陳彤 鐘名琴 邱永為 何玉榆 黃婷

摘 ?要：本研究基于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高精密度檢測飼料中聚醚類抗生素的方法，并對所建立的方法進行了方法學的考察與驗證，參考已有的標準，對標準的相關處理步驟進行優(yōu)化，采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標準曲線相關系數(shù)分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，方法檢出限分別為3.58 μg/kg、2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，回收率范圍為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對標準偏差為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。所得結果表明，該方法具有檢出限低、回收率較好、精準度高、重復性好的優(yōu)點，可以為檢測飼料中聚醚類抗生素提供有力的方法支撐。

關鍵詞：聚醚類抗生素；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；精密度；回收率

中圖分類號：S859.84 文獻標志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-0769（2023）03-0070-04

聚醚類抗生素（polyether antibiotics，PEs）是20世紀70年代發(fā)展起來的一類具有離子載體性質(zhì)的抗生素，由鏈霉菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生，包括莫能菌素、馬杜霉素、鹽霉素和甲基鹽霉素等，是一類被廣泛應用于畜禽飼養(yǎng)行業(yè)中的廣譜抗球蟲藥和促生長劑[1-3]。從化學結構上看，此類藥物分子含有若干環(huán)狀醚鍵，分子一側帶有羧基，故而容易與Na+、K+等離子結合形成多種金屬鹽，不溶于水，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等有機溶劑，且在堿性或中性條件下穩(wěn)定存在。它們能與球蟲細胞中的陽離子緊密結合，改變細胞膜上脂質(zhì)屏障的滲透性，增加向球蟲細胞內(nèi)運輸離子，為了平衡滲透壓，大量水分進入球蟲細胞內(nèi)，導致球蟲腫脹而死亡，因此也被稱為離子載體類抗球蟲藥[4]。其對球蟲子孢子第一代、第二代裂殖子有抑殺作用，同時又能有效促進動物的生長，提高畜禽產(chǎn)品的飼料利用率，提高養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益，故被廣泛添加于飼料中。但是，聚醚類抗生素本身在毒理學上屬于高毒或劇毒物質(zhì)，具有較強的細胞毒性，因此藥物的安全范圍非常窄。過量使用聚醚類抗生素容易導致其在動物產(chǎn)品中殘留，并通過食物鏈在人體中蓄積，會嚴重危害人體健康。因此，研究聚醚類藥物在飼料中殘留量的檢測技術，對保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全有著重要的意義[5-6]。

如今，聚醚類抗生素的殘留分析方法主要包括微生物檢測法、免疫學法、分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-9]。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性優(yōu)點相結合，不但對樣本的前處理要求低，而且可以同時測定多種藥物殘留；該方法抗干擾能力強，靈敏度高，既可以完成對藥物的定性，又可以達到定量的效果，減少了測定的時間，提高了檢測質(zhì)量，是一種非常優(yōu)秀的測定多種聚醚類抗生素的方法。

本研究以農(nóng)業(yè)部1862號公告-4-2012《飼料中5種聚醚類藥物的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》為基礎，在保證檢測結果準確可靠的前提下，優(yōu)化了前處理的操作，并使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對飼料中的馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素以及甲基鹽霉素進行定性定量檢測，提高了檢測效率，為聚醚類藥物的檢測提供有力的技術支持[10]。

1 ?材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀，AB Science質(zhì)譜儀，氮吹儀，漩渦混合儀，電子天平，冷凍離心機，超純水儀，超聲波清洗機，硅膠固相萃取柱（500 mg/3 mL）。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），正己烷，乙醚，二氯甲烷，甲酸（色譜純）。

1.2 樣本制備

用四分法稱取適量飼料，經(jīng)粉碎過40目孔篩，混勻后裝入磨口瓶中備用。

1.3 標準工作液的配制

準確稱取馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標準品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標準儲備液，－20 ℃保存?zhèn)溆?，有效?2個月；分別移取適量的4種1 000 μg/mL的聚醚類標準儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標準液，－20 ℃保存?zhèn)溆?，有效?個月；再移取100 μg/mL混合標準液稀釋為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 μg/mL的混合標準工作液。

