李鵬 劉銳濤 譚西北 張穎 劉崇懷

摘要：葡萄在生長發(fā)育過程中易遭受多種病原菌的侵染，影響果實品質(zhì)和產(chǎn)量，制約葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。生產(chǎn)中多采用殺菌劑對病原菌進行防治，增加了投資成本，且會對環(huán)境造成污染，因此培育高品質(zhì)抗病品種對葡萄生產(chǎn)具有重要意義。葡萄抗病性為多基因控制的數(shù)量性狀，QTL 定位是研究數(shù)量性狀的一種有效方法，遺傳圖譜的構(gòu)建是檢測QTLs和克隆基因的基礎(chǔ)。多年來，研究人員通過構(gòu)建遺傳圖譜鑒定了一系列霜霉病、白粉病、皮爾斯病等抗性遺傳位點，同時，根據(jù)抗性位點的基因組區(qū)域，開發(fā)了多個連鎖標記，并應(yīng)用到葡萄抗病性遺傳研究中，加速了葡萄的育種進程。對葡萄遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和抗病相關(guān)QTL定位研究進展進行了綜述，分析了目前研究中存在的問題并提出建議，為今后葡萄抗病基因定位和分子標記輔助選擇育種提供借鑒。

關(guān)鍵詞：葡萄；遺傳圖譜；抗?。籕TL定位

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1245-10

葡萄是多年生落葉藤本植物，果實風味濃郁，營養(yǎng)價值高，既可鮮食，也可加工成各種產(chǎn)品，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中發(fā)揮著重要作用。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO，2020）統(tǒng)計，中國葡萄產(chǎn)量達1 476.9 萬t，居世界第一位。葡萄生長過程中各種生物或非生物脅迫對產(chǎn)量有著較大影響，由病原菌引起的生物脅迫是非常嚴重的危害因子[1]。目前葡萄生產(chǎn)上對病原菌治理主要是藥劑防治，不僅增加栽培成本，更危害環(huán)境及食品安全[2]，培育抗病品種有利于葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。葡萄具有童期長、雜合度高等特點，使用常規(guī)育種耗時長、效率低，通過分子標記輔助選擇育種（molecular marker assistant selection，MAS）技術(shù)能提高定向育種效率，加速育種進程[3]。

構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（genetic linkage map），進行數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）定位，建立標記與表型之間的連鎖關(guān)系，是實施分子標記輔助育種的有效途徑[4]。自Lodhi 等[5]基于隨機擴增多態(tài)性DNA 標記（random amplified polymorphicDNA，RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性標記（amplifiedfragment length polymorphism，AFLP）構(gòu)建了第一張葡萄遺傳圖譜以來，世界上已經(jīng)發(fā)布了160 多張葡萄遺傳圖譜[6]，其中約40 張與葡萄抗病性有關(guān)。以遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，研究人員已對多個葡萄抗病相關(guān)位點進行定位，并開發(fā)了連鎖標記，部分已經(jīng)應(yīng)用于育種中[7]。筆者在本文中對葡萄遺傳圖譜構(gòu)建與抗病QTL定位的研究進展進行綜述，為葡萄抗病性定位相關(guān)研究和分子標記輔助選擇育種提供借鑒和參考。

1 葡萄遺傳圖譜的構(gòu)建

構(gòu)建高密度遺傳圖譜是進行基因定位、分子標記輔助育種，以及圖位克隆的基礎(chǔ)[8]。構(gòu)建遺傳圖譜主要包括選擇合適的作圖群體、采用多態(tài)性分子標記以及根據(jù)重組率利用相關(guān)作圖軟件計算分子標記間的連鎖排序和遺傳距離。

