林秋云　謝振宇　胡偉　周玉杰　龍開(kāi)意　賀治洲

關(guān)鍵詞：水稻；葉片亮綠；突變體；bgl-2；表型；遺傳

中圖分類號(hào)：S31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

糧食安全是“國(guó)之大者”，悠悠萬(wàn)事，吃飯為大。我國(guó)是水稻生產(chǎn)大國(guó)，2011—2021 年種植面積穩(wěn)定在3000 萬(wàn)hm2 左右，以占世界9%的耕地、6%的淡水資源，養(yǎng)育了世界近1/5 的人口[1]。優(yōu)良高產(chǎn)品種的推廣應(yīng)用發(fā)揮了極其重要的作用。光合效率是決定作物產(chǎn)量的重要前提，也是育種家們的改良目標(biāo)，而葉片是水稻進(jìn)行光能轉(zhuǎn)化的主要組織[2]。水稻葉色突變是一種發(fā)生頻率高、易于被發(fā)現(xiàn)的突變現(xiàn)象，但多數(shù)葉色突變體對(duì)光合作用有影響，在一定程度上間接影響水稻產(chǎn)量，因此在早期常被認(rèn)為是無(wú)意義突變體。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明葉色突變體不僅是開(kāi)展光合作用、光形態(tài)建成、質(zhì)－核基因互作、葉綠素合成和葉綠體發(fā)育等基礎(chǔ)研究的理想材料，同時(shí)可作為一種明顯且易于識(shí)別的標(biāo)記性狀，簡(jiǎn)化良種繁育和雜交種生產(chǎn)[3-5]。此外，葉色突變體還可以作為觀賞稻，致力于打造鄉(xiāng)村休閑農(nóng)業(yè)觀光旅游點(diǎn)，帶動(dòng)農(nóng)民增收，促進(jìn)鄉(xiāng)村振興[6]。

水稻資源輻射誘變創(chuàng)制是利用60Co-γ 射線照射種子，引起種子內(nèi)染色體重組、畸變，產(chǎn)生遺傳變異，從而形成水稻新種質(zhì)、新材料，進(jìn)而配制水稻新品種的一種高科技技術(shù)。60Co-γ 射線輻照誘變的頻率高，可形成自然界沒(méi)有的性狀和類型，打破性狀間的緊密連鎖，促進(jìn)基因重組，有些變異性狀穩(wěn)定快，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得罕見(jiàn)的種質(zhì)材料和基因資源。來(lái)自西非地區(qū)尼日利亞的農(nóng)家栽培品種SIPI 具有耐瘠薄、分蘗強(qiáng)、耐高溫等優(yōu)良特性，但其稻穗較小，株型松散，限制了該品種的育種應(yīng)用。本課題組在前期研究中利用60Co-γ 射線輻照處理SIPI 干種子，輻射劑量為300 Gy，隨后連續(xù)自交多代篩選，最終獲得一個(gè)穩(wěn)定遺傳的水稻亮綠葉突變體bgl-2。本研究通過(guò)對(duì)突變體bgl-2 進(jìn)行田間表型和細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)觀察，并進(jìn)行溫度敏感試驗(yàn)，同時(shí)構(gòu)建F2 分離遺傳群體進(jìn)行BGL-2 基因遺傳模式分析，以期為后續(xù)BGL-2 基因的克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體bgl-2 是利用60Co-γ 射線300 Gy 輻照來(lái)自尼日利亞的秈稻品種SIPI 干種子，在M2 代，田間鑒定出亮綠葉突變表型植株，隨后對(duì)突變植株連續(xù)自交多代獲得穩(wěn)定遺傳的一個(gè)水稻亮綠葉突變體材料。2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，地點(diǎn)位于海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻綜合試驗(yàn)基地。種植規(guī)格為20 cm×20 cm，單株插秧，田間水肥、病蟲(chóng)管理參照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)大田管理方法。

