bZIP 轉(zhuǎn)錄因子[21]，利用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同濃度ABA 處理的甘草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并結(jié)合qRT-PCR 確定篩選出的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式[22]，成功克隆到轉(zhuǎn)錄因子基因GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33、GubZIP56，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證證明了候選bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以影響甘草活性成分合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響活性成分的積累[23]。

在此基礎(chǔ)上，本研究利用甘草毛狀根體系對(duì)響應(yīng)ABA 的GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，并分析了GubZIPs基因在3年生甘草中的空間表達(dá)差異，基于甘草基因組對(duì)關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析與克隆，通過(guò)探討甘草中GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子與關(guān)鍵酶基因的具體結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步解析響應(yīng)ABA的bZIP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控甘草活性成分生物合成的分子機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 樣品

甘草種子、3 年生甘草植株來(lái)源于甘肅省武威市民勤縣，后將植株移栽于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)地中，經(jīng)藥用植物研究所林余霖研究員鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

1.2 試藥

MS培養(yǎng)基（批號(hào)：MSP09，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；6,7-V 培養(yǎng)基（批號(hào)：DZSL0221，北京欣匯天東方科技有限公司）；乙酰丁香酮（批號(hào)：MC0624，美 國(guó)Novon 公 司）；ABA（批 號(hào)：A8060）、氯化鈉（批號(hào)：S8210）、噻孢霉素（Cef，批號(hào)：C8240）、氨芐青霉素（Amp，批號(hào)：A8180）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；吲哚乙酸（IAA，批號(hào)：I2886）、瓊脂（批號(hào)：A1296）均購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；蛋白胨（批號(hào)：LP0042B）、酵母提取物（批號(hào)：LP0021B）均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒（批號(hào)：DP360）、多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（批號(hào)：DP441）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)：CB101）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript? Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：6210A）、TB Green?Premix ExTaq?（批號(hào)：RR420A）、PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase（批號(hào)：R050Q）、DNA ATailing Kit（批號(hào)：6109）、pMD? 18-T Vector（批號(hào)：6011）均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

2 方法

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染甘草外植體及誘導(dǎo)毛狀根

對(duì)甘草種子進(jìn)行破皮等前處理后，接種至MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。2 周后將組培苗轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀將其胚軸和子葉分離出來(lái)，作為后續(xù)制備外植體的材料。以甘草子葉（切為兩半）為外植體，用發(fā)根農(nóng)桿菌 [吸光度（A）600nm=0.5] 浸染30 min，于6,7-V+乙酰丁香酮（200 mg·L-1）固體培養(yǎng)基上25 ℃黑暗中共培養(yǎng)48～72 h。共培養(yǎng)結(jié)束后，用Cef 溶液（400 mg·L-1）除菌，移入6,7-V 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待毛狀根長(zhǎng)至3.0 cm 左右后將其切下，轉(zhuǎn)入6,7-V+IAA（0.1 mg·L-1）固體培養(yǎng)基上并標(biāo)號(hào)，刺激毛狀根長(zhǎng)出側(cè)根，待長(zhǎng)出大量側(cè)根后轉(zhuǎn)移至液體6,7-V培養(yǎng)基，于120 r·min-1、25 ℃黑暗中搖床培養(yǎng)。

2.2 甘草毛狀根ABA 處理及空間表達(dá)甘草材料前處理

分別用含0、25、50、75 mg·L-1ABA 的6,7-V培養(yǎng)液對(duì)甘草毛狀根進(jìn)行處理，并在3、6、12 h 后從培養(yǎng)瓶中取出毛狀根，用紙巾快速吸干水分后用錫紙包裹，立即放入液氮中冷凍，并將其儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用。

將3 年生甘草從地里取出，除去泥土，用蒸餾水洗過(guò)后快速用紙巾擦干，將植株分為莖、葉、蘆頭、周皮、韌皮部、木質(zhì)部6 個(gè)部分后，用錫紙包裹放進(jìn)液氮速凍，后保存于-80 ℃冰箱備用。以上每份樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.3 qRT-PCR分析

參照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)甘草樣品進(jìn)行RNA 提取，后采用PrimeScript? Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)克隆得到的GubZIPs基因的蛋白編碼區(qū)序列（CDS），以及選取的內(nèi)參actin序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)適合的特異性引物（表1）。反應(yīng)體系參照TB Green Premix ExTaq試劑盒說(shuō)明書(shū)配制：cDNA 1 μL，TB Green Premix ExTaq10 μL，上下游引物（2 μmol·L-1）各2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃，10 s。溶解曲線：以0.5 ℃·s-1從65 ℃線性上升至95 ℃；每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次，在CFX96 Real-time PCR Detection System 中進(jìn)行。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 8.0軟件采用單因素方差分析分析GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)差異并作圖。