作圖群體的選擇是構(gòu)建遺傳圖譜的前提。目前F1群體、F2群體、BC 群體、DH群體、RIL 群體（重組自交系）等作圖群體在QTL 定位研究中均有使用[3，9]。但葡萄童期長、純合與雜合位點共存、遺傳背景復雜等問題難以獲得高世代群體。針對這一問題，Weeden 等[10]提出了著名的“雙假測交”理論，即將F1雜交群體視為與隱性親本測交得到的回交一代（BC1）群體。當F1群體出現(xiàn)分離重組，其分離重組發(fā)生在親本所特有遺傳標記位點，則將其中一個親本的雜合位點看作是另一個親本的隱性純合，后代群體1∶1 分離，則相當于“測交”；若分離重組位于兩親本共有的標記位點，則將兩親本都視為雜合位點，如若是共顯性標記，后代群體分離比為1∶2∶1，若是顯性標記后代，分離比則為3∶1。基于此理論，葡萄常用于構(gòu)建遺傳圖譜的群體類型主要為雜交F1代，少數(shù)為回交群體、自交群體。葡萄F1代雜交群體雖易于構(gòu)建，可以縮短定位群體建立周期，但該群體屬于暫時分離群體僅能使用一次，遺傳背景復雜容易造成定位偏差[9]。

分子標記由于變異豐富、穩(wěn)定、不受環(huán)境影響等因素成為葡萄遺傳圖譜研究的有效手段。早期葡萄遺傳圖譜主要采用RAPD和AFLP分子標記進行構(gòu)建。1995 年Lodhi 等[5]利用Cayuga White × Aurore的F1群體，結(jié)合RAPD和AFLP 等標記構(gòu)建2 張遺傳圖譜，其中Cayuga White 構(gòu)成的遺傳圖譜包含214 個標記，全長為1196 cM；Aurore 構(gòu)成的遺傳圖譜包含225 個標記，全長為1477 cM。這兩種標記可以快速構(gòu)建圖譜，但構(gòu)建的不同葡萄品種的遺傳圖譜之間無法比較[11]，局限性較大。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，簡單序列重復標記（simple sequence repeat，SSR）因共顯性、高度多態(tài)性，在不同葡萄品種間具有較高的通用性，成為構(gòu)建遺傳圖譜使用頻率最高的標記。葡萄第一套SSR 標記（共371 個）由葡萄微衛(wèi)星聯(lián)盟（Vitis Microsatellite Consortium，VMC）開發(fā)[11]。Riaz 等[12] 利用Riesling × CabernetSauvignon 雜交群體結(jié)合152 個SSR標記（主要來自VMC）構(gòu)建了第一張葡萄SSR 遺傳圖譜，該圖譜總長為1728 cM，標記間平均距離為11.0 cM。DiGaspero 等[13]開發(fā)了另外兩組基于微衛(wèi)星的標記（169 個VVI 和108 個UDV）。Adam-Blondon 等[14]以Syrah × Grenache 的F1 群體為材料，利用220 個SSR 標記（包含123 個VVI 標記）構(gòu)建了總長度為1 406.1 cM、標記平均距離為6.4 cM 的遺傳圖譜。

為了提高SSR 標記構(gòu)建圖譜的飽和度、通用性和實用性，Doligez 等[15]將5 個遺傳群體整合得到一張含515 個標記（502 個SSR 標記）的遺傳圖譜，該圖譜總長度為1647 cM，標記間平均距離為3 cM。此圖譜是基于SSR 標記最為完整的圖譜之一。但SSR標記數(shù)量有限[16]，遺傳圖譜密度和精度受限，無法對性狀相關(guān)的候選基因進行有效定位[11]。伴隨著測序技術(shù)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNP）標記越來越多地被應(yīng)用在遺傳圖譜構(gòu)建上。相較之前的標記，SNP 在基因組均勻分布，多態(tài)性好，可以避免圖譜標記密度偏小的問題，顯著提高精細定位程度[6，17]。全基因組測序（whole genome sequencing）、簡化基因組測序（reduced- representation genome sequencing，RRGS）和SNP-array 是開發(fā)SNP 標記的主要高通量測序技術(shù)。Sapkota 等[1]用Norton × Cabernet Sauvignon 的159 個F1單株為作圖群體，結(jié)合1665 個SNP 標記和407個SSR標記獲得抗霜霉病遺傳圖譜。Sun等[18]利用Red Globe × Muscat Hamburg 的95 個F1群體，結(jié)合27 454 個SNP標記，構(gòu)成覆蓋長度為1 442.64 cM的遺傳圖譜。Su 等[19]利用Zhuosexiang × Victoria 的F1 代群體，采用6249 個SNP 構(gòu)建的抗白腐病整合圖譜大小為3 118.13 cM，平均標記密度是0.5 cM。