1.2 方法

1.2.1 F₂分離群體構(gòu)建 2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，抽穗期以突變體bgl-2 為母本，人工去雄，授以野生型SIPI 花粉，授粉25 d后收獲雜交種F1。2020 年夏季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F1，觀察F1 植株表型，排除雜株后自交收獲F2 種子。2021 年春季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F2，獲得分離遺傳群體，田間調(diào)查F2 群體單株表型，計(jì)算分離比例。

1.2.2 光合色素含量測(cè)定 分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 分蘗期劍葉葉片，測(cè)定光合色素含量，測(cè)定方法參照LI 等[7]的方法。光合色素提取完畢，利用DU800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在黑暗條件下，測(cè)定上清液的吸光值（波長(zhǎng)為470、649、665 nm）。并根據(jù)以下公式計(jì)算光合色素含量：

葉綠素a 含量：Chla（mg/g）=13.95D₆₆₅–6.88D₆₄₉

葉綠素b 含量：Chlb（mg/g）=24.96D₆₄₉–7.32D₆₆₅

類胡蘿卜素含量：Car（mg/g）=（1000D₄₇₀–2.05Chla–114Chlb）/245

細(xì)胞色素含量（mg/g）=（葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重

1.2.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察 分別取分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉，橫切成數(shù)段，每段約2 mm，置于3%的戊二醛固定液，抽氣，室溫固定12 h，4 ℃保存。將樣品送至中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所電鏡實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行樣品制備和透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻亮綠葉突變體bgl-2 的表型鑒定

與野生型SIPI 比較，突變體bgl-2 在田間分蘗期表現(xiàn)為明顯的葉片亮綠色（圖1），此外還伴隨著株高變矮，突變體bgl-2 株高為（91.10±3.13）cm，而野生型SIPI 的株高為（107.30±3.93）cm，二者之間存在顯著差異（表1）。調(diào)查葉片形態(tài)發(fā)現(xiàn)，突變體bgl-2 的劍葉和倒二葉的葉尖處均表現(xiàn)出彎折，分別測(cè)定野生型和突變體bgl-2 的劍葉長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型SIPI 的劍葉長(zhǎng)度為（25.70±0.87）cm，而突變體bgl-2 的劍葉長(zhǎng)度為（20.90±0.53）cm，顯著短于野生型?？椒N發(fā)現(xiàn)，突變體bgl-2的千粒重、粒長(zhǎng)和粒寬均顯著小于野生型SIPI，但長(zhǎng)寬比在二者之間無(wú)顯著差異（表1）。這些結(jié)果表明BGL-2 基因可能存在一因多效的效應(yīng)。

2.2 突變體bgl-2 的光合色素含量測(cè)定

大多數(shù)造成葉色突變的基因直接或間接影響葉綠素的代謝過(guò)程，從而致使葉片葉綠素含量發(fā)生變化。為了了解突變體bgl-2 的葉綠素含量是否發(fā)生變化，在田間分蘗期分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉片，測(cè)定光合色素含量，結(jié)果如圖2所示，二者之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明突變體bgl-2 的葉色亮綠表型不是因?yàn)楣夂仙睾孔兓瘜?dǎo)致的，可能是BGL-2 基因突變引起其他機(jī)制變化導(dǎo)致的。

2.3 突變體bgl-2 的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

為了了解BGL-2 基因的突變是否影響到葉綠體的發(fā)育，本研究通過(guò)透射電鏡觀察分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。如圖3A 與圖3D 所示，突變體bgl-2 的葉綠體數(shù)目與野生型SIPI 相比無(wú)顯著差異。然而突變體bgl-2 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。野生型SIPI 細(xì)胞壁厚度為（222.20±6.26）mm，而突變體bgl-2 的胞壁厚度增厚至（280.20±14.20）mm，但其細(xì)胞外膜厚度顯著減小至（31.30±5.29）mm，且內(nèi)膜幾乎退化，而野生型SIPI 的細(xì)胞外膜厚度為（102.80±5.94）mm（表2）。此外突變體bgl-2 的類囊體片層結(jié)構(gòu)顯著減少（圖3B、圖3C、圖3E 和圖3F），說(shuō)明突變體bgl-2 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不正常，BGL-2 基因的突變影響其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和葉綠體的正常發(fā)育。

