李進(jìn)軍 趙 晨 王輅 李端華
關(guān)鍵詞:苯丙氨酸脫氫酶;純化;開放實驗;教學(xué)設(shè)計與實踐
苯丙氨酸脫氫酶(Phenylalanine Dehydrogenase,PheDH)可以催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸。苯丙氨酸脫氫酶異常會導(dǎo)致苯丙氨酸代謝紊亂,進(jìn)而引發(fā)苯丙酮尿癥等疾病。苯丙氨酸脫氫酶在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,如苯丙酮尿癥的診斷、治療和預(yù)防[1]以及高價值氨基酸和藥物類多肽等的合成[2]。
苯丙氨酸脫氫酶是本課題組研究較為深入的酶類。其中,李進(jìn)軍等[3]用雙水相方法純化苯丙氨酸脫氫酶,提供了一種簡便、有效、綠色的純化策略,收率和純度都達(dá)到了較高水平;夏羽行等[4]在雙水相純化的基礎(chǔ)上用離子純化得到高純度酶,并研究了酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)內(nèi)容。
在生源方面,成都大學(xué)藥學(xué)院本科生生源較好,錄取分?jǐn)?shù)在重本以上,有較好的學(xué)習(xí)能力且有極大可能繼續(xù)升學(xué)研究,即使是本科畢業(yè)直接工作,也有必要開設(shè)開放實驗課程,不僅能培養(yǎng)學(xué)生的大局觀,使其了解本科所學(xué)知識在一個項目層級中扮演的角色,還能讓學(xué)生在找工作時提前錨定自己的興趣點,避免盲目選擇。
本開放實驗的特點在于脫胎于整個實際項目并合理簡化,以實現(xiàn)本科層次的教學(xué)目的,旨在培養(yǎng)學(xué)生的項目觀念,為學(xué)生完成畢業(yè)設(shè)計、本科畢業(yè)后工作以及繼續(xù)深造奠定基礎(chǔ)。
1 實驗設(shè)計
1.1 實驗?zāi)康?/p>
了解整個項目的內(nèi)容和流程,熟悉搖床發(fā)酵、超聲破壁、雙水相提取、手動裝柱和純化、高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography,HPLC)分析和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析等實驗操作步驟,系統(tǒng)訓(xùn)練學(xué)生搜尋文獻(xiàn)、設(shè)計實驗內(nèi)容、分析實驗數(shù)據(jù)、撰寫報告等方面的能力。
1.2 課程安排
課程具體安排如表1所示,課程設(shè)計按照內(nèi)容邏輯安排,實操時可根據(jù)實際情況拆分。
1.3 儀器與試劑
高效液相色譜儀(E2695型,Waters公司;LC-2010A,日本島津公司);微孔板分光光度計(Epoch,Biotek公司);電泳儀(Bio-Rad公司);超聲破碎儀(JYD-650L,上海之信儀器公司);半制備液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司);多通道蠕動泵(保定雷弗);冷凍離心機(jī)(J-26XP,美國BECKMAN公司);數(shù)顯恒溫振蕩器(SHA-B,常州澳華儀器公司);制冰機(jī)(IMS-20,常熟市雪科電器有限公司)。
酵母浸粉、胰蛋白胨(OXOID公司);IPTG、Bradford試劑及氨芐西林(生工生物工程公司);苯丙氨酸;PEG 4000、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、EDTA、β-巰基乙醇(科龍化學(xué)試劑公司);NAD+、NADH(Amersco公司);Q-FFSepharose(GE公司);色譜甲醇、色譜乙腈(Swell);其他化學(xué)試劑均為分析純,水為去離子水。
2 課程實踐
2.1 文獻(xiàn)查閱及方案設(shè)計
(1)指導(dǎo)學(xué)生使用學(xué)校數(shù)據(jù)庫,并鼓勵學(xué)生通過校外途徑獲取更多文獻(xiàn)資源;(2)培養(yǎng)學(xué)生提取關(guān)鍵詞的能力,如本實驗中的“苯丙氨酸脫氫酶”“離子柱純化”“雙水相萃取”以及“柱效測定”等;(3)教會學(xué)生高級檢索、檢索結(jié)果排序、在結(jié)果中進(jìn)一步檢索等手段;(4)教會學(xué)生選定特定來源的文獻(xiàn),如特定機(jī)構(gòu)、高校、院所發(fā)表的文獻(xiàn),或被北大核心期刊庫、SCI等收錄的文獻(xiàn);(5)教會學(xué)生追蹤并細(xì)化檢索該領(lǐng)域的活躍單位及個人。
讓學(xué)生了解如何尋找各類具體技術(shù)的參考源,如相關(guān)工具書、搜索引擎、學(xué)術(shù)博客、專利、儀器耗材廠家技術(shù)支持等。