最近，一種基于擴增子測序（AmpSeq）的新型高效分子標記應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建。Karn 等[20]利用Horizon × Illinois 547-1 的F1 群體，構(gòu)建一張包含1171 個Ampseq 標記、覆蓋總長度為1 082.16 cM的圖譜。Reshef 等[21]利用V. rupestris B38 × Horizon的雜交群體，構(gòu)建一張包含1944 個Ampseq標記、總長度范圍為1 050.7 cM的遺傳圖譜。葡萄主要圖譜的基本情況見表1。從表1 可以看出，國內(nèi)外對葡萄遺傳圖譜研究中作圖群體數(shù)量大多在100 株以上；標記類型從最初的AFLP 標記到大規(guī)模測序開發(fā)SNP標記，不斷向前發(fā)展；遺傳圖譜標記數(shù)目和密度不斷增加，使得標記之間的平均距離從12.7 cM 降至0.28 cM。

構(gòu)建遺傳圖譜需將分子標記分配到不同的連鎖群，每個連鎖群內(nèi)根據(jù)重組率對標記進行排序并估計遺傳距離。目前常用的構(gòu)圖軟件有JoinMap、Mapmaker 和TMAP等[6，44]。但同一作圖軟件不會包含所有分離類型，不同軟件構(gòu)建的遺傳圖譜也存在差異，應(yīng)根據(jù)實際情況進行選擇。

2 抗病性狀QTL定位

2.1 葡萄霜霉病抗性QTL定位

葡萄霜霉病作為全球性真菌性病害，抗性位點研究最多。Merdinoglu等[22]利用Syrah×28-8-78的F1分離群體進行抗霜霉病QTL分析，首次在28-8-78的12 號染色體上鑒定到一個主效QTLRpv1（Resistanceto Plasmopara viticola 1），該位點能夠解釋73%的表型變異，與其緊密連鎖的標記為VVIb32。來源于圓葉葡萄的Rpv1 抗性基因已被克隆并進行了功能驗證。Rpv1 是核苷酸結(jié)合/富含亮氨酸重復（nucleotidebinding/leucine-rich repeat，NB-LRR）受體，參與病原菌的識別和植物防御的信號轉(zhuǎn)導[45- 46]。

Welter等[26]利用Regent ×Lemberge的F1代群體通過4年霜霉病抗性鑒定，最終在18 號染色體中得到1 個主效QTLRpv3，該位點解釋了37.3%表型差異，富含TIR-NBS-LRR基因，并在不同群體的研究中得到進一步驗證[22，47]。含有Rpv3 位點的葡萄植株葉片在受到霜霉病侵染時，霜霉病菌絲體生長受限，新生孢子囊和孢子囊數(shù)量減少[48-49]。Marguerit 等[3]通過CabernetSauvignon × Gloire De Montpellie 的F1子代霜霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)在9和12號染色體存在2個抗性位點Rpv5 和Rpv6，其中Rpv5 緊密連鎖的標記VVIO52；Rpv6 是第二個定位在12 號染色體上抗性位點。Bellin 等[47]使用Chardonnay × Bianca 群體通過多種霜霉病表型鑒定方法，發(fā)現(xiàn)Bianca 的7 號染色體上存在抗性位點Rpv7，該位點解釋的表型變異率為12.7%。Blasi 等[32]使用雌雄同株山葡萄品種（V. amurensis‘Ruprecht）自交后代，通過5種抗性評價體系，在14 號染色體上發(fā)現(xiàn)抗性位點Rpv8，該位點解釋的表型變異率高達86.3%。Schwander等[33]將Rpv10 定位在9 號連鎖群，并將其范圍精確定位到2.1 cM，大小為314 kb。研究還發(fā)現(xiàn)該區(qū)域包含8 個核苷酸結(jié)合/富含亮氨酸重復（nucleotide binding/leucine-rich repeat，NBS-LRR）類型的RGA。隨后越來越多的抗霜霉病位點被挖掘，目前，在4、5、6、7、8、9、10、12、14、17和18號染色體上共定位到28個抗性主效或微效QTL（表2），解釋的表型變異率從3.5%到86.3%。這些QTL 抗性位點來源于不同的葡萄品種。Rpv1 和Rpv2 來源于圓葉葡萄（Muscadinia rotundifolia）；Rpv3、Rpv19 和Rpv28 來源于沙地葡萄（V. rupestris）；Rpv4、Rpv7、Rpv11、Rpv17、Rpv18、Rpv20 和Rpv21 來源于北美種群但未確定品種；Rpv5、Rpv6、Rpv9 和Rpv13 來源于河岸葡萄（V. riparia）；Rpv8、Rpv10、Rpv12、Rpv22、Rpv23、Rpv24、Rpv25 和Rpv26來源于山葡萄（V. amurensis）；Rpv14來源于甜冬葡萄（V. cinerea）; Rpv27 來源于夏葡萄（V. aestivalis）。這表明利用優(yōu)異的種質(zhì)資源去挖掘更豐富的優(yōu)異變異，是尋找葡萄抗病基因的重要途徑。

