孔楚楚，柳志誠，葉丹陽，張園園，劉永剛

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029

牻牛兒苗科植物老鸛草Geranium wilfordiiMaxim.是我國傳統(tǒng)中草藥，有祛風(fēng)活血、清熱解毒等作用，還有止瀉痢的功效。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版，將其干燥地上部分作為中藥老鸛草的來源之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，老鸛草煎劑及提取物具有抗菌[1]、抗病毒[2-3]、抗氧化[4-5]、保護(hù)肝腎[6]、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抗腫瘤[8]、降低血糖等生物活性。本研究對老鸛草75%乙醇提取物進(jìn)行分離和鑒定，共得到了17 個化合物，分別鑒定為水楊酸（1）、沒食子酸甲酯（2）、沒食子酸乙酯（3）、1,2,4-苯三酚（4）、原兒茶酸（5）、(6S,9R)-6,9-二羥基-3-酮基-α-香堇醇（6）、短葉蘇木酚酸乙酯（7）、沒食子酸（8）、euphorhirtin G（9）、異柯里拉京（10）、金絲桃苷（11）、槲皮素（12）、煙酰胺（13）、山柰酚（14）、短葉蘇木酚（15）、莽草酸（16）、槲皮素-3-O-(6″-沒食子?；?-β-D-半乳糖苷（17）。包括2個有機(jī)酸類（化合物1、5）、6 個鞣質(zhì)類（化合物2、3、7～9、10）、4 個黃酮類（化合物11、12、14、17）和5 個其他化合物（化合物4、6、13、15、16）?；衔?、4、6、9、10、13、16、17 均為首次從老鸛草中分離出。化合物10、14 在體外實驗中對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有較好的抑制活性。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試藥

老鸛草樣品采自云南省，由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為老鸛草屬牻牛兒苗科植物老鸛草Geranium wilfordiiMaxim.的干燥地上部分。

5-氟尿嘧啶（純度>99%，批號：C13964617，上海麥克林生化科技股份有限公司）；分析純乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇、甲酸、二甲基亞砜（北京化工廠）；CCK-8 試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液、胎牛血清（FBS）、鏈霉素-青霉素雙抗（PS）、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Corning Incorporated公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；氘代試劑（美國Cambridge Isotope Lab）。

1.3 儀器與耗材

BT224S 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；AVANCE NEO 400型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；YXQ-LS-100SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；SW-CJ-2FD（標(biāo)準(zhǔn)型）雙人單面凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）；CK型光學(xué)顯微鏡（美國Olympus公司）；Series Ⅱ型二氧化碳培養(yǎng)箱、Revco PLUS 型-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo 公司）；FC5515R 型高速低溫離心機(jī)（美國Ohaus公司）；柱色譜硅膠、GF254硅膠薄層色譜板（青島海洋化工廠）；96 孔板（美國Corning Incorporated公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

取干燥的老鸛草全草10 kg，用10 倍量70%工業(yè)乙醇加熱回流提取3 次（每次2 h），減壓抽濾后，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去乙醇，濃縮得到老鸛草粗提物浸膏。將浸膏混懸于蒸餾水（4 L）中，用乙酸乙酯萃?。ㄝ腿≡噭┡c水懸浮液比例為1∶1），萃取5 次，合并萃取液，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位約300 g。

乙酸乙酯萃取部位經(jīng)乙酸乙酯及甲醇溶解后，用硅膠300 g 拌樣，通過硅膠柱色譜分離，用石油醚-乙酸乙酯（100∶0→0∶100）系統(tǒng)及乙酸乙酯-甲醇（100∶0→0∶100）系統(tǒng)梯度洗脫，共得到8個組分（A～H）。

