李紫玉，周光宏，劉奇菡，王 琳，王 琿，張 婷，葉可萍

?農(nóng)產(chǎn)品加工工程?

基于抗氧化能力的牛血紅蛋白的分步酶解工藝參數(shù)優(yōu)化

李紫玉1，周光宏1，劉奇菡1，王 琳1，王 琿2，張 婷3，葉可萍1※

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；2. 新疆華凌農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司，烏魯木齊 831400；3. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091）

為探究牛血加工利用新技術(shù)，提高牛血蛋白資源利用率。該研究采用分步酶解法提取牛血紅蛋白的抗氧化肽粗提物，從6種蛋白酶中篩選出最適蛋白酶組合，通過單因素試驗優(yōu)化溫度、pH值、料液比、酶添加量和酶解時間，并通過響應(yīng)面設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化酶添加量和酶解時間，得到牛血紅蛋白抗氧化肽粗提物的最佳酶解工藝。結(jié)果表明：牛血紅蛋白分步酶解的最佳工藝為：料液比40 g/L，一次酶解：風(fēng)味蛋白酶添加量3 800 U/g、時間130 min、溫度50 ℃、pH值7.5；二次酶解：堿性蛋白酶添加量2 900 U/g、時間60 min、溫度40 ℃、pH值9.0。此工藝條件下的牛血紅蛋白抗氧化肽粗提物的ABTS自由基清除能力為（333.62±6.29）μmol /g，具有優(yōu)良的抗氧化活性，可作為食源性抗氧化肽的來源。該研究為牛血等副產(chǎn)物的綜合加工利用提供了新思路，同時為食源性抗氧化肽的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

蛋白；抗氧化能力；響應(yīng)面；分步酶解

0 引 言

中國是牛肉生產(chǎn)與消費大國，牛血約占活牛體質(zhì)量的8%，年產(chǎn)量達(dá)50萬t左右[1]。牛血中富含多種蛋白質(zhì)和氨基酸，以及礦物質(zhì)、維生素活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值[2]。然而，牛血的生產(chǎn)研發(fā)過程中仍存在加工技術(shù)落后、產(chǎn)品附加值低等問題，目前牛血主要用于加工血粉等低值產(chǎn)品，甚至作為廢棄物丟棄處理[3-4]，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染。對中國牛血資源進(jìn)行合理利用，變廢為寶，既可以提高牛血利用價值，又能夠緩解中國現(xiàn)存的蛋白資源短缺問題[5-6]。

上世紀(jì)以來，國內(nèi)外對動物血液資源的開發(fā)利用研究逐漸加深。鄭立紅等[7]以豬血為原材料，亞硝酸鈉為發(fā)色劑，制備半干固體亞硝酸鈉血紅蛋白，制備工藝簡便、產(chǎn)品品質(zhì)好，具有較高經(jīng)濟(jì)價值。SORAPUKDEE等[8]對豬、鴨等動物血液的功能特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明血液具有良好的發(fā)泡性和穩(wěn)定性，是天然食品添加劑的潛在來源。此外，相比其他動物和植物源蛋白質(zhì)，血液價格低廉、蛋白含量豐富，且具有潛在的抗氧化活性[9]，是制備抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)來源[10]?？寡趸淖鳛樯锘钚噪闹械囊活?，可以維持機(jī)體內(nèi)自由基平衡，延緩氧化衰老[11]。但目前從動物血液中酶解制備抗氧化肽的研究以雞、鴨等家禽血液為主，從牛血中分離抗氧化肽的研究較少。

酶解法是制備抗氧化肽最常用的方法，具有操作簡便、條件溫和、成本低等優(yōu)點[12]。但研究表明單一酶解法存在水解不徹底、產(chǎn)物抗氧化活性低等問題[13]。近年來，酶解工藝逐漸向多酶復(fù)合酶解或分步酶解的方向發(fā)展，利用不同蛋白酶的酶解特性，提高產(chǎn)物水解度和酶解效率，進(jìn)而提高產(chǎn)物抗氧化活性[14]。同時，分步酶解法不對蛋白酶水解條件做過多要求，減少對蛋白酶種類的限制。CUI等[15]采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步水解乳蛋白濃縮物，得到的酶解產(chǎn)物抗氧化活性優(yōu)于單酶水解；吳雷等[16]采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶依次分步水解，得到的葡萄籽蛋白抗氧化肽，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。