表1 甘草GubZIPs基因qRT-PCR檢測(cè)及關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子克隆引物序列

2.4 關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

參考基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，提取3 年生甘草根部的總DNA，凍存于-20 ℃?zhèn)溆?。從美?guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上下載甘草關(guān)鍵酶基因的CDS序列，利用TBtools軟件[24]在甘草基因組[21]中比對(duì)到對(duì)應(yīng)的基因序列號(hào)，提取目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域（CDS 區(qū)前2 kb），通過(guò)PlantCARE 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/PlantCARE/html）[25]預(yù)測(cè)GubZIPs與甘草酸、甘草苷合成途徑結(jié)構(gòu)酶基因HMGR、SQS、β-AS、CYP88D6、CYP72A154、CSyGT、UGT73P12、CHS、CHI的啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)提取的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物（表1），擴(kuò)增甘草關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃，5 min；98 ℃，10 s，60 ℃，15 s，68 ℃，2 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃，10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，連A 尾后與pMD-18T 載體連接，16 ℃反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB（100 mg·L-1Amp）平板上篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆的菌液送測(cè)。將成功克隆的關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子序列提交PlantCARE 網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 外源ABA 脅迫下候選GubZIPs 基因的表達(dá)模式分析

以未用ABA 處理的毛狀根為對(duì)照組，對(duì)4 個(gè)GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子的基因在不同濃度ABA 處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為25、50、75 mg·L-1的ABA 處理后3、6、12 hGubZIP1均有響應(yīng)，且處理組GubZIP1表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，其中在25 mg·L-1ABA 處理12 h 時(shí)的表達(dá)最高，是對(duì)照組的22.7 倍。在25 mg·L-1ABA 處理3、6 h 后GubZIP5的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，12 h 后下降并恢復(fù)至對(duì)照組水平；在50 mg·L-1ABA 處理3 h 后GubZIP5的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，6 h 后表達(dá)量接近對(duì)照組水平，表達(dá)模式為先升高再降低；在75 mg·L-1ABA 處理下GubZIP5無(wú)顯著響應(yīng)。GubZIP33在所有處理組中的表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中在3 個(gè)質(zhì)量濃度的ABA 處理3、6 h 后的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，但在12 h 時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表達(dá)模式為先升高后降低。在25 mg·L-1ABA 處理6 h 時(shí)和50 mg·L-1ABA 處理3 h 時(shí)GubZIP56的表達(dá)量顯著上升，其余處理下GubZIP56的表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。此外，GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因的表達(dá)量均在50 mg·L-1ABA 處理3 h 時(shí)達(dá)到最高值，分別是對(duì)照組的2.5、11.1、4.0 倍。在處理時(shí)間為3 h 時(shí)，GubZIP1基因的表達(dá)量也在50 mg·L-1ABA 處理下達(dá)到峰值。綜上，GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33、GubZIP56均 對(duì)ABA 有響應(yīng)，其中GubZIP1和GubZIP33的響應(yīng)最為顯著。

圖1 甘草毛狀根中GubZIPs響應(yīng)ABA的表達(dá)模式（,n=3）

3.2 GubZIPs基因在甘草不同組織的表達(dá)差異分析

為了分析GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子基因在甘草不同部位的表達(dá)差異，采用qRT-PCR 對(duì)3 年生甘草的莖、葉、蘆頭、周皮、韌皮部、木質(zhì)部6 個(gè)部位的GubZIPs基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖2），GubZIP1和GubZIP5均在根部高水平表達(dá)，其中GubZIP1在蘆頭處的表達(dá)量最高，GubZIP5在韌皮部的表達(dá)量最高，與其他部位相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。GubZIP33和GubZIP56均在葉中高水平表達(dá)，而在其余部位的表達(dá)量顯著低于葉片。其中GubZIP33在莖中的表達(dá)量最低，但和根部的表達(dá)量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GubZIP56在莖、蘆頭、周皮、韌皮部的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在木質(zhì)部的表達(dá)量顯著低于蘆頭和韌皮部。