將組分A 進(jìn)行二次硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0→0∶100）梯度洗脫，根據(jù)GF254硅膠薄層色譜檢識分成3 個組分（A1～A3），經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜分離并結(jié)合多次重結(jié)晶后，從A3組分中分離得到了化合物1（20 mg）。對組分D 進(jìn)行了二次硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇（100∶1→0∶100）梯度洗脫，得到6 個組分（D1～D6），經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜分離及多次重結(jié)晶后從組分D2中分離得到化合物2（15 mg），從組分D3 中分離得到了化合物3（20 mg）和4（7 mg），從組分D4 中分離得到化合物5（100 mg）和6（7 mg）。將組分E用二氯甲烷-甲醇（100∶3→0∶100）梯度洗脫，得到7 個組分（E1～E7），用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)及二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)多次硅膠柱色譜分離，經(jīng)薄層色譜檢識和多次重結(jié)晶后，從組分E1 中分離得到了化合物7（200 mg）和8（1 g），從組分E4 中分離得到化合物9（9 mg），從組分E7 中分離得到化合物10（200 mg）。同樣對組分F 進(jìn)行二次硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（100：10→0∶100）梯度洗脫，得到7 個組分（F1～F7）。再反復(fù)多次用硅膠柱色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離，同時用GF254硅膠薄層色譜檢識和多次重結(jié)晶，從組分F1 中分離得到了化合物11（1 g），從組分F3 中分離得到化合物12（30 mg），從組分F5 中分離得到化合物13（10 mg），從組分F6 中分離得到化合物14（10 mg）、15（30 mg）和16（9 mg），從組分F7 中分離得到化合物17（200 mg）。

2.2 化合物體外抗腫瘤活性評價

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐內(nèi)將裝于凍存管的HepG2細(xì)胞拿出，轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴鍋內(nèi)，使細(xì)胞迅速解凍，直至凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液不存在固體。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中，配平后于離心機(jī)內(nèi)離心（800 r·min-1，5 min，離心半徑為10 cm），離心結(jié)束后吸出離心管內(nèi)的上清液，管內(nèi)沉淀加入高糖DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% FBS 和1% PS）1 mL，吹打3～4 次，使細(xì)胞重新混懸。將混懸好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基5 mL，慢慢左右搖晃培養(yǎng)皿，吹打均勻使細(xì)胞散布其中，于37 ℃、飽和濕度和5% CO2下培養(yǎng)。

2.2.2 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞生長抑制率 觀察HepG2 細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至占培養(yǎng)瓶底部面積70%～80%時，吸出培養(yǎng)基，用PBS 潤洗2次，消化完全后加入完全培養(yǎng)基1 mL 吹打均勻，制備細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液計數(shù)后以4×103個/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，對照組根據(jù)給藥濃度加入含一定量DMSO（體積分?jǐn)?shù)<0.3%）的培養(yǎng)基，空白組不加入細(xì)胞只加完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將細(xì)胞饑餓24 h，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，24 h 后吸出基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入含相應(yīng)濃度藥物的完全培養(yǎng)基200 μL 繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h 后吸出加藥培養(yǎng)基，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將CCK-8 試劑稀釋10 倍，在96 孔板每孔中加入稀釋后的CCK-8 試劑100 μL。在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1～2 h，用全波長酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm 波長下的吸光度（A），每組設(shè)置3～6 個復(fù)孔。按照公式（1）計算抑制率。

將各化合物的母液用完全培養(yǎng)基稀釋至50、100、150、200 μmol·L-1給藥進(jìn)行初篩。根據(jù)每組給藥組的細(xì)胞抑制率，對每個化合物的給藥濃度進(jìn)行調(diào)整，再次進(jìn)行CCK-8 實驗，并用GraphPad Prism 軟件構(gòu)建曲線計算每個化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS Statistics 20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用（）表示。多組間比較如符合正態(tài)分布且方差齊則用方差分析，不符合正態(tài)分布的采用Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C7H6O3。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.80 (1H,dd,J=7.9,1.8 Hz,H-6),7.47 (1H,ddd,J=8.3,7.2,1.8 Hz,H-3),6.91 (2H,m,H-3,4)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 172.5 (-COOH),161.7 (C-2),136.0 (C-1),117.5 (C-3),130.7 (C-4),113.3 (C-5),119.5 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致，故鑒定化合物1為水楊酸。

化合物2：白色無定型粉末，分子式為C8H8O5。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.13 (3H,s,3,4,5-OH),6.94 (2H,s,H-2,6),3.75 (3H,s,-OCH3)；13CNMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 119.7 (C-1),109.0 (C-2,6),146.0 (C-3,5),138.9 (C-4),166.8 (C-7),52.1 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-11]報道基本一致，故鑒定化合物2為沒食子酸甲酯。