2.2 葡萄白粉病抗性QTL定位

葡萄白粉病是由致病菌Erysiphe necator [synonymUncinula necator （Schw.） Burr.]引起的真菌性病害，可引起葉片褪綠，覆蓋白色粉層進而導致葉片卷曲、枯萎等癥狀。同葡萄霜霉病一樣，葡萄白粉病抗性位點較多（表3），命名為Run（Resistance to Uncinulanecator）或Ren（Resistance to Erysiphe necator）。Barker 等[59]首次將抗白粉病Run1 定位在圓葉葡萄的12 號染色體上，而歐亞種不攜帶該基因。目前以圓葉葡萄和歐亞種葡萄的BC5為材料，已經(jīng)獲得與Run1 基因連鎖的分子標記[60]。Hoffmann 等[53]將Ren1 抗性位點定位于Nimrang 的LG13 上的VMC9H4-2、VMCNG4E10-1 和UDV-020 附近，該區(qū)域包含多個NBS-LRR基因。在中國野生群體利用中，Pap 等[35]在中國野生葡萄變?nèi)~葡萄V. piasezkii（Dvit2027）中發(fā)現(xiàn)了2 個抗白粉病的QTL位點Ren6和Ren7，分別位于第9 和第19 染色體上。目前白粉病抗性位點在2（Ren10）、9（Ren6）、12（Run1）、13（Ren1）、14（Ren2，Ren5）、15（Ren3，Ren9）、18（Run2.1、Run2.2、Ren4、Ren8）、19（Ren7）號染色體上鑒定出來（表3）解釋的表型變異率從14%到76%。

2.3 其他病害抗性QTL定位

其他葡萄病害，如皮爾斯病、冠癭病、黑腐病、炭疽病、白腐病等，對葡萄也有較大危害，但QTL定位研究相對較少。在抗皮爾斯病的QTL 研究中，Krivanek 等[61]首先將抗皮爾斯病Pdr1（Pierces diseaseresistance 1）定位于14 號染色體上；隨后Riaz等[62]通過精細定位將抗皮爾斯病的主效QTL定位到14 號染色體VVIn64 和UDV095 標記附近。在抗冠癭病QTL 定位方面，Kuczmog 等[63]將Rcg1（Resistanceto Crown gall 1）定位在抗冠癭病親本Kunbarát（V. amurensis）的15 號染色體上，緊密連鎖標記9M3-3 距Rcg1 位點576 kb 遠。關(guān)于黑腐病QTL 研究較少，Rex 等[34]將黑腐病2 個抗性位點Rgb1（Resistanceto Guignardia bidwellii 1）和Rgb2 分別定位在14 號和16 號染色體上。近年來，部分科技人員對葡萄抗炭疽病進行QTL定位，高曉銘等[64]利用里扎馬特×黑珍珠雜交F1代群體，在12 號染色體檢測到解釋表型變異率37.07%、貢獻率為71.50%的抗炭疽病主效QTL。Fu 等[40]對Cabernet Sauvignon × ShuangHong 雜交群體進行了連續(xù)3 年抗炭疽病鑒定，在14 號染色體發(fā)現(xiàn)抗性位點Rgr1（Resistance toColletotrichum 1），此區(qū)間包含了11 個NBS-LRR 基因。2021 年，Su 等[19]利用Zhuosexiang × Victoria 雜交群體在14 號染色體上定位到一個抗葡萄白腐病QTL，并預(yù)測了7個可能抗白腐病的候選基因。這些定位結(jié)果為分子標記在育種中的使用奠定了基礎(chǔ)。