圖2 GubZIPs在甘草不同組織中的表達(dá)水平（,n=3）

3.3 甘草酸和甘草苷生物合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取甘草基因組中甘草苷合成通路的2個(gè)關(guān)鍵酶基因CHS、CHI和甘草酸合成通路的7 個(gè)關(guān)鍵酶基因HMGR、SQS、β-AS、CYP88D6、CYP72A154、GuCSyGT、UGT73P12的起始 密碼子前2 kb 啟動(dòng)子序列。對(duì)這9 個(gè)關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析整理，其位置信息及響應(yīng)元件信息見(jiàn)圖3。分析結(jié)果顯示，甘草的9個(gè)關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子上含有大量與環(huán)境、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)的作用元件，特別是響應(yīng)激素的元件，如ABA、MeJA、水楊酸（SA）、生長(zhǎng)素（auxin）、赤霉素（GA）的響應(yīng)元件；脅迫反應(yīng)元件，如光脅迫、低溫脅迫及低氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（圖3）。

圖3 甘草基因組中9個(gè)關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子上響應(yīng)激素或其他脅迫的順式作用元件位置

利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），成功擴(kuò)增出CHI、CHS、β-AS的啟動(dòng)子片段，大小分別為1604、1540、1406 bp（圖4）。

圖4 甘草基因組中關(guān)鍵酶基因CHI、CHS、β-AS啟動(dòng)子擴(kuò)增電泳結(jié)果

將測(cè)序獲得的3個(gè)啟動(dòng)子序列提交至PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明β-AS、CHS、CHI基因的啟動(dòng)子區(qū)域除含有基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box 和CAAT-box 外，還含有ABA 響應(yīng)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)順式作用元件ARE，光響應(yīng)元件G-box、Box 4、TCT-motif、GT1-motif 等，以及其他激素響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif、TCA-element等，具體見(jiàn)表2。

表2 克隆得到的甘草酸和甘草苷生物合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件分析

4 討論

轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)或抑制參與1 條或多條生物合成途徑的多個(gè)基因的表達(dá)，是控制生物合成中基因表達(dá)的有力工具[26]。目前，已在甘草中鑒定得到了大量的轉(zhuǎn)錄因子。關(guān)思靜等[27]對(duì)鹽、低磷及干旱脅迫下烏拉爾甘草根轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在3 種脅迫處理下ERF、ARF、bHLH、WRKY 和MYB 等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量均發(fā)生顯著變化。Wang 等[28]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定了鹽脅迫下甘草中的MYB 和bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了類黃酮和三萜類化合物的假定生物合成網(wǎng)絡(luò)。此外，也有研究對(duì)光果甘草和脹果甘草中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了篩選和鑒定[29-30]。甘草中次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑已較為清晰，多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也已得到鑒定，但僅停留在基因家族篩選等生信分析層面，相關(guān)調(diào)控機(jī)制的深入研究尚十分匱乏。

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)及逆境脅迫中起著重要作用，能夠參與植物組織的分化，提高植物對(duì)病害的防御能力，進(jìn)行能量代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還能促使內(nèi)源ABA的合成，從而激活bZIP家族的基因[31-32]。本研究中，在外源ABA 處理下GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因均有顯著響應(yīng)，這基于甘草毛狀根體系驗(yàn)證了ABA 處理植株的檢測(cè)結(jié)果[22]。外 源ABA 處理3 h 時(shí)，GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因的表達(dá)量均在50 mg·L-1ABA 處理下達(dá)到最高值，說(shuō)明用50 mg·L-1ABA 處理3 h 是研究甘草中ABA 相關(guān)通路較為適宜的方案。此外，當(dāng)ABA 質(zhì)量濃度提高到75 mg·L-1時(shí)，GubZIP5和GubZIP56基因均無(wú)顯著響應(yīng)，且表達(dá)量有降低趨勢(shì)；在ABA 處理12 h 時(shí)，GubZIP33基因的表達(dá)量由顯著升高降至初始水平；GubZIP1基因在各質(zhì)量濃度ABA 處理組中雖然表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高，但均在6 h處存在拐點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明GubZIPs基因在甘草中的表達(dá)變化是不同且復(fù)雜的，這可能與甘草中其他轉(zhuǎn)錄因子或者基因密切相關(guān)。本課題組在前期研究中將鑒定到的69 個(gè)甘草bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因與擬南芥AtbZIPs 序列構(gòu)建最大似然（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將甘草bZIP 轉(zhuǎn)錄因子分為A～I(xiàn) 及S 這10 個(gè)亞家族[22]。分析表明GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33 屬于S 亞家族，GubZIP56 屬于H 亞家族。S 亞家族功能廣泛，受ABA、干旱、低溫、無(wú)氧和機(jī)械損傷處理激活，H亞家族主要參與光信號(hào)的感應(yīng)和傳導(dǎo)。這可能也是GubZIP56基因?qū)BA 的響應(yīng)沒(méi)有另外3 個(gè)GubZIPs轉(zhuǎn)錄因子基因敏感的原因。

