申應(yīng)德，鞏長芹，王家芳，丁勃，張新，李學(xué)紅

1.臨沂市檢驗(yàn)檢測中心，山東 臨沂 276000；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101

翻白草是我國的傳統(tǒng)藥材，始載于《救荒本草》，為薔薇科委陵菜屬植物翻白草Potentilla discolorBge.的干燥全草。其味甘、微苦，性平，具有清熱解毒、止痢、止血等功效，常用于濕熱瀉痢、癰腫瘡毒等證[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，翻白草含有黃酮、萜、甾體、鞣質(zhì)及有機(jī)酸等多類化學(xué)成分，具有抗菌、止瀉、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用，且能有效治療2 型糖尿病[3-5]。近年來，隨著翻白草治療糖尿病研究的不斷深入，臨床對其需求不斷增加。但市場上翻白草飲片質(zhì)量參差不齊，甚至存在將委陵菜充當(dāng)翻白草使用的情況，療效難以得到保障[6]。委陵菜為薔薇科委陵菜屬植物委陵菜P.chinensisSer.的干燥全草，與翻白草同科同屬，屬于近緣物種，因其產(chǎn)地、外觀性狀等相似，所以在許多地區(qū)都存在混用現(xiàn)象，存在較大用藥安全隱患。

傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法主要是基于性狀、顯微結(jié)構(gòu)及理化特征。分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展為中藥材鑒定提供了新的思路。目前，比較適用的中藥DNA 分子鑒定方法，如位點(diǎn)特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法、限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCRRFLP）法及DNA 條形碼分子鑒定法均已收錄于《中華人民共和國藥典》2020 年版[7]153-155。DNA 條形碼的概念由Hebert等[8]首次提出，是指利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA 序列進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充，具有操作簡單、重復(fù)性高等特點(diǎn)，尤其適合藥用植物鑒定[7]490-492。2010 年，Chen 等[9]對6000 余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA 條形碼序列篩選，首次提出以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）為核心、psbA-trnH為補(bǔ)充序列的藥用植物條形碼鑒定體系。近年來，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道可以利用ITS2 對中藥材基原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別[10-13]，表現(xiàn)出獨(dú)特的鑒定能力優(yōu)勢，得到了很好的驗(yàn)證。

迄今，已有多位學(xué)者從植物性狀、理化成分對翻白草和委陵菜作了詳細(xì)鑒別，但未見有關(guān)翻白草、委陵菜分子鑒定的報(bào)道[6,14-15]。本研究以翻白草及其常見易混品委陵菜為研究對象，收集翻白草及委陵菜樣品共30 批，基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術(shù)構(gòu)建兩者的分子生物學(xué)鑒定方法，為準(zhǔn)確鑒別翻白草及委陵菜、保障臨床安全用藥提供有效手段。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Mikro 200R 型高速冷凍離心機(jī)（Hettich 公司）；C1000 型PCR 擴(kuò)增儀、Mini-Sub cell GT 型水平電泳儀、Gel DocXR+型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）；NanoDrop 2000 型超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo公司）。

DNeasy Plant Mini Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司）；2×TaqPCR 預(yù)混試劑Ⅱ[天根生化科技（北京）有限公司]；DL1000 DNA Marker（TaKaRa 公司）；ITS2 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 樣品

翻白草對照藥材（FR，批號(hào)：121162-201704）、委陵菜對照藥材（WR，批號(hào)：121021-201803）均購自中國食品藥品檢定研究院；翻白草（編號(hào)1～11）為2021 年山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測抽檢樣品；翻白草（編號(hào)F1～F3）、委陵菜（W1～W14）均為日常收集樣品。樣品經(jīng)臨沂市檢驗(yàn)檢測中心中藥檢驗(yàn)室副主任藥師鞏長芹鑒定，分別為薔薇科委陵菜屬植物翻白草Potentilla discolorBge.的干燥全草、薔薇科委陵菜屬植物委陵菜P.chinensisSer.的干燥全草。

