曾強(qiáng) 張宇 陳輝 石珂 周麗

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是主要肺癌類型[1-2]。富含亮氨酸的α-2糖蛋白1(leucine-rich-alpha2-glycoprotein 1,LRG1)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖和血管生成[3],促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲和黏附[4],并可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[5]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(runt-related transcription factor 1,RUNX1)具有明顯致癌活性[6],可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖[7],下調(diào)RUNX1可顯著誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞DNA損傷和凋亡[8],骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是RUNX1的下游靶點(diǎn),RUNX1可直接結(jié)合OPN啟動(dòng)子,上調(diào)其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[9],作為與多種類型的癌癥進(jìn)展、生長(zhǎng)、遷移、侵襲和血管生成相關(guān)的關(guān)鍵因子[10],在NSCLC細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),也是其患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物,而敲除OPN可降低NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲力[11],LRG1可通過(guò)誘導(dǎo)RUNX1的表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖[12],因而預(yù)測(cè)LRG1可能通過(guò)RUNX1/OPN信號(hào)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本文通過(guò)體外培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。

材料與方法

一、材料

NCI-H838細(xì)胞、NCI-H1650細(xì)胞、DMEM高糖(含丙酮酸鈉、谷氨酰胺,含雙抗)培養(yǎng)基(SNM-002D)購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司;人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(CP-H209)、A549細(xì)胞(CL-0016)、Ham’s F-12K培養(yǎng)基(PM150910)、人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-H209)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;LRG1 siRNA(序列信息:LRG1 siRNA-1-F:5′-CCGGGCAATTAGAACGGCTACATCTGGATCCAGATGTAGCCGTTCTAATTGCTTTTTG-3′,R:5′-AATTCAAAAAGCAATTAGAACGGCTACATCTGGATCCAGATGTAGCCGTTCTAATTGC-3′;LRG1 siRNA-2-F:5′-CCGGCAGCCGACACCGTGCACCTGGGGATCCCCAGGTGCACGGTGTCGGCTGTTTTTG,R:5′-AATTCAAAAACAGCCGACACCGTGCACCTGGGGATCCCCAGGTGCACGGTGTCGGCTG-3′)、RUNX1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(序列信息:F:5′-CCGGAATTCATGCGTATCCCCGTAG-3′,R:5′-CCGCTCGAGGTAGGGCCTCCACACG-3′)、空載質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司; EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、0.1%結(jié)晶紫水溶液、ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、兔抗人E-cadherin一抗、兔抗人β-tubulin一抗、兔抗人N-cadherin一抗、兔抗人caspase-3一抗、兔抗人GAPDH一抗、兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人LRG1一抗、兔抗人OPN一抗、兔抗人RUNX1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司等。PT-3502C全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自北京普天新橋技術(shù)有限公司;NIB900-FL科研級(jí)倒置熒光顯微鏡、NIB400實(shí)驗(yàn)室級(jí)倒置生物顯微鏡購(gòu)自上海悌可光電科技有限公司;ForeQuant F4/F6qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)美谷分子公司;CC-SC雙垂直電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-11B電泳儀購(gòu)自南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所等。

二、方法

1.各細(xì)胞中LRG1、RUNX1與OPN表達(dá)檢測(cè):qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用39.7 ℃水浴快速凍融購(gòu)買的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基)與人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549(含10%血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基)、NCI-H838(含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)、NCI-H1650(含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基),復(fù)蘇培養(yǎng)后收集傳代后的各種細(xì)胞,以高效RIPA裂解液提出其中總蛋白后測(cè)出其濃度,根據(jù)測(cè)量結(jié)果每組取含20 μg總蛋白的樣品液,于100 ℃沸水中煮沸變性、跑電泳、濕轉(zhuǎn),使于膠中分離開的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,分別截下含有目的蛋白LRG1、RUNX1、OPN、GAPDH,孵育脫脂牛奶封閉后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),接著滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯色,攝取各蛋白條帶圖像,運(yùn)用Image J軟件分析得到各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

以Trizol提取收集的上述4種傳代細(xì)胞總RNA,使用一步法反轉(zhuǎn)錄qRT-PCR試劑盒并參照其說(shuō)明書指導(dǎo)做實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法做分析,得出LRG1、RUNX1與OPN mRNA相對(duì)表達(dá),實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。GAPDH為內(nèi)參,各基因引物序列:LRG1上游引物:5′-GTTGGAGACCTTGCCACCT-3′,下游引物:5′-GCTTGTTGCCGTTCAGGA-3′;GAPDH上游引物:5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′,下游引物:5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′;RUNX1上游引物:5′-CTGCCCATCGCTTTCAAGGT-3′,下游引物:5′-GCCGAGTAGTTTTCATCATTGCC-3′;OPN上游引物:5′-TTGCAGTGATTTGCTTTTGC-3′,下游引物:5′-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3′。