因此，本研究對牛血進(jìn)行分步酶解，篩選最適蛋白酶組合，并探究最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，為進(jìn)一步分離純化食源性抗氧化肽奠定基礎(chǔ)，同時為牛血等屠宰副產(chǎn)物的高值化利用提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

從南京麒靈肉業(yè)有限公司采集3頭新鮮黃牛血液（2022年1月）；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（14 U/mg）、木瓜蛋白酶（10 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硼酸（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；T-AOC測試盒（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，ABTS），南京建成生物工程研究所。

Avanti J-E落地式高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；FE20臺式pH計，瑞士Mettle Toledo公司；AUY120電子天平，日本SHIMADZU公司；Alpha2-4 LSC plus冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Spark多功能酶標(biāo)儀，Tecan Austria公司；Kjeltec8200 FOSS全自動凱氏定氮儀，上海瑞玢有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

收集新鮮血液并加入0.5%的檸檬酸鈉溶液進(jìn)行抗凝處理，4 ℃條件下運送至實驗室，4 000 g離心15 min（4 ℃），收集下層紅細(xì)胞，加入5倍體積生理鹽水洗滌，離心去除上清，重復(fù)洗滌2次，所得牛血紅細(xì)胞凍存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 一次酶解條件優(yōu)化

選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶6種蛋白酶，按照圖1流程水解牛血紅蛋白，參照蛋白酶使用說明書選取酶解溫度和pH值條件，參照文獻(xiàn)研究結(jié)果選取料液比和酶添加量條件[17-18]（具體條件見表1），收集水解0、20、40、60、90、120、180、240、300 min后的酶解產(chǎn)物，測定產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除能力，確定一次酶解的最適蛋白酶種類。

圖1 牛血紅蛋白一次水解流程圖

表1 6種蛋白酶的一次水解條件

1.2.3 二次酶解條件優(yōu)化

選取剩余5種蛋白酶，按照圖2流程水解一次酶解產(chǎn)物，參照蛋白酶使用說明書選取溫度和pH值條件，參照文獻(xiàn)研究結(jié)果選取酶添加量條件[18]（具體條件見表2），收集水解0、30、60、90、120 min后的酶解產(chǎn)物，測定產(chǎn)物水解度和ABTS清除自由基能力，確定二次酶解的最適蛋白酶種類。

圖2 牛血紅蛋白二次水解流程圖

表2 5種蛋白酶的二次水解條件

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，以ABTS自由基清除能力為響應(yīng)值，選取一次酶添加量（）、一次酶解時間（）、二次酶添加量（）、二次酶解時間（）4個因素，進(jìn)行Box-Behnken 試驗設(shè)計（表3）。篩選得出牛血紅蛋白抗氧化肽粗提物的最優(yōu)酶解條件，并對其ABTS自由基清除能力進(jìn)行驗證。

表3 響應(yīng)曲面法因素水平表

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 ABTS自由基清除能力的測定

參照南京建成T-AOC測試盒（ABTS）說明書，計算樣品的ABTS自由基清除能力。

1.3.2 水解度的測定

方法參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用全自動凱氏定氮儀測定酶解液中的總氮含量。取2 mL牛血酶解液，加入1片消化石和5 mL硫酸進(jìn)行消化(溫度達(dá)到420 ℃后消化1 h)。待消化液冷卻后置于全自動凱氏定氮儀，經(jīng)過自動加液、蒸餾、滴定后，記錄最終滴定數(shù)據(jù)。

采用甲醛滴定法測定酶解液中游離氨基的含量[19]。5倍體積稀釋酶解液后，取1 mL稀釋后樣品加入20 mL蒸餾水中，開動磁力攪拌器并將電極輕放于溶液中，用0.01 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值為8.2。加入5 mL已中和的甲醛溶液，繼續(xù)用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定至pH值為9.2，記錄消耗的NaOH溶液體積為1。同時取蒸餾水代替酶解液做空白試驗，記錄消耗的NaOH溶液體積為2。計算酶解液中游離氨基的含量和水解度。游離氨基的含量計算公式如下：