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載翻白草ITS2序列（登錄號(hào)分 別為MH349344.1、KR611768.1、MG730293.1、GQ434650.1、FJ980389.1）、委陵菜ITS2序列（登錄號(hào)分別為MH349339.1、MG730958.1、MH349334.1、KR611747.1、OM180098.1）各5 條，用于序列分析及構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、ITS2基因PCR擴(kuò)增及測序

取樣品約2 g，充分研磨至細(xì)粉。取細(xì)粉約30 mg，按照植物基因組DNA 提取試劑盒操作步驟提取DNA。用NanoDrop 2000 型超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA 濃度，并用滅菌水將其稀釋至10～20 ng·μL-1，作為PCR反應(yīng)模板。

PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括2×PremixTaq12.5 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、模板2 μL，補(bǔ)加滅菌水至25 μL。PCR 擴(kuò)增用引物序列為ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′）、ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃、5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行雙向測序。測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.2 序列分析

應(yīng)用SeqMan軟件去除測序峰圖兩端的低質(zhì)量區(qū)及引物序列，并完成校對和拼接。基于隱馬爾科夫模型的HMMer 注釋方法[16]去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段，獲得ITS2序列。

利用EMBOSS Needle 在線雙序列比對FR、WR的ITS2 序列，比較兩者序列差異。根據(jù)Koetschan等[17]建立的ITS2 數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站預(yù)測ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA X 進(jìn)行多序列比對，計(jì)算翻白草及委陵菜平均鳥嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比，分析種內(nèi)序列變異位點(diǎn)，確定不同的單倍型。相同序列即為同一個(gè)序列類型，任意堿基位點(diǎn)有變異者均分別列為不同的序列類型[18]。選擇K2P（Kimura 2-parameter）模型，計(jì)算種內(nèi)和種間距離，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

結(jié)果表明，所有樣品均成功提取到基因組。測定各樣品在260、280 nm 處的吸光度（A），發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品A260nm/A280nm<1.6，提示DNA 提取過程中存在蛋白質(zhì)污染。

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)樣本PCR 產(chǎn)物均有大小約500 bp 的單一條帶，且條帶較亮，沒有拖尾現(xiàn)象。說明模板中存在的少量蛋白質(zhì)污染并沒有對PCR 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生明顯干擾。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物分次凝膠電泳圖見圖1。

圖1 翻白草與委陵菜樣品PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3.2 FR與WR的ITS2雙序列比對

將FR與WR的ITS2 進(jìn)行雙序列比對，結(jié)果顯示兩者序列長度均為210 bp，但相似性僅為92.9%，有15個(gè)堿基位點(diǎn)存在不同，差異明顯（圖2）。

圖2 FR與WR的ITS2序列雙序列比對

3.3 ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用ITS2 序列在線數(shù)據(jù)庫（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）對FR與WR的ITS2 序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖3。翻白草的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)由1 個(gè)規(guī)整的中心環(huán)（loop）和4 個(gè)螺旋區(qū)（helix）組成，每個(gè)螺旋區(qū)上又有大小不等、數(shù)目各異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。而委陵菜ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心環(huán)并不規(guī)整，存在明顯的3 個(gè)凸起部分，且Ⅳ螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目與翻白草差異明顯。因此，可以通過ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)直觀區(qū)分兩者。

圖3 FR與WR的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)

3.4 ITS2序列變異位點(diǎn)及遺傳距離分析

翻白草ITS2 序列共20 條，平均G+C 占比為63.0%，種內(nèi)K2P 遺傳距離為0～0.009 6，有3 個(gè)單倍型，存在2 個(gè)變異位點(diǎn)，分別為第37 位的C/G 和第163 位的C/T（表1）。委陵菜ITS2 序列共20 條，平均G+C 占比為64.4%，種內(nèi)K2P 遺傳距離為0～0.019 3，有7 個(gè)單倍型，存在5 個(gè)變異位點(diǎn)，分別在第96 位A/C、第156 位C/A、第165 位C/G、第170 位C/T 及第191 位G/A。這說明，翻白草種內(nèi)具有更為保守的ITS2序列，種內(nèi)變異更小。