甘草作為我國(guó)的常用大宗藥材，人工栽培甘草的質(zhì)量并不穩(wěn)定，多數(shù)不符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)[33]。因此，如何提高甘草活性成分含量、生產(chǎn)高品質(zhì)的甘草藥材是目前的主要問(wèn)題[34-35]。有關(guān)調(diào)控甘草酸、甘草苷的機(jī)制研究?jī)?nèi)容已有很多，如從植物激素[36]、功能基因的多態(tài)性[37-41]、藥材性狀[42]出發(fā)考察其與甘草活性成分之間的相關(guān)性，最終歸結(jié)到復(fù)雜的植物次生代謝合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[43]。在GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子基因的空間表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，GubZIP1和GubZIP5基因均在根部高水平表達(dá)，這與甘草活性成分甘草酸、甘草苷的積累一致[44-47]，推測(cè)是其合成通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子。另外2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因GubZIP33和GubZIP56均在葉片處高水平表達(dá)，在其余部位雖有一定的表達(dá)量但顯著低于葉片。而甘草葉片中含有大量的黃酮類化合物，總黃酮含量高于根中[48]，說(shuō)明GubZIP33和GubZIP56對(duì)甘草中黃酮類化合物的合成具有更大的影響。以上表明bZIP 家族中不同的轉(zhuǎn)錄因子在甘草中的主要表達(dá)部位具有差異性，發(fā)揮的功能也不同。

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控次生代謝途徑是一個(gè)復(fù)雜的研究體系。鑒定與次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，對(duì)于理解bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制十分必要。bZIP 蛋白包含1 個(gè)參與DNA 結(jié)合和核定位的堿性區(qū)域，以及1 個(gè)亮氨酸拉鏈二聚結(jié)構(gòu)域[49]，被激活后形成同源或異源二聚體，并通過(guò)其堿性區(qū)域結(jié)合特定基因啟動(dòng)子，進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)[16]。目前已有研究克隆得到甘草酸代謝通路上關(guān)鍵酶基因HMGR、β-AS、CYP88D6、CYP72A154的啟動(dòng)子序列[50-51]，本研究成功克隆出甘草苷合成關(guān)鍵酶基因CHI、CHS及甘草酸合成途徑中第3個(gè)關(guān)鍵限速酶基因β-AS的啟動(dòng)子序列。對(duì)克隆獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CHI基因的啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)G-box 和1 個(gè)A-box 順式作用元件，CHS基因的啟動(dòng)子區(qū)域有2 個(gè)ABRE 和1 個(gè)G-box 順式作用元件，β-AS基因的啟動(dòng)子區(qū)域有1 個(gè)ABRE 和1 個(gè)G-box 順式作用元件。研究表明，植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族通常優(yōu)先結(jié)合ACGT 核心的回文或假回文順式作用元件，如ABRE（CCACGTGG）、G-box（CACGTG）、C-box（GACGTC）及A-box（TACGTA）[16]。因此，GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合甘草苷和甘草酸合成代謝途徑上關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，進(jìn)而調(diào)控其生物合成。

雖然目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GubZIPs 轉(zhuǎn)錄因子與甘草活性成分合成的關(guān)鍵酶基因有密切關(guān)聯(lián)，但是甘草酸、甘草苷的合成受多個(gè)關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)錄因子的作用，其是否真正與GubZIP 轉(zhuǎn)錄因子有相互作用，這些作用是正向調(diào)控還是反向調(diào)控，須結(jié)合GubZIP 轉(zhuǎn)錄因子的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解析。此外，高質(zhì)量基因組是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)[52-53]。由于目前公開(kāi)的甘草基因組只是基因組草圖[21]，本課題組在提取甘草啟動(dòng)子序列時(shí)發(fā)現(xiàn)其中存在大量的簡(jiǎn)并堿基。因此，下一步將對(duì)甘草基因組進(jìn)行重測(cè)序并組裝獲得染色體級(jí)別的甘草基因組，或者采用染色體步移等技術(shù)克隆更多的關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子片段，進(jìn)一步研究GubZIP 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控甘草活性成分合成的機(jī)制，為構(gòu)建甘草活性成分生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。此外，有關(guān)植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的研究仍存在研究物種少、相關(guān)通路少、機(jī)制研究不夠深入等不足之處，已經(jīng)投入實(shí)際生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)基因藥用植物也鮮有報(bào)道，因此還需要后續(xù)深入研究。