趙秋菊　崔學強　鄧杰玲　黃昌艷　李佳蔚　張自斌

關鍵詞：石斛蘭；iPBS 標記；雜交子代；真實性鑒定

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

石斛蘭（Dendrobium）為多年生草本植物，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬所有植物的總稱[1]，根據花期不同，可將其分為春石斛和秋石斛兩大類。石斛蘭的花朵具有獨特的“斛狀”花形，色彩絢麗且花期長，觀賞價值極高。除此之外，石斛蘭還具有重要的藥用價值，其中鐵皮石斛（D.officinale）、金釵石斛（D. nobile）、霍山石斛（D.huoshanense）等品種是我國傳統(tǒng)中藥材，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功效[2-3]，其藥用價值在《中藥本草經》和《本草綱目》等中藥典籍均有記載[4]。

1856 年，英國的JOHN DOMINY 等將蝦脊蘭屬的2個不同種蝦脊蘭進行雜交，將子一代成功培育開花[5]，至此，蘭花雜交育種開啟了新篇章。雜交育種是培育石斛蘭新品種的主要方法，目前，人類已經成功培育出涉及多達6 個屬的人工屬間雜交種[6]。但石斛蘭的育種周期較長，從篩選親本到子代培育成熟，整個繁殖周期通常需要幾年的時間，需花費大量的時間與精力從數個雜交后代中進行選擇。為了減少人力物力的浪費，縮短雜交育種的周期，雜交子代株系真實性的早期鑒定顯得十分重要。辨別雜交子代真實性能更好地篩選優(yōu)質種，縮短選種時間，對石斛蘭的育種工作具有重要意義。

早期的雜交子代真實性鑒定主要通過形態(tài)學方法、細胞學鑒定和同工酶標記進行鑒定[7]，但形態(tài)學方法易受主觀因素影響，細胞學鑒定要求技術較高，同工酶標記也存在位點少、多態(tài)性低的缺點。分子標記是繼形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定和同工酶標記之后發(fā)展起來的新式鑒定方法，隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多的分子標記被應用于雜種子代的鑒定中。近年來，常應用于雜種子代鑒定工作中的分子標記主要有：ISSR[8-9]、SSR[10-11]、SRAP[12-13]等，但未見iPBS 標記應用于鑒定雜種子代真實性的相關報道。iPBS 是一類基于反轉錄轉座子的新型分子標記[14-15]，相對于其他分子標記，iPBS 標記具有無需預先獲得LTR序列，技術手段簡單、高效，應用范圍廣的特點[16]，在種質資源鑒定、親緣關系分析和遺傳多樣性分析等研究中更具優(yōu)勢。因此，本研究基于iPBS標記，鑒定廣美石斛（Dendrobium Pittero Gold‘Diamond Ring）×黃鉆戒石斛（DendrobiumBtilliant Smile‘Hiromi）雜交子代的真實性，為石斛蘭雜交育種親本的篩選和優(yōu)質雜種子代的選育提供分子依據，從而加快石斛蘭育種工作進程。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以廣美石斛（ Dendrobium BtilliantSmile‘Hiromi）為母本，黃鉆戒石斛（DendrobiumPittero Gold‘Diamond Ring）為父本進行雜交，通過人工授粉（無套袋）得到子一代，將親本及其19 個雜交后代株系（編號：1～19）作為試驗材料。供試材料均取自廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院花卉研究所石斛蘭種質資源圃，父母本及雜交后代株系均剪取幼嫩葉片，立即保存于液氮中，用于提取DNA。

主要試劑：2×Easy Taq? PCR SuperMix（康為世紀生物科技有限公司）， Trans? 2K DNAMaker（北京全式金生物技術有限公司）；50×TAE緩沖液（國拓生物科技有限公司），瓊脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

主要儀器：H1650-W 型常溫離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GEL DOCXR 全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司），TC-96/G/H（b）C 型LifeECO 基因擴增儀（杭州博日科技有限公司），HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取和檢測 供試樣品基因組DNA 提取采用EasyPure? Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術有限公司）試劑盒提取，提取的DNA 用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度，提取的DNA 用TE 緩沖液稀釋濃度至20 ng/μL，置于–20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及iPBS-PCR 擴增 本研究引物選用KALENDAR 等[17]發(fā)表的83 個引物，從合成引物中選取擴增條帶清晰，穩(wěn)定性強，多態(tài)性高的引物對供試樣品DNA 進行PCR 擴增（表1）。PCR 反應體系為20 μL，包含10 μL 2×Easy Taq?PCR SuperMix，8 μL 無菌水，1 μL 引物，1 μL模板。iPBS-PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃ 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產物置于4 ℃冰箱保存。PCR 擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 雜種子代真實性鑒定 利用篩選出的引物對父母本及雜交后代株系進行iPBS-PCR 擴增，擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據電泳圖譜，對比父母本條帶，鑒別雜種子代中的真雜種。參照大多數研究的標準，以子一代電泳條帶中含有父本特征帶的植株鑒定為真雜種，反之為假雜種。為保證最終鑒定結果的準確性，在研究中至少有2 個或2 個以上的引物鑒定為真雜種才能判定該子代植株為真雜種[18]。