2.4 突變體bgl-2 的遺傳模式分析

突變體bgl-2 與野生型SIPI 雜交獲得的F1 代植株葉片表現(xiàn)正常綠色，劍葉和倒二葉形態(tài)正常，而自交后的F₂代群體分離出葉色差異明顯的正常綠葉苗和亮綠葉苗。卡方測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)₂ 代群體中正常苗與亮綠葉苗的分離比例符合3∶1（表3），說(shuō)明該突變性狀受1 對(duì)隱性單基因控制。

3 討論

水稻葉色突變體是一種出現(xiàn)頻率較高的突變體類型，常見(jiàn)的有黃綠、淺綠、條紋、黃化、白化、白化轉(zhuǎn)綠、黃化轉(zhuǎn)綠等類型[8-12]。然而水稻葉片亮綠突變體比較少見(jiàn)，已報(bào)道的只有2 個(gè)[4]。水稻葉色表型多由一對(duì)隱性單基因控制，遺傳行為簡(jiǎn)單。目前已報(bào)道的與葉綠素含量相關(guān)的基因有150 多個(gè)，其中已被克隆的葉色基因至少有30 個(gè)，這些基因主要分為葉綠素合成和降解途徑的基因、葉綠體發(fā)育途徑的基因以及其他途徑相關(guān)基因等[13-16].

YOO 等[17]最先報(bào)道的突變體bgl 由于近軸和遠(yuǎn)軸葉表面均無(wú)乳頭狀結(jié)構(gòu)的小角質(zhì)乳突（smallpapillae， SP）導(dǎo)致綠光更多的直接反射而減少擴(kuò)散，所以葉片呈現(xiàn)出亮綠色。但突變體bgl 的葉綠素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)與野生型相比，并無(wú)顯著差異。圖位克隆結(jié)果表明，bgl 位點(diǎn)是一個(gè)編碼由11 個(gè)成員組成的水稻OsRopGEFs 家族之一OsRopGEF10。與SP 在葉表皮上啟動(dòng)的時(shí)間一致，OsRopGEF10 在葉鞘出苗前的新發(fā)育葉片中表達(dá)最強(qiáng)。隨后WANG 等[18]報(bào)道另外一個(gè)新的水稻亮綠突變體bgl11，不同于突變體bgl1，其葉綠素含量顯著低于野生型，且在成熟期，其單株有效穗數(shù)和結(jié)實(shí)率也顯著低于野生型，但其他主要農(nóng)藝性狀與野生型相比無(wú)差異?；驁D位克隆和測(cè)序結(jié)果表明，BGL11 是一個(gè)位于水稻第11 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的基因LOC_Os11g38040。突變體bgl11 在該基因的編碼區(qū)存在9 個(gè)bp 片段缺失。將LOC_Os11g38040 基因轉(zhuǎn)到突變體bgl11 中，其葉片顏色恢復(fù)正常綠色。本研究的bgl-2 是一個(gè)輻射誘變獲得的水稻亮綠葉突變體，但表型不同于bgl和bgl11，其不僅在葉片顏色上呈亮綠色，葉片形態(tài)也發(fā)生了變化，劍葉和倒二葉葉尖處均表現(xiàn)出彎折。此外在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了變化，細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞膜變薄甚至退化，說(shuō)明BGL-2 位點(diǎn)有可能不同于OsRopGEF10 和BGL11，是一個(gè)新的葉色亮綠基因。遺傳模式分析表明突變體bgl-2由一對(duì)隱性單基因控制，下一步試驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)BGL-2 進(jìn)行基因定位及功能分析。