式中為樣品中游離氨基的濃度，μmol/mL；為NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；為酶解液的取用量，mL；5為酶解液稀釋倍數(shù)。

水解度的計算公式為

式中為樣品水解度，%；1為甲醛法測定的酶解液中游離氨基的含量，μmol/mL；2為甲醛法測定的水解前的樣品溶液中游離氨基的含量，μmol/mL；0為凱氏定氮法測定的水解前的樣品溶液中的總氮含量，μmol/mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 8.1軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan’s multiple-range test 進(jìn)行多重比較，顯著性水平< 0.05 表示有顯著差異。試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計。采用graphpad prism 8.0.2進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

水解度是指蛋白質(zhì)水解過程中肽鍵斷裂數(shù)占蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的比例，是衡量蛋白質(zhì)水解與肽段生成情況的重要參考指標(biāo)[20]。ABTS自由基清除能力的測定原理是ABTS在氧化劑作用下生成綠色的ABTS+，而當(dāng)抗氧化物存在時ABTS+生成受到抑制，通過測定反應(yīng)物的吸光度即可計算得出樣品的抗氧化能力[21]。本研究以水解度和ABTS自由基清除能力為參考指標(biāo)，對牛血紅蛋白的酶解效果及抗氧化能力進(jìn)行綜合評價。

2.1 一次酶解蛋白酶篩選

不同蛋白酶分別在其最適條件下對牛血紅蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)果如表4所示，隨著水解時間延長，6種蛋白酶的酶解產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除能力呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，至酶解20min起，風(fēng)味蛋白酶組的抗氧化活性均顯著高于其他組（< 0.05）。因此，后續(xù)試驗選取風(fēng)味蛋白酶對牛血紅蛋白進(jìn)行一次酶解。

表4 6種蛋白酶對牛血紅蛋白一次酶解產(chǎn)物抗氧化效果的影響

注：不同小寫字母表示相同時間下不同蛋白酶之間差異顯著，不同大寫字母表示相同蛋白酶不同時間之間差異顯著（< 0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different proteases at the same time, and different uppercase letters indicate significant differences between the same proteases at different times (< 0.05).

2.2 一次酶解單因素試驗

溫度、pH值、料液比、酶添加量以及時間等條件的變化，均會對牛血紅蛋白酶解產(chǎn)物的水解度及抗氧化能力造成顯著影響，通過單因素試驗優(yōu)化酶解條件，是提高酶解產(chǎn)物抗氧化能力的前提。一次酶解的單因素試驗結(jié)果如圖3所示，隨著酶解溫度升高，牛血紅蛋白酶解產(chǎn)物的水解度及ABTS自由基清除能力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在溫度50 ℃時達(dá)到最大值，分別為37.16%±0.25%和（163.99±2.38）μmol/g（圖3a）。如圖3b所示，pH值對酶解產(chǎn)物抗氧化能力的影響如溫度相似，也呈現(xiàn)由增到減的趨勢。料液比對牛血紅蛋白酶解產(chǎn)物的影響如圖3c所示，隨著料液比的增加，水解度及ABTS自由基清除能力呈先升高后降低，在料液比達(dá)到40 g/L時酶解產(chǎn)物抗氧化能力最強。酶添加量對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響如圖3d所示，隨著酶添加量的升高，水解度及ABTS自由基清除能力呈先上升后趨于平緩的趨勢，當(dāng)酶添加量大于4 000 U/g后，牛血紅蛋白酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力不再顯著升高（> 0.05），故選擇酶添加量4 000 U/g作為最優(yōu)條件。此外，隨著酶解時間延長，酶解產(chǎn)物抗氧化活性與酶添加量試驗結(jié)果趨勢一致，當(dāng)酶解時間大于120 min時，ABTS自由基清除能力不再顯著升高（> 0.05）（圖 3e）。綜合以上結(jié)果，確定牛血紅蛋白一次酶解的最佳工藝條件為：溫度50 ℃、pH值7.5、料液比40 g/L、酶添加量4 000 U/g、酶解時間120 min。