1.3 數據處理

觀察擴增產物電泳圖譜，統(tǒng)計清晰的DNA條帶，同一遷移位置上，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，經Excel 軟件構建原始“0， 1”二元矩陣。利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計軟件進行數據分析， 采用SHAN Clustering 程序進行UPGMA（算數平均數不加權對組法）聚類分析，構建樹狀聚類圖，并用DICE 法計算試供材料間的遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 iPBS 引物擴增多態(tài)性分析

從83 條iPBS 引物中篩選7 條擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復性好的引物對親本及子代共21 份石斛蘭基因組DNA 進行PCR 擴增。擴增結果表明（表1），7 條引物擴增出的總條帶為69 條，多態(tài)性條帶51 條，多態(tài)性比率為73.91%，其中引物2218 擴增條帶多態(tài)性比率最高，為100%，引物2224 和2255 擴增條帶多態(tài)性比率最低，為62.5%。每條引物擴增出的平均條帶數為9.86 條，平均多態(tài)性條帶為7.29 條。引物2224 對21 份石斛蘭基因組DNA 的擴增結果如圖1 所示。

2.2 雜合后代株系真實性鑒定

利用篩選的7 條引物對19 個雜交子代進行真實性鑒定，對比親本與子代電泳圖譜（圖2），以引物2255 擴增圖譜為例，能擴增出父本特征性條帶的即為真雜種，未擴增出父本特征帶或只擴增出母本特征帶的子一代植株可能為母本自交后代或者認定為假雜種。結果表明（表2），引物2081、2241、2255 擴增出具有父本特征性條帶的子代個數分別為10、10、14，鑒定效率分別為52.6%、52.6%、73.7%。在引物2081 和2241 的鑒定中，4、10、16 和17 號均未擴增出父本特征帶，但在引物2271、2076、2218 和2224 的進一步鑒定中，發(fā)現4、10、16、17 這4 株子代植株都擴增出了父本特征性條帶，鑒定為真雜種。

此外，在鑒別雜種子代時，每條引物均能擴增出了1～2 條父本特征帶，但引物2076 擴增出的父本特征帶最多，為4 條。綜合7 條引物的擴增結果來看，廣美石斛與黃鉆戒石斛雜交所得的19株子代植株均能擴增出父本特征性條帶，即全為真雜種，7 條iPBS 引物的鑒定效率高達100%。

2.3 親本與子代的聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計軟件對遺傳矩陣按UPGMA 進行聚類分析，構建石斛蘭親本及雜交后代株系的樹狀聚類圖，分析親本與雜交后代株系間的遺傳關系（圖3）。結果顯示，在遺傳距離0.82 處，親本及19 株雜交后代株系可分為5 大類群，其中，第Ⅰ類包括父本及11 個子代植株，分別為2、3、5～9、11、13、14、18 號植株，占供試材料的52.38%；第Ⅱ類為包括4 個子代植株，分別為10、15～17 號；第Ⅲ類為母本及4 號子代植株，第Ⅳ類僅有19 號子代植株，第Ⅴ類為1 號與12 號子代植株。其中，父本與6 號子代的遺傳距離最近，母本與4 號子代的遺傳距離最近；子一代中，7 號與11 號的遺傳距離最近。從聚類結果來看，絕大多數子代植株均聚類在父母親本之間，這部分子代植株先聚為2 個分支，先與父本聚合為一類，再與母本聚合，說明相較于母本，子一代植株與父本的親緣關系更近，表現出傾父本遺傳。