1.4 樣本前處理

準確稱取試樣2.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加5 mL乙腈，渦旋10 min，超聲提取20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一個50 mL離心管。殘渣用5 mL乙腈重復提取一次，合并兩次上清液，取全部上清液于15 mL離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入3 mL正己烷溶解殘渣，渦旋45 s，備用。

取硅膠固相萃取柱，加5 mL正已烷預洗，將備用液過柱，加乙醚-正己烷（體積比1∶1）10 mL，洗滌，抽干，加二氯甲烷-甲醇（體積比9∶1）5 mL洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮氣吹干，用乙腈（含0.1％甲酸）1.0 mL溶解殘渣，渦旋45 s后過0.22 μm濾膜，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatograph mass spectrometer / mass spectrometer，LC-MS/MS）分析。

2 ?結果與討論

2.1 標準曲線

按照農(nóng)業(yè)部1862號公告-4-2012標準設置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標準樣本溶液（10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100 μg/kg、400 μg/kg），待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對該系列標準樣本溶液進行測定，繪制標準曲線，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素及甲基鹽霉素相關系數(shù)分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，具體見表1。

2.2 方法檢出限確定

以空白飼料樣本為基質(zhì)，做7個平行添加試驗，聚醚類藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）的陽性添加濃度均為10.0 μg/kg，按照1.4方法進行前處理，然后上機測定，測得馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的方法檢出限（method detection limit，MDL）分別為3.58 μg/kg、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，具體見表1。計算公式如下：

方法檢出限（μg/kg）＝k·Sb·C/X

式中k取3；Sb為平行測試樣含量的標準偏差；C為加標濃度（μg/kg）；X為平行測試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白飼料樣本為基質(zhì)，向飼料樣本中添加聚醚類藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）濃度水平分別為10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、100 μg/kg進行加標回收試驗。按照方法進行前處理，上機測試，結果如表2和表3所示。

根據(jù)表2與表3中相對標準偏差和回收率結果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標準偏差較低，且回收率較好，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的回收率范圍分別為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對標準偏差分別為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。該方法的檢出限較低、重復性較好，并且能保持較為理想的回收率，可用于馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的定性、定量檢測。

3 ?結論

本研究旨在建立一種飼料中聚醚類抗生素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的簡便測定方法，為相關行業(yè)檢測工作提供該類藥物的檢測方法及技術支持。結果表明，此方法前處理簡單，精密度高而且穩(wěn)定性好，較大地提高了實驗整體的效率，適用于飼料中馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素殘留量的定性、定量檢測。

參考文獻

[1] 張睿，劉妤，金麗瓊，等．不同凈化方式在聚醚類抗生素殘留檢測中應用[J]．食品與發(fā)酵科技，2020，56（1）：116-119.

[2] 畢言鋒，徐倩，王樹槐，等．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的4種聚醚類抗球蟲藥物殘留[J]． 分析試驗室，2009，4（7）：14-21.

[3] 薄海波，雒麗麗，曹彥忠，等．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中6種聚醚類抗生素殘留量[J]．分析化學，2009，16（8）：1161-1166.

[4] 劉素梅，張發(fā)旺，方忠意．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中5種聚醚類抗球蟲藥的含量[J]． 中國飼料，2009，1（17）：30-32.

[5] 丁燕玲，劉國華，吳雯娟，等．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶粉中聚醚類抗生素殘留[J]．廣東化工，2020，47（19）：160-162.

[6] 陳明，耿志明，王冉，等．飼料中聚醚類抗生素的柱后衍生同時測定方法研究[J]．中國飼料，2005，30（20）：27-28，31.

[7] 楊露，譚會澤，劉松柏，等．禽飼料中5種聚醚類抗球蟲藥物檢測方法研究[J]．糧食與飼料工業(yè)，2021，22（1）：59-61.

[8] 賈濤．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞用飼料中聚醚類藥的方法研究[J]．飼料廣角，2016，23（2）：12-15.

[9] 劉佳佳，佘永新，劉洪斌，等．聚醚類抗生素殘留檢測技術及其研究進展[J]．食品工業(yè)科技，2011，32（8）：440-444，448.

[10] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部．飼料中5種聚醚類藥物的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.