學(xué)生閱讀、總結(jié)文獻(xiàn)后,結(jié)合本課題研究內(nèi)容,以小組為單位設(shè)計實驗方案,內(nèi)容包括材料、儀器、方法等,教師批閱后再次修改,最終形成完整的實驗方案,指導(dǎo)教師對小組方案作出分析和評價。
2.2 種子培養(yǎng),誘導(dǎo)搖瓶培養(yǎng)
實驗前,教師需要講解的內(nèi)容有:(1)菌種來源,重點是用于轉(zhuǎn)化株的篩選、不容易染菌等抗性基因的作用以及菌種庫的建立和使用;(2)超凈臺操作規(guī)范,重點講解接種的操作要領(lǐng);(3)搖床發(fā)酵,重點講解溶解氧、剪切力等與轉(zhuǎn)速和擺放位置的關(guān)系;(4)產(chǎn)物誘導(dǎo),重點講解異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)原理以及溫度的影響;(5)大型離心機(jī)的使用,重點闡述配平規(guī)則,強(qiáng)調(diào)安全事項。
實驗內(nèi)容:(1)取出甘油管凍存的菌種,解凍后接種至種子培養(yǎng)基過夜培養(yǎng);(2)過夜種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌搖瓶中,培養(yǎng)至特定菌體濃度后,加入IPTG誘導(dǎo)20 h;(3)離心,將菌體沉淀置于﹣20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 樣品提取,樣品粗純
樣品提取和粗純是純化工作中的重要步驟,決定了實際可得產(chǎn)量,并嚴(yán)重影響后續(xù)純化策略的實施。
實驗前教師需要講述的內(nèi)容有:(1)胞內(nèi)表達(dá)和胞外表達(dá)、可溶表達(dá)和包涵體表達(dá)的區(qū)別;(2)破壁方式,重點講述化學(xué)破壁、物理破壁以及超聲破碎儀的使用方法;(3)雙水相原理,重點講述分相原理和霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)。
實驗內(nèi)容:(1)將菌體解凍,用緩沖液重懸;(2)在冰浴條件下超聲破碎,離心后得到澄清的粗酶液以備純化;(3)將上清酶液加入配制好的雙水相體系中,振蕩后低速離心,將萃取層置于﹣20 ℃下以備后續(xù)純化。
2.4 色譜柱裝填,測定柱效
色譜柱作為液相分析的核心,對分離分析有重要影響,而色譜柱的效果主要由填料和裝填技術(shù)決定,尤其是前者,其發(fā)展和革新貫穿于整個液相分析技術(shù)的發(fā)展歷程并起到?jīng)Q定性作用。手動裝填色譜柱能讓學(xué)生更加深刻地理解液相層析柱的原理和本質(zhì),故采用手動裝填色譜柱的方式。
實驗前需要復(fù)習(xí)和講述的內(nèi)容有:(1)色譜學(xué)的平衡理論、塔板理論以及最重要的速率理論,因為其不僅提出了范第姆特方程式,還引入了柱效、分離度等重要概念;(2)作為液相系統(tǒng)的核心,色譜柱的構(gòu)造和組成包括柱體、填料、密封環(huán);(3)作為色譜柱的核心,填料的基質(zhì)主要分為硅膠、多糖基軟膠(瓊脂糖和葡聚糖)、聚合物硬膠(聚苯乙烯和聚苯烯酸酯)。通過化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)(如磷酸基、季銨基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體,衍生出種類繁多的色譜柱類型,如正向色譜柱、反相色譜柱、親水色譜柱、疏水色譜柱、離子交換色譜柱、親和層析色譜柱、體積排阻色譜柱等,為多種多樣的化合物分離提供可能。
實驗內(nèi)容:(1)每組分發(fā)100 mL QFF離子交換樹脂,每人分發(fā)一根10 mL Flash空柱,在教師的指導(dǎo)下裝填;(2)將色譜柱接至蠕動泵,以20%乙醇為流動相,流速漸增到5 mL/min,維持10 min以壓緊填料;(3)手動裝柱經(jīng)驗性較強(qiáng),個人差異大,故所裝填色譜柱需要進(jìn)一步測定柱效,評價裝柱質(zhì)量和水平,柱效通常用理論塔板高度(Height Equivalent of Theoretical Plate,HETP)和非對稱因子(Asymmetric Factor,As)來評價。
2.5 離子柱精純,酶活分析
親手搭建簡易多通道色譜系統(tǒng)能讓學(xué)生更深刻地領(lǐng)悟色譜系統(tǒng)的組成及作用。采用多泵頭蠕動泵作為液體傳輸系統(tǒng)能同時操作多個色譜柱層析,大大降低設(shè)備成本和時間成本。采用手動裝填色譜柱為層析柱,按照傳統(tǒng)的梯度洗脫和分步收集方式純化和收集樣品。蛋白濃度和酶活的分析均采用超微量微孔板分光光度計來實現(xiàn),都要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,好處是可單次檢測多個樣品,且耗時短、消耗試劑少。蛋白濃度測定采用Bradford方法(BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白),酶活檢測依據(jù)NADH在340 nm的減少量來計算,定義每分鐘消耗1 mol/L NADH的酶量為1個酶活單位(U)[5]。