化合物3：白色無定型粉末，分子式為C9H10O5。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.06 (2H,s,H-2,6),4.29 (2H,q,J=7.1 Hz,-OCH2CH3),1.36 (3H,t,J=7.1 Hz,-OCH2CH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 167.2 (-CO-),146.1 (C-3,5),138.3 (C-4),120.3 (C-1),108.6 (C-2,6),60.3 (-OCH2CH3),13.2 (-OCH2CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定化合物3為沒食子酸乙酯。

化合物4：淡黃色粉末，分子式為C6H6O3。1HNMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.28 (2H,m,H-3,5),6.70 (1H,d,J=8.0 Hz,H-6)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 150.4 (C-4),145.2 (C-2),122.0 (C-1),117.6 (C-6),115.4 (C-3,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物4為1,2,4-苯三酚。

化合物5：白色無定型粉末，分子式為C7H6O4。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.44 (2H,m,H-2,6),6.91 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 168.9 (-COOH),150.2 (C-4),144.7 (C-3),122.5 (C-6),121.7 (C-1),116.3 (C-5),114.4 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故鑒定化合物5為原兒茶酸。

化合物6：白色無定型粉末，分子式為C13H20O3。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 5.78 (1H,brs,H-4),5.68 (1H,overlap,H-8),5.66 (1H,overlap,H-7),4.18 (1H,m,H-9),2.36 (1H,d,J=16.8 Hz,H-2a),2.06 (1H,d,J=16.6 Hz,H-2b),1.81 (3H,s,H-13),1.11 (3H,d,J=9.5 Hz,Me-10),0.93 (3H,s,Me-12),0.91 (3H,s,Me-11)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 41.4 (C-1),49.9 (C-2),197.8 (C-3),128.4 (C-4),164.9 (C-5),78.3 (C-6),125.9 (C-7),136.3 (C-8),66.5 (C-9),23.5 (C-10),24.6,24.4 (1-CH3),19.5 (5-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，故鑒定化合物6為 (6S,9R)-6,9-二羥基-3-酮基-α-香堇醇。

化合物7：黃色粉末，分子式為C15H12O8。1HNMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.29 (1H,s,H-7),4.40 (1H,dd,J=7.5 Hz,H-9),2.98 (1H,dd,J=18.7,7.9 Hz,H-10),2.44 (1H,d,J=18.9 Hz,H-10),4.08 (2H,q,J=8.0 Hz,H-2′),1.17 (3H,t,J=8.0 Hz,H-3)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 192.5 (C-11),159.6 (C-8),149.0 (C-6),145.2 (C-2),143.1 (C-4),139.7 (C-5),137.9 (C-3),114.3 (C-3a),112.4 (C-7a),107.4 (C-7),40.1 (C-9),36.4 (C-10),171.5 (C-1′),60.0 (C-2′),13.3 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故鑒定化合物7為短葉蘇木酚酸乙酯。

化合物8：白色無定型粉末，分子式為C7H6O5。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 12.23 (1H,brs,-COOH),9.19 (2H,brs,3,5-OH),8.85 (1H,brs,4-OH),6.96 (2H,s,H-2,6)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 167.9 (-COOH),146.1 (C-3,5),138.9 (C-4),121.2 (C-1),109.4 (C-2,6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致，故鑒定化合物8為3,4,5-三羥基苯甲酸，即沒食子酸。

化合物9：淺黃色無定形粉末，分子式C15H13O8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.49 (1H,s,H-8),5.65 (2H,s,H2-3),4.18 (2H,q,J=7.2 Hz,14-OCH2CH3),3.59 (2H,s,H2-13),1.27 (3H,t,J=7.2 Hz,14-OCH2CH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 170.0 (C-14),162.4 (C-1),160.9 (C-12),149.7 (C-7),142.4 (C-4),139.5 (C-5),138.4 (C-6),113.1 (C-11),112.8 (C-8),111.3 (C-9),110.7 (C-10),67.4 (C-3),61.1 (14-OCH2CH3),31.1 (C-13),13.0 (14-OCH2CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17-18]報道基本一致，故鑒定化合物9為euphorhirtin G。