2.4 親本與子代的遺傳相似系數分析

利用NTSYS-pc 2.10e 統(tǒng)計軟件計算21 份石斛樣本間的遺傳相似系數，結果顯示，親本及子代之間的遺傳相似系數變幅為0.71～0.93。父本黃鉆戒石斛與母本廣美石斛之間的遺傳相似系數僅為0.71，是遺傳相似系數矩陣中的最低值。根據所得遺傳相似系數用Excel 2010 軟件構建親本及子代的遺傳相似系數箱式圖（圖4），發(fā)現父本黃鉆戒石斛與子代之間的遺傳相似系數在0.75～0.88 之間，平均值為0.83，其中父本與4 號子代的遺傳相似系數最低，與7 號子代的遺傳相似系數最高。母本廣美石斛與子代之間的遺傳相似系數為0.72～0.84，平均值為0.80，其中母本與12號子代遺傳相似系數最低，與10 號子代遺傳相似系數最高。子代間的遺傳相似系數為0.73～0.93，平均值為0.82，其中18 號子代與19 號子代遺傳相似系數最低，而7 號與11 號子代的遺傳相似系數最高。從整個遺傳相似系數矩陣來看，父本與子代間的遺傳相似系數比母本與子代間、子代間的更高，這表明雜交子代更偏向于父本遺傳，這與聚類分析時雜交子代與父本的親緣關系更近的結果一致。

3討論

雜種子代的鑒別工作對于遺傳育種十分關鍵，它可以通過子代基因型預測子代植株的表型性狀，極大地提高了育種效率，縮短雜交育種的周期，有助于發(fā)現子代中具有雜種優(yōu)勢的新品種。傳統(tǒng)的鑒別方式是形態(tài)學鑒定，但對于一些表型性狀差異不大的物種，光靠形態(tài)學鑒定并不準確，而分子標記技術的發(fā)展，在基因組DNA 的水平上，為鑒別雜種子代的真實性提供了可靠的分子依據。

iPBS 作為新型分子標記，近年來逐漸被應用于多種物種的種質資源的鑒定以及遺傳多樣性分析等研究中。在本研究中，選取清晰、重復性好、多態(tài)性高的7 條引物對試供樣本進行iPBS-PCR擴增，共檢測到69 條譜帶，其中多態(tài)性條帶為51 條，多態(tài)比例為73.91%。相較于ISSR[19]、SSR[20]、SRAP[21-22]、AFLP[23-24]等分子標記技術對石斛蘭擴增的引物多態(tài)性，iPBS 分子標記的引物多態(tài)性略低，但仍在70%以上，研究證明，iPBS分子標記的擴增多態(tài)性較好，可應用于種質資源鑒定、遺傳多樣性分析以及雜交子代真實性鑒定等研究中。

種質資源的鑒定是育種工作的基礎，對種質間的親緣關系和遺傳多樣性進行分析，有助于選配優(yōu)質雜交親本，選育具有雜種優(yōu)勢的后代株系。遺傳相似系數矩陣揭示了子代與親本之間的相似程度， 兩親本與子代間遺傳相似系數為0.71～0.93，變幅不大，表明該雜交組合子代間的遺傳多樣性并不豐富[25]，這不利于雜種優(yōu)勢品種的出現，后續(xù)研究中應選取具有較大遺傳差異的植株進行雜交育種，以便獲取雜種優(yōu)勢品種。而子代間遺傳相似系數數值偏高，說明該雜交組合子代株系遺傳基礎趨向偏窄[26]。聚類分析圖直觀顯示了雜交子代株系與雙親間遺傳距離的遠近，大部分子代株系表現為傾父本遺傳，聚類分析鑒定結果與遺傳相似系數鑒定結果一致。但1、12、19 三株子代獨立為2 個分支，并與父母本以及其余子代植株遺傳距離較遠，存在明顯的遺傳分離現象，其原因可能是子代發(fā)生了較大的基因突變或重組變異[18， 27]。

本研究中，子一代植株擴增出大量的父本特征帶，子代偏向父本黃鉆戒石斛遺傳，這與大部分研究如林榕燕等[28]、李玉萍等[29]的研究中子代株系均表現為傾母本遺傳的結果相反，說明較多的黃鉆戒石斛遺傳信息被導入子代個體中，表現出較為明顯的傾父本遺傳。經7 條引物共同鑒定，19 株子代株系均為真雜種，鑒定效率為100%，這與林榕燕等[26]基于SSR 標記和SRAP 標記對文心蘭雜交后代進行真實性鑒定的鑒定效率一致，略高于鐵皮石斛[30]、結縷草[31]、假儉草[32]、獼猴桃[33]等物種的鑒定效率。研究證明，iPBS 標記是鑒別雜種子代真實性的有效手段，可應用于植物種質資源的鑒定、親緣關系的研究以及遺傳多樣性的分析等研究工作中。雖然一種分子標記可單獨鑒別出所有雜種，但由于石斛屬植物類群較大且遺傳背景較復雜，僅憑一種標記鑒定可能還不夠準確，在今后的研究中可增加形態(tài)學鑒定或者聯合多標記鑒定來輔助進行雜種鑒定。