注：固定酶解條件為：溫度50 ℃、pH值7.5、料液比40 g·L-1、酶添加量2 000 U·g-1、酶解時間120 min。探究溫度（40、45、50、55、60 ℃）、pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、料液比（30、40、50、60、70 g·L-1）、酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U·g-1）和酶解時間（60、120、180、240、300 min）對一次酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力和水解度的影響。不同大寫字母代表ABTS自由基清除能力差異顯著，不同小寫字母代表水解度差異顯著（P < 0.05）。

2.3 二次酶解蛋白酶篩選

利用牛血紅蛋白一次酶解產(chǎn)物，進(jìn)一步通過二次酶解提高產(chǎn)物的抗氧化活性，試驗結(jié)果如表5所示，二次酶解過程中，堿性蛋白酶處理組的水解度和ABTS自由基清除能力隨著酶解時間的延長呈先升高后下降的趨勢，在酶解時間為60 min時達(dá)到最高值，顯著高于其他蛋白酶組（< 0.05），因此，選取堿性蛋白酶作為二次酶解的最佳蛋白酶。

表5 5種蛋白酶對牛血紅蛋白二次酶解產(chǎn)物抗氧化效果的影響

注：不同小寫字母表示相同時間下不同蛋白酶之間差異顯著，不同大寫字母表示相同蛋白酶不同時間之間差異顯著（< 0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different proteases at the same time, and different uppercase letters indicate significant differences between the same proteases at different times (< 0.05).

2.4 二次酶解單因素試驗

牛血紅蛋白二次酶解的單因素試驗結(jié)果如圖4所示。隨著酶解溫度的升高，二次酶解產(chǎn)物的水解度及ABTS自由基清除能力呈先增后減的趨勢，在溫度40 ℃時達(dá)到最高值（圖4a）。pH值對牛血紅蛋白二次酶解產(chǎn)物的影響如圖4b所示，隨著pH值的增加水解度及ABTS自由基清除能力呈先升高后降低，在pH值為9.0時，酶解產(chǎn)物的抗氧化能力達(dá)到最高值，此后，酶解產(chǎn)物的抗氧化能力逐漸下降，在pH值為10.0時，其水解度達(dá)到最高值。這是由于酶解反應(yīng)過程中pH值的變化會直接影響蛋白酶和底物的解離，進(jìn)而影響酶解產(chǎn)物的肽段生成情況與抗氧化活性[22]。如圖4c所示，酶添加量對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響與pH相似，呈先增后減的趨勢，酶添加量為3 000 U/g時，ABTS自由基清除能力達(dá)到最高值為（319.69±1.92）μmol/g。此外隨著酶解時間的延長，產(chǎn)物的抗氧化能力先升高后降低，且在60 min時達(dá)到最高值（圖4d）。綜合以上結(jié)果，確定牛血紅蛋白的二次酶解最佳工藝條件為：溫度40 ℃、pH值9.0、酶添加量3 000 U/g、酶解時間60 min。

注：固定酶解條件為：40 ℃、pH值10.5、酶添加量2 000 U·g-1、時間60 min。探究溫度（30、35、40、45、50 ℃）、pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U·g-1）和酶解時間（0、30、60、90、120 min）對二次酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力和水解度的影響。不同大寫字母代表ABTS自由基清除能力差異顯著，不同小寫字母代表水解度差異顯著（P < 0.05）。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，選取一次酶添加量（）、一次酶解時間（）、二次酶添加量（）、二次酶解時間（）四個因素為自變量，以ABTS自由基清除能力作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計的原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果如表6、表7和圖5所示。牛血紅蛋白酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力回歸模型方程為

=328.96-22.681+20.921-12.621+5.531-

2.9811-22.6311-17.4411+11.7811-

25.0311-22.6111-49.2612-46.4512-

26.5012-44.6712（3）

回歸模型具有極顯著性差異（< 0.000 1），失擬項=0.387 6 > 0.05（不顯著），該模型較為可靠，可用于預(yù)測最優(yōu)酶解條件。

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析，得到分步酶解牛血紅蛋白的最佳條件為：一次酶添加量3 780.57 U/g、一次酶解時間131.48 min、二次酶添加量2 860.22 U/g、二次酶解時間62.61 min，ABTS自由基清除能力的預(yù)測值為334.65 μmol/g。考慮到實際可操作性，將酶解條件優(yōu)化為：一次酶添加量3 800 U/g、一次酶解時間130 min、二次酶添加量2 900 U/g、二次酶解時間60 min，并進(jìn)行驗證試驗，測得產(chǎn)物ABTS自由基清除能力為（333.62±6.29）μmol/g，相對誤差小于1%，說明得到的擬合優(yōu)化條件可靠。

表6 Box-Behnken 試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表7 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

注：*表示差異顯著（< 0.05）；**表示差異極顯著（< 0.01）。

Note: * indicates significance at 0.05 level; ** indicates significance at 0.01 level.