化合物10：白色無定形粉末，分子式為C27H22O18。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.07 (2H,s,Gal H-2,6),6.71 (1H,s,HHDP H-2),6.68 (1H,s,HHDP H-2′),6.38 (1H,d,J=2.2 Hz,Glc H-1),4.51 (2H,m,Glc H-4,5),4.18 (1H,dd,J=11.0,8.0 Hz,Glc H-6b),4.00 (1H,d,J=2.0 Hz,Glc H-2)；13CNMR (100 MHz,CD3OD)δ: 168.8 (HHDP C′=O),167.2 (HHDP C=O),165.3 (Gal C=O),145.0 (Gal C-3,5),144.7,144.3 (HHDP C-3,5),143.8 (HHDP C-3′),143.9 (HHDP C-5′),139.0 (Gal C-4),136.8 (HHDP C-4′),136.3 (HHDP C-4),124.1 (HHDP C-1),124.1 (HHDP C-1′),119.2 (Gal C-1),115.8 (HHDP C-6′),115.3 (HHDP C-6),109.6 (Gal C-2,6),108.9 (HHDP C-2),107.0 (HHDP C-2′),93.7 (Glc C-1),74.8 (Glc C-5),70.2 (Glc C-3),68.0 (Glc C-2),63.6 (Glc C-4),61.0 (Glc C-6)。根據(jù)6.38 (1H,d,J=2.2 Hz,Glc H-1），J=2.2 Hz 可知應(yīng)為α-苷鍵，且與文獻(xiàn)[19-20]報道基本一致，故鑒定化合物10 為異柯里拉京。

化合物11：黃綠色粉末，分子式為C21H20O12。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 12.64 (1H,s,OH-5),7.68 (1H,dd,J=1.5,8.4 Hz,H-6′),7.53 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),6.82 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.41 (1H,d,J=1.4 Hz,H-8),6.21 (1H,d,J=1.4 Hz,H-6),5.38 (1H,d,J=8.0 Hz,H-1″),4.29～5.47 (5H,d,糖環(huán)上質(zhì)子)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 178.0 (C-4),164.7 (C-7),161.7 (C-5),156.8 (C-9),156.7 (C-2),149.0 (C-4′),145.3 (C-3′),134.0 (C-3),122.5 (C-1′),121.6 (C-6′),116.4 (C-5′),115.7 (C-2′),104.4 (C-10),102.3 (C-1″),99.2 (C-6),94.0 (C-8),76.3 (C-5″),73.7 (C-3″),71.7 (C-2″),68.4 (C-4″),60.6 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定化合物11為金絲桃苷。

化合物12：黃色無定形粉末，分子式為C15H10O7。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 12.49 (1H,s,5-OH),10.78 (1H,s,4′-OH),9.36 (1H,s,3′-OH),7.68 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.54 (1H,dd,J=6.4,2.0 Hz,H-6′),6.88 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.41 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 176.3 (C-4),164.4 (C-7),161.2 (C-5),156.6 (C-9),148.2 (C-4′),147.3 (C-2),145.5 (C-3′),136.2 (C-3),122.2 (C-1′),120.4 (C-6′),116.1 (C-5′),115.4 (C-2′),103.5 (C-10),98.6 (C-6),93.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道基本一致，故鑒定化合物12為槲皮素。

化合物13：白色粉末，分子式為C6H5NO2。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 9.03 (1H,d,J=2.2 Hz,H-6),8.69 (1H,dd,J=5.0,1.6 Hz,H-2),8.29 (1H,dt,J=8.0,1.9 Hz,H-4),7.54 (1H,dd,J=8.0,4.9 Hz,H-3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 168.5 (-COOH),151.5 (C-2),148.1 (C-6),135.9 (C-4),130.0 (C-5),123.7 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道基本一致，故鑒定化合物13為煙酰胺。

化合物14：黃色無定形粉末，分子式為C15H10O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 12.49 (1H,s,5-OH),10.78 (1H,s,3-OH),10.11 (1H,s,4′-OH),9.37 (1H,s,7-OH),8.05 (2H,m,H-2′,6′),6.93 (2H,d,J=8.7 Hz,H-3′,5′),6.45 (1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.20 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 176.4 (C-4),164.4 (C-7),161.2 (C-5),159.7 (C-9),156.7 (C-4′),147.3 (C-2),136.1 (C-3),130.0 (C-2′,6′),122.2 (C-1′),115.9 (C-3′,5′),103.5 (C-10),98.7 (C-6),94.0 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致，故鑒定化合物14為山柰酚。

化合物15：黃色無定型粉末，分子式為C15H10O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.27 (1H,s,H-7),3.17 (2H,t,J=3.8 Hz,H-10)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 145.4 (C-2),140.8 (C-3),115.9 (C-3a),144.7 (C-4),141.9 (C-5),149.8 (C-6),108.4 (C-7),113.6 (C-7a),161.1 (C-8),24.3 (C-9),33.5 (C-10),196.0 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24-25]報道基本一致，故鑒定化合物15為短葉蘇木酚。