2.分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞及收集標(biāo)本:取無(wú)菌的12孔板,接種傳代的A549細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)24小時(shí),隨機(jī)分為對(duì)照組、LRG1敲低組、陰性對(duì)照組、RUNX1過(guò)表達(dá)組、LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組,使用脂質(zhì)體2000分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,LRG1敲低組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA,陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒,RUNX1過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA陰性對(duì)照和RUNX1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA和RUNX1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集各組細(xì)胞作標(biāo)本備用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

3.各組細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN表達(dá)檢測(cè):取出1.2.2中收集的各組細(xì)胞,采用qRT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其中LRG1、RUNX1、OPN mRNA與蛋白表達(dá),具體方法步驟按照1.2.1進(jìn)行。

4.各組細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè):以EdU染色檢測(cè)各組細(xì)胞增殖:取無(wú)菌的12孔板,接種傳代的A549細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)24小時(shí),遵照1.2.2中方法步驟分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,24小時(shí)后加入適量EdU試劑繼續(xù)培養(yǎng),12小時(shí)后清洗、固定細(xì)胞,參照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明指導(dǎo)于熒光顯微鏡下進(jìn)行染色后觀察,每孔任選3個(gè)視野攝取圖像,細(xì)胞計(jì)數(shù)后計(jì)算各組細(xì)胞EdU陽(yáng)性率=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

5.流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡:取1.2.2中收集的各組細(xì)胞,以PBS緩沖液清洗后,加入1 ml PBS緩沖液重懸計(jì)數(shù),每組取5×106個(gè)細(xì)胞,離心后加入PBS緩沖液及ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒中的ANNEXIN V- FITC、PI,避光反應(yīng)15分鐘后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

6.各組細(xì)胞遷移侵襲檢測(cè):劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移:取無(wú)菌的12孔板,接種傳代的A549細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)24小時(shí),遵照1.2.2中方法步驟分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,24小時(shí)后在每孔中央劃一條直線,洗去劃痕中細(xì)胞后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照,所得圖像采用Image Pro Plus軟件測(cè)量劃痕寬度L0,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后再次于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、測(cè)量劃痕寬度L1,計(jì)算各組細(xì)胞遷移率=L0-L1/L0×100%。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲:取1.2.2中收集的各組細(xì)胞,以PBS緩沖液清洗后,加入1 ml不含血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù),取無(wú)菌的Transwell培養(yǎng)板以基底膠包被后于上室中接種1.2.2中5×105個(gè)/ml的各組細(xì)胞,同時(shí)于下室加適量含血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基,無(wú)菌培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí),以棉簽清除上室細(xì)胞后清洗、固定下室細(xì)胞,加入0.1%結(jié)晶紫水溶液沒(méi)過(guò)細(xì)胞,染色5分鐘后清洗,于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,計(jì)數(shù)所得圖像中各組細(xì)胞。

7.檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá):取出1.2.2中收集的各組細(xì)胞,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其中Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá),具體方法步驟按照1.2.1中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞與人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1、RUNX1與OPN表達(dá):與人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞相比,人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 免疫印跡檢測(cè)各細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN蛋白表達(dá)

表1 各細(xì)胞中LRG1、RUNX1與OPN mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=6)

2.各組A549細(xì)胞中LRG1、RUNX1與OPN表達(dá)檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比,LRG1敲低組細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞LRG1 mRNA與蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞LRG1 mRNA與蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),RUNX1與OPN mRNA與蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

注:A:對(duì)照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對(duì)照組;D:RUNX1過(guò)表達(dá)組;E:LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組

表2 各組A549細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=6)

3.各組A549細(xì)胞增殖與凋亡情況檢測(cè)結(jié)果比較:與對(duì)照組[(41.26±3.89)%、(7.43±0.95)%]相比,LRG1敲低組EdU陽(yáng)性率[(10.02±1.67)%]降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率[(51.82±11.46)%]升高(P<0.05);RUNX1過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性率[(78.16±8.01)%]升高(P<0.05),細(xì)胞凋亡率[(1.13±0.28)%]降低(P<0.05);陰性對(duì)照組EdU陽(yáng)性率[(42.93±4.32)%]與細(xì)胞凋亡率[(7.54±0.71)%]均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性率[(38.14±4.10)%]升高(P<0.05),細(xì)胞凋亡率[(9.17±2.20)%]降低(P<0.05)。見圖3。