表1 翻白草及委陵菜種內(nèi)ITS2序列變異分析

翻白草與委陵菜種間K2P 遺傳距離為0.054 8～0.075 8，遠(yuǎn)大于種內(nèi)最大遺傳距離，具有明顯的條形碼間距，說明K2P距離可很好地區(qū)分兩者。

3.5 NJ進(jìn)化樹構(gòu)建

作為DNA 條形碼鑒別序列，既要有足夠的種間變異，可將不同物種區(qū)分開來，同時(shí)又有較小的種內(nèi)變異，可將同一物種聚為一類[19]。從圖4 上看出，翻白草和委陵菜明顯地聚為不同的一支，且各支的支持率bootstrap值較高，可明顯區(qū)別。

圖4 基于ITS2序列構(gòu)建的翻白草及委陵菜NJ樹

4 討論

植物細(xì)胞內(nèi)存在大量的多糖、酚、蛋白質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)與DNA 共沉淀易形成黏稠的膠狀物，影響了DNA 的提取質(zhì)量[20]。本研究采用試劑盒法提取30份樣品的DNA，結(jié)果顯示大多數(shù)樣品DNA 的A260nm/A280nm<1.6。原則上，用于PCR 的DNA模板A260nm/A280nm在1.8～2.0為宜。為了提高模板的質(zhì)量，對DNA 提取過程進(jìn)行了改進(jìn)探索，如增加三氯甲烷去蛋白質(zhì)步驟、延長離心沉淀時(shí)間、改變裂解條件為56 ℃過夜[21]等。這些條件的改變，部分提高了樣品DNA 的濃度，但對純度沒有明顯改善。瓊脂糖凝膠電泳及測序表明，所有樣品均擴(kuò)增出ITS2 序列，低A260nm/A280nm值未對ITS2 序列的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生影響，顯示出該方法具有較好的耐用性。

基于基因序列差異的比較為中藥材鑒定提供了最本質(zhì)的依據(jù)。作為當(dāng)前生物分類學(xué)鑒定研究中的熱門方向，DNA 條形碼技術(shù)在基因水平上對物種標(biāo)記進(jìn)行鑒定，不受植物生長發(fā)育階段、取樣部位及環(huán)境因素的影響，避免了主觀人為的判斷和客觀條件的影響，是對傳統(tǒng)中藥鑒定方法的有效補(bǔ)充[22-24]。植物DNA 條形碼研究經(jīng)歷了大量葉綠體片段（如rbcL、matK、trnH-psbA等）、核糖體基因ITS/ITS2及多種片段組合的篩選驗(yàn)證階段[25]。近年來，Chen等[9]通過對大量藥用植物樣本進(jìn)行深入研究和分析，最終確定將ITS2 作為鑒別藥用植物及其近緣種的標(biāo)準(zhǔn)DNA 條形碼，同時(shí)也推薦葉綠體基因間隔區(qū)片段psbA-trnH作為補(bǔ)充條形碼，這為中藥快速、準(zhǔn)確的鑒定打下了基礎(chǔ)。

本研究以翻白草及其常見易混品委陵菜為研究對象，收集翻白草及委陵菜樣品共30 批，提取樣品的DNA，進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增、測序、拼接，對序列的長度、二級(jí)結(jié)構(gòu)、G+C 占比、序列變異、遺傳距離及分子進(jìn)化樹等進(jìn)行分析，表明基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術(shù)可以準(zhǔn)確鑒別翻白草及委陵菜，為保障臨床安全用藥提供參考。