化合物16：白色無定型粉末，分子式為C7H10O5。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.57 (1H,d,J=2.6 Hz,H-2),4.20 (1H,brs,H-3),3.83 (1H,dd,J=6.3,4.3 Hz,H-4),3.55 (1H,dd,J=6.2,3.9 Hz,H-5),2.40 (1H,dd,J6e-H,Je,a=18.0 Hz,J5,6e=4.5 Hz),2.02 (1H,dd,J6aHa,e=18.1 Hz,J5,6a=3.7 Hz)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 168.5 (CO),139.3 (C-2),128.8 (C-1),70.8 (C-3),67.3 (C-4),66.0 (C-5),30.4 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報道基本一致，故鑒定化合物16為莽草酸。

化合物17：化合物色粉末，分子式為C28H24O16。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.65 (1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-6′),7.52 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.87 (2H,br s,H-2?,6?),6.82 (1H,d,J=9.0 Hz,H-5′),6.40 (1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=1.8 Hz,H-6),5.36 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),4.12 (1H,dd,J=10.8,7.2 Hz,H-6″),4.04 (1H,dd,J=10.2,5.4 Hz,H-6″),3.73 (2H,dd,J=7.2,5.4 Hz,H-4″,5″),3.61 (1H,dd,J=9.6,7.8 Hz,H-2″),3.45 (1H,dd,J=6.0,3.0 Hz,H-3″)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 177.8 (C-4),165.9 (C-7?),164.6 (C-7),161.7 (C-5),156.9 (C-2),156.8 (C-9),149.0 (C-4′),146.0 (C-3?,5?),145.3 (C-3′),139.0 (C-4?),134.0 (C-3),122.4 (C-1′),121.5 (C-6′),119.5 (C-1?),116.4 (C-2′),115.6 (C-5′),109.0 (C-2?,6?),104.3 (C-10),102.5 (C-1″),99.2 (C-6),94.0 (C-8),73.3 (C-5″),72.8 (C-3″),71.5 (C-2″),68.2 (C-4″),62.5 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27-28]報道基本一致，故鑒定化合物17 為槲皮素-3-O-(6″-沒食子酰基)-β-D-半乳糖苷。

3.2 化合物對HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用

從老鸛草中分離出的化合物對HepG2 細(xì)胞的體外增殖抑制作用見表1，以5-氟尿嘧啶為陽性對照藥，結(jié)果表明，化合物2～4、7、8、10、14、15、17具有明顯的體外抗腫瘤活性（IC50<300 μmol·L-1），其中化合物10 和14 體外抗HepG2 細(xì)胞增殖活性較好，IC50分別為27.95、18.24 μmol·L-1。

表1 老鸛草中分離化合物抗HepG2細(xì)胞增殖的IC50 μmol·L-1

4 討論

本研究從老鸛草的75%乙醇提取物中分離出17個化合物，主要為酚酸類和黃酮類化合物，與文獻(xiàn)[29-31]的研究結(jié)果一致?；衔?、4、6、9、10、13、16、17 均為首次從老鸛草中分離得到，化合物4、6、9、10、13 為首次從老鸛草屬植物中分離得到?；衔?3 也是首次從老鸛草中分離出生物堿類成分，豐富了老鸛草的化學(xué)成分研究。并對這些化合物進(jìn)行了體外抗HepG2 細(xì)胞增殖活性研究，篩選出8 個具有明顯抗腫瘤活性的化合物，為鞣質(zhì)和黃酮類化合物，其中化合物10、14 體外抗HepG2 細(xì)胞增殖活性良好。有文獻(xiàn)報道老鸛草中的鞣質(zhì)可以抑制致癌物苯并芘-7,8-二醇-9,10-環(huán)氧化物（BPDE）的誘變活性，防止細(xì)胞癌變[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)，老鸛草中的黃酮類化合物具有明顯的抗腫瘤活性，能夠顯著抑制多種癌細(xì)胞的生長[33]，因此也有必要對此進(jìn)行更系統(tǒng)和深入的研究。本研究為后續(xù)藥理活性研究及此類藥用植物資源的開發(fā)提供了參考。