圖5 各因素交互作用的曲面圖和等高線圖

3 討 論

隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，血液等屠宰加工副產(chǎn)物產(chǎn)量大幅增加，對其進(jìn)行高值化加工利用，既可有效提高經(jīng)濟(jì)效益，減少資源浪費，又可防止環(huán)境污染，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展[23]。本研究通過分步酶解法制備牛血抗氧化肽粗提物，制備工藝簡便且易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，將其用于食品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域，既可實現(xiàn)牛血的高值化利用，又將極大程度上滿足目前日益增長的對功能性產(chǎn)品的需求。

研究表明，動物血液中含有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等多種生物酶，抗氧化能力較強，因此可作為提取抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)蛋白源[24]。王爽等[25]研究表明驢血經(jīng)過木瓜蛋白酶酶解后得到的酶解產(chǎn)物，具有良好的DPPH自由基清除能力。ZHAN等[26]采用堿性蛋白酶水解豬血漿得到抗氧化肽粗提物，其對ABTS自由基的清除率達(dá)93.24%±0.86%。本研究中牛血酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力為（333.623±6.29）μmol/g，高于鄭錦曉等[27]制備的金華火腿抗氧化肽（285.39±6.04）μmol/g，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。這是由于相比其他蛋白，在血液中多種活性物質(zhì)的影響下，血液酶解產(chǎn)物具有更強的抗氧化能力[28]。

酶解法是改變蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)蛋白質(zhì)的功能多元化、提高其利用價值的有效途徑之一[29]。其中通過蛋白酶解工藝獲得具有強抗氧化能力的酶解產(chǎn)物，成為近年來國內(nèi)外廣泛研究的重點。在本研究過程中，采用風(fēng)味-堿性蛋白酶組合分步水解牛血，酶解產(chǎn)物的水解度及ABTS自由基清除能力最強。周亞迪等[30]采用風(fēng)味-堿性蛋白酶水解制備得到的豬血漿酶解產(chǎn)物，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，與本研究研究結(jié)果一致。這是由于在蛋白酶作用下，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，相互作用力減弱，肽鍵發(fā)生斷裂，生成具有不同氨基酸組成及功能活性的肽鏈[31-32]。此外，肽段的抗氧化活性受到蛋白酶種類、分子量及氨基酸組成等多種因素的影響。本研究所采用的風(fēng)味蛋白酶是一種由肽酶和真菌蛋白酶組成的復(fù)合體，同時具有內(nèi)切和外切蛋白酶兩種活性，可以作用于蛋白酶的多個酶切位點，提高產(chǎn)物水解度[33]。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，其特異性作用位點廣泛，可對酶解產(chǎn)物中的小分子蛋白進(jìn)一步水解，提高產(chǎn)物的水解度及抗氧化能力[34]。在雙酶相互作用下，牛血紅蛋白釋放出具有抗氧化活性的肽段，并暴露出更多的芳香族氨基酸和疏水氨基酸，使得產(chǎn)物抗氧化能力進(jìn)一步提高[35]。

4 結(jié) 論

本研究確定牛紅細(xì)胞分步酶解最佳組合為風(fēng)味-堿性蛋白酶，并得到最佳工藝條件為：料液比40 g/L，一次酶解：風(fēng)味蛋白酶添加量3 800 U/g、時間130 min、溫度50 ℃、pH值7.5；二次酶解：堿性蛋白酶添加量2 900 U/g、時間60 min、溫度40 ℃、pH值9.0。經(jīng)驗證，此研究工藝下制備的牛血紅蛋白抗氧化肽粗提物對ABTS自由基的清除能力為（333.623±6.29）μmol/g，具有較強的抗氧化活性，可用于進(jìn)一步分離純化抗氧化肽。該研究為牛血等蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供了技術(shù)參考，同時為開發(fā)食源性抗氧化肽奠定理論基礎(chǔ)。