實驗前,教師應(yīng)講述的內(nèi)容有:(1)簡易色譜系統(tǒng)的搭建。雖然是簡易色譜系統(tǒng),但仍舊包含輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、收集系統(tǒng)、檢測系統(tǒng);(2)梯度洗脫方式和分布收集方式的具體操作方法;(3)超微量微孔板分光光度計的使用步驟;(4)蛋白濃度和酶活檢測原理以及比活性(酶活力/蛋白濃度)和純化倍數(shù)(純化后酶比活性/純化前酶比活性)等相關(guān)重要參數(shù)。
實驗內(nèi)容:(1)連接色譜柱和蠕動泵,準(zhǔn)備好流動相和接樣瓶;(2)用平衡液平衡色譜柱;(3)采用泵吸入方法上樣;(4)鹽濃度梯度洗脫,分步收集;(5)檢測各梯度洗脫液的蛋白含量;(6)檢測各梯度洗脫液的酶活;(7)選擇酶活最高的組分,凍存后以備后續(xù)分析。
2.6 HPLC分析,SDS-PAGE分析
在進(jìn)行高效液相分析前,教師應(yīng)參照前面搭建的液相系統(tǒng)對比講解,讓學(xué)生更深入地了解液相色譜的構(gòu)造、原理及作用,楊衛(wèi)靈等[6]基于HPLC測定氨基酸的開放實驗很有參考價值。
HPLC分析實驗內(nèi)容:(1)樣品前處理,參照2.3提取并粗純樣品,強(qiáng)調(diào)前處理的重要性,若操作不當(dāng),會造成樣品失真、樣品污染、色譜柱堵塞等;(2)液相方法的編輯,包括洗脫梯度、溫度、最高壓力、最低壓力及檢測波長等參數(shù)的設(shè)定;(3)樣品序列編輯,用批處理來說明高效液相色譜對人力的解放和生產(chǎn)力的提高作用;(4)數(shù)據(jù)批量處理,包括數(shù)據(jù)處理方法的設(shè)置、結(jié)果和報告的批量導(dǎo)出。
在SDS-PAGE操作前,講解SDS-PAGE的基本原理:
(1)說明β-巰基乙醇、SDS、溴酚藍(lán)(BPB)等試劑的作用;
(2)重點闡述濃縮膠、分離膠的制備及所起作用和原理。
SDS-PAGE分析實驗內(nèi)容:(1)樣品前處理,根據(jù)目的選擇還原或非還原Loading Buffer。根據(jù)樣品性質(zhì)選擇沸水浴、溫水浴或者直接上樣,同時要注意樣品是否含有高濃度鹽或Triton等能產(chǎn)生嚴(yán)重干擾的化學(xué)物質(zhì)。(2)上樣、電泳。根據(jù)樣品濃度合理稀釋,樣品量過多、過少均會影響跑膠效果;小心加樣,既不能破壞加樣孔,也不能使樣品溢出加樣孔;設(shè)定好既定程序開始電泳。(3)染色、脫色。等待示蹤染料溴酚藍(lán)跑至膠末端,同時關(guān)注Marker情況,結(jié)束后關(guān)閉電源,去除濃縮膠后將分離膠染色40 min,再脫色1 h,并換脫色液2~3次。(4)用Image Lab分析主條帶純度[7]。
2.7 數(shù)據(jù)處理
收集并整理各步驟相關(guān)數(shù)據(jù),推薦使用Excel編排,學(xué)會剔除異常數(shù)據(jù),采用函數(shù)公式計算均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差;學(xué)會繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,得出線性公式;學(xué)會繪制散點圖、柱狀圖、雙Y軸圖。
2.8 報告撰寫
以小組為單位,嚴(yán)格依據(jù)模版格式撰寫報告,按國標(biāo)GB/T 15834—2011規(guī)范使用標(biāo)點符號,表頭、圖注的格式保持全文統(tǒng)一,做到數(shù)據(jù)真實、內(nèi)容完整、行文流暢、邏輯清晰。根據(jù)數(shù)據(jù)討論結(jié)果產(chǎn)生的原因,并對后續(xù)實驗改進(jìn)提出建議。最后總結(jié)該開放實驗教學(xué)課程,寫出自己的進(jìn)步、感悟和所得。
3 結(jié)語
通過開放實驗教學(xué),學(xué)生不僅能了解發(fā)酵、提取、粗純、精純、分析整條鏈的內(nèi)容,使本科教學(xué)知識點融為一體,還能通過文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)分析和報告撰寫進(jìn)一步提升科研水平,對本科畢業(yè)設(shè)計、就業(yè)和升學(xué)深造都大有裨益。