注:A:對(duì)照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對(duì)照組;D:RUNX1過(guò)表達(dá)組;E:LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組

4.各組A549細(xì)胞遷移與侵襲情況檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組[(75.12±7.03)%、(191.57±32.62)個(gè)]相比,LRG1敲低組細(xì)胞遷移率[(29.78±4.59)%]與侵襲數(shù)[(65.24±8.39)個(gè)]均降低(P<0.05),RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移率[(96.67±10.12)%]與侵襲數(shù)[(316.35±40.63)個(gè)]均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率[(76.31±12.45)%]與侵襲數(shù)[(197.20±36.12)個(gè)]均無(wú)明顯差異(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移率[(68.25±9.04)%]與侵襲數(shù)[(178.95±30.48)個(gè)]均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:A:對(duì)照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對(duì)照組;D:RUNX1過(guò)表達(dá)組;E:LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組

5.各組A549細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)結(jié)果比較:與對(duì)照組相比,LRG1敲低組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)降低,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)升高;RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)升高,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組細(xì)胞Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05);與LRG1敲低組相比,LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)升高,caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表3。

注:A:對(duì)照組;B:LRG1敲低組;C:陰性對(duì)照組;D:RUNX1過(guò)表達(dá)組;E:LRG1敲低+RUNX1過(guò)表達(dá)組

表3 各組A549細(xì)胞Bcl-2、caspase-3、Bax、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=6)

討論

NSCLC病人生存期有所延長(zhǎng),但因病情的反復(fù)復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,每年死于NSCLC的病患數(shù)還是越來(lái)越多[13-14]。LRG1具有顯著致癌作用的癌基因,在包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤中表達(dá)顯著增加[3,15],敲除LRG1基因可降低胰腺癌細(xì)胞活力,抑制其遷移、侵襲和血管生成[16]。有研究顯示,LRG1可誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞增殖,促進(jìn)其遷移、侵襲和血管生成,靶向LRG1在NSCLC治療中具有潛在的應(yīng)用前景[5],結(jié)果顯示,相比正常人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中LRG1表達(dá)升高,轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA可降低A549細(xì)胞EdU陽(yáng)性率、遷移率、侵襲數(shù)、細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達(dá)、細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá),升高其凋亡率、細(xì)胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá),表明LRG1介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程,敲低LRG1可抑制其增殖、遷移和侵襲,對(duì)NSCLC起到顯著的抗癌功效。

RUNX1/OPN信號(hào)在腫瘤成瘤性、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,RUNX1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后不良密切相關(guān)[17],而OPN是調(diào)控多種腫瘤間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[18]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RUNX1過(guò)表達(dá)質(zhì)?？缮逜549細(xì)胞EdU陽(yáng)性率、遷移率、侵襲數(shù)、細(xì)胞LRG1、RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達(dá)、細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá),降低其凋亡率、細(xì)胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá),表明上調(diào)RUNX1表達(dá)可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,且LRG1可促進(jìn)RUNX1表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡,因而推測(cè)下調(diào)RUNX1/OPN通路表達(dá)可能是敲低LRG1降低NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的分子機(jī)制,結(jié)果顯示,RUNX1與OPN在人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H838、NCI-H1650中高表達(dá),轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA敲低LRG1可降低A549細(xì)胞RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達(dá),表明RUNX1/OPN信號(hào)參與介導(dǎo)LRG1對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程,敲低LRG1同時(shí)過(guò)表達(dá)RUNX1,相比只敲低LRG1,可升高A549細(xì)胞EdU陽(yáng)性率、遷移率、侵襲數(shù)、細(xì)胞RUNX1與OPN mRNA及蛋白表達(dá)、細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá),降低其凋亡率、細(xì)胞caspase-3、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá),表明過(guò)表達(dá)RUNX1可減弱敲低LRG1對(duì)NSCLC細(xì)胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化、增殖、遷移和侵襲的抑制作用,逆轉(zhuǎn)其抗癌功效,揭示LRG1是通過(guò)RUNX1/OPN軸調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的。

綜上所述,敲低LRG1可下調(diào)RUNX1與OPN的表達(dá),減弱NSCLC細(xì)胞增殖及間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化,降低其遷移和侵襲能力,并誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞大量凋亡,起到顯著的抗癌功能,下調(diào)RUNX1/OPN通路是其分子機(jī)制之一,本研究有助于全面深入闡釋NSCLC發(fā)病機(jī)制,為其臨床治療提供了新的有應(yīng)用前景的作用靶點(diǎn)。