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Optimization of the process parameters for the two-step-hydrolysis of bovine hemoglobin based on the antioxidant capacity

LI Ziyu1, ZHOU Guanghong1, LIU Qihan1, WANG Lin1, WANG Hui2, ZHANG Ting3, YE Keping1※

(1.,,,210095,; 2..,.,831400,; 3.,,830091,)

Bovine blood is one of the main by-products of bovine slaughtering and processing. The preparation and antioxidant activity of bovine blood peptides has been investigated systematically to promote their high-end value in industrial utilization. Taking the bovine hemoglobin (BH) as the raw material, this study aims to prepare the BH antioxidant peptide crude product using two-step hydrolysis. The reference indexes were taken as the hydrolysis degree and the ABTS·free radical scavenging ability. Six proteases were also employed for the hydrolysis to identify and select the optimal protease. Specifically, a systematic evaluation was made to investigate the effect of different solid-liquid ratios, enzyme concentration, reaction temperature, pH value, and reaction time on the initial hydrolysate, including antioxidant activity using ABTS·free radical scavenging. The remaining five proteases were used to further hydrolyze the first BH hydrolysate, where the optimal protease was selected for the single-factor test. Furthermore, the influencing parameters were assessed during enzymolysis on the antioxidant capacity of the bovine hemoglobin second hydrolysate. The results showed that: 1) The best effect was found in the first enzymatic hydrolysis of flavorzyme among the six proteases. The highest hydrolysis degree and the ABTS·scavenging ability were also observed in the first BH hydrolysate (<0.05); 2) The BH was hydrolyzed at pH value is 7.5 and 50 ℃ for 120 min, when the solid-liquid ratio and flavorzyme content were 40 g/L and 4 000 U/g, respectively, indicating the highest antioxidant capacity of the first hydrolysate; 3) The alcalase demonstrated the best second enzymatic hydrolysis effect; 4) The BH first hydrolysate was hydrolyzed (pH values are 9.0; 40 ℃; 60 min), when the concentration of alcalase was 3 000 U/g. While the hydrolysis degree (46.06%±0.08%) and ABTS free radical scavenging ability (314.15±1.09) μmol TE/g protein) of the second hydrolysate were significantly higher than other protease groups (<0.05). The single-factor test show that the enzyme concentration and reaction time were further optimized using the response surface method (RSM), with the ABTS free radical scavenging ability as the response value. Furthermore, the regression equation was obtained after RSM optimization, indicating the enzyme concentration and reaction time on the antioxidant capacity of the BH hydrolysate. The optimal parameters were achieved to prepare the BH antioxidant peptide crude product with the solid-liquid ratio of 40 g/L. The first enzymatic hydrolysis included: Amount of flavorzyme is 3 800 U/g, enzymatic hydrolysis time is 130 min, temperature is 50 ℃, and pH value is 7.5, while the second enzymatic hydrolysis process included: Amount of alcalase is 2 900 U/g, time is 60 min, temperature is 40℃, and pH value is 9.0. The ABTS free radical scavenging ability was achieved at (333.62±6.29) μmol TE/g protein, indicating excellent scavenging capacity and antioxidant activity. A systemic and effective procedure was obtained to extract the food-derived antioxidant peptides. The finding can provide new insight into the comprehensive processing and utilization of by-products, not limited to the bovine blood. A theoretical basis was also offered for the research and development of food-derived antioxidant peptides.

protein; antioxidant capacity; response surface; two-step-hydrolysis

2022-12-12

2023-04-08

新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目（2021A02003-4）

李紫玉，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。Email：2549305697@qq.com

葉可萍，博士，教授，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。Email：yekeping.arc@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.202212086

S21；TS251.93

A

1002-6819(2023)-08-0259-09

李紫玉，周光宏，劉奇菡，等. 基于抗氧化能力的牛血紅蛋白的分步酶解工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2023，39(8)：259-267. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202212086 http://www.tcsae.org

LI Ziyu, ZHOU Guanghong, LIU Qihan, et al. Optimization of the process parameters for the two-step-hydrolysis of bovine hemoglobin based on the antioxidant capacity[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(8): 259-267. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202212086 http://www.tcsae.org