3 問題及展望

構(gòu)建遺傳圖譜和開發(fā)目標性狀緊密連鎖的分子標記，對MAS育種效率的提升具有重要意義。近年來，葡萄遺傳圖譜的構(gòu)建發(fā)展較快，獲得一些成果，但仍存在問題。許多葡萄遺傳圖譜使用RFLP、AFLP、RAPD、SSR 等第一代和第二代標記構(gòu)建，導致圖譜標記密度較低，各連鎖群標記間距較大，標記在基因組分布不均勻，無法有效定位候選基因。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，SNP標記已經(jīng)用來構(gòu)建高密度遺傳圖譜，提高了圖譜的飽和度并顯著提高精細定位程度。但SNP 在不同種群間通用性較低[6]，在將來應(yīng)考慮構(gòu)建多種標記整合的圖譜，提高圖譜的飽和性與通用性。分子標記輔助選擇是將分子標記應(yīng)用于葡萄品種改良過程中進行選擇的一種輔助手段，主要包括對目標性狀的前景選擇和對遺傳背景的背景選擇。目前葡萄分子標記輔助育種仍以SSR標記為主，但SSR分子標記通性低、費時，而SNP標記適合高通量、自動化檢測，可能成為未來首選的標記系統(tǒng)[6]。然而SNP 分子標記在葡萄MAS中的實際應(yīng)用仍然較少[37，65]，因此應(yīng)加大對性狀關(guān)聯(lián)SNP標記的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。

葡萄抗病性作為一個復雜的數(shù)量性狀，受到較多基因的調(diào)控，且基因之間還存在著互作效應(yīng)，遺傳機制非常復雜。雖然已有許多針對抗病性狀的QTL定位研究，但由于抗病性狀往往受到多個QTL控制，且影響群體QTL 檢測的因素很多，如環(huán)境因素、群體大小及分子標記連鎖圖譜的飽和度等[6]。

另外葡萄定位常使用群體數(shù)量較小的初級作圖群體F1，容易造成定位誤差。因此，將來在研究中應(yīng)構(gòu)建群體數(shù)量較大的F2、BC（回交群體）等群體，消除遺傳背景對QTL定位產(chǎn)生的不利影響[9]，提高QTL檢測靈敏度和定位精度。隨后通過這些位點解析抗病性狀的遺傳和分子機制，挖掘葡萄抗病優(yōu)良基因，為葡萄抗病育種奠定基礎(chǔ)。另外葡萄抗病定位研究主要集中在霜霉病和白粉病，而對我國危害較大的灰霉病和黑痘病尚未見報道，應(yīng)加大對這些病害的解析。

葡萄多個圖譜以及病害抗性QTL 位點已經(jīng)發(fā)表，但這些實驗數(shù)據(jù)（基因型、表型）和位點信息未儲存在公共數(shù)據(jù)庫，極大限制了圖譜的整合以及定位信息的有效利用。作為模式作物水稻，其表型和圖譜信息以及QTL 相關(guān)數(shù)據(jù)可以在Gramene 數(shù)據(jù)庫進行檢索，促進了QTL 位點利用和候選基因的挖掘[66]。因此未來應(yīng)構(gòu)建可以共享的葡萄的QTL定位數(shù)據(jù)庫，以提高QTL數(shù)據(jù)的利用與挖掘。

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