李小琴，張鳳良*，吳 裕，毛常麗，楊 湉，趙 祺

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；2.西雙版納云墾澳洲堅(jiān)果科技開發(fā)有限公司，云南景洪 666100）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于高溫、高濕、靜風(fēng)的亞馬遜河流域熱帶雨林［1］，適宜生長(zhǎng)溫度為20～30℃。當(dāng)溫度低于15℃時(shí)，橡膠樹生長(zhǎng)基本停止；低于5℃時(shí)，會(huì)出現(xiàn)枝枯、莖枯、爆皮等寒害癥狀；低于0℃時(shí)，受寒嚴(yán)重，甚至死亡［2-4］。我國(guó)自上個(gè)世紀(jì)50 年代植膠以來(lái)，冬季寒潮低溫對(duì)橡膠樹的危害不時(shí)發(fā)生，1961 年起至今我國(guó)一直在開展橡膠樹抗寒高產(chǎn)選育種工作［5］。開展此項(xiàng)工作首先面對(duì)的問(wèn)題是如何鑒定橡膠樹抗寒力，目前最常用的室內(nèi)抗寒鑒定方法為電導(dǎo)法，該方法具有應(yīng)用廣泛、簡(jiǎn)便、結(jié)果顯著等特點(diǎn)［6-11］。本研究選用橡膠樹對(duì)低溫傷害表現(xiàn)最直觀的樹皮組織作為材料，在同一低溫處理下設(shè)置不同處理時(shí)長(zhǎng)，測(cè)定42 份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源樹皮組織在低溫脅迫后的相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)合樹皮厚度，對(duì)持續(xù)低溫下橡膠樹種質(zhì)的耐寒力進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，旨在短期內(nèi)篩選出耐寒力強(qiáng)的橡膠樹種質(zhì)資源，同時(shí)為加快橡膠樹抗寒性選育種、降低選育種成本提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用“農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃”苗圃地內(nèi)42 份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源一年生嫁接無(wú)性系作為試驗(yàn)材料。所有苗木均為2020 年采集芽條，以GT1 開放授粉實(shí)生苗為砧木芽接繁殖成無(wú)性系，并于2021 年4 月鋸干，按株行距0.6 m×0.8 m 育苗保留。苗圃地按照常規(guī)育苗管理，苗木生長(zhǎng)良好。試驗(yàn)于2022 年2 月下旬進(jìn)行，每個(gè)無(wú)性系選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的由頂部向下第三個(gè)葉蓬所在的枝條（生長(zhǎng)狀態(tài)處于半木質(zhì)化）作為材料。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及低溫處理方法

每份橡膠樹種質(zhì)選取3 株長(zhǎng)勢(shì)均勻且健康的植株進(jìn)行采樣及編號(hào)，采集好的枝條隨即放到便攜式冷藏箱內(nèi)。帶回實(shí)驗(yàn)室后先用洗潔精將枝條上的雜質(zhì)快速清洗干凈，再用雙蒸水沖洗干凈后吸干水分，隨即測(cè)定枝條韌皮部的相對(duì)電導(dǎo)率及樹皮厚度。

將所有取過(guò)樣的枝條放入設(shè)定溫度為-2℃的人工低溫培養(yǎng)箱內(nèi)，按照低溫處理時(shí)間設(shè)置5 個(gè)時(shí)間梯度：8 h、16 h、18 h、21 h 和24 h。為保證取樣的相對(duì)一致性，所有處理均用同一批枝條，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，以未經(jīng)處理的作為對(duì)照。

1.2.2 相對(duì)電導(dǎo)率及樹皮厚度測(cè)定方法

相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定：取樣時(shí)注意避開枝條上的芽眼，用美工刀準(zhǔn)確裁取0.5 cm×1.0 cm 的小方塊樹皮，同一時(shí)間處理的每個(gè)無(wú)性系共裁取6 個(gè)小片，一個(gè)試管中放入2 片，加入超純水20 mL，蓋上試管蓋后混合均勻，室溫放置24 h，期間注意搖勻數(shù)次。采用SG3-ELK 型便攜式電導(dǎo)率儀測(cè)出浸提液的初始電導(dǎo)值（E1），再蓋上試管蓋放入沸水浴，煮沸0.5 h 取出，冷卻至室溫測(cè)其終電導(dǎo)值（E2），同時(shí)測(cè)出雙蒸水的電導(dǎo)值（E0）。按以下計(jì)算公式計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率：

相對(duì)電導(dǎo)率REC（%）=（E1－E0）/（E2－E0）×100%

樹皮厚度測(cè)量：從枝條中部裁取小塊樹皮，用游標(biāo)卡尺測(cè)量樹皮厚度，重復(fù)3 次，測(cè)量時(shí)避開芽眼。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合、相關(guān)性及聚類分析。按Logistic 方程Y=K/(1+ae-bt) 進(jìn)行非線性回歸擬合，其中：Y為低溫處理下的橡膠樹組織相對(duì)電導(dǎo)率，t為處理時(shí)間，K、a、b 為參數(shù)，K 為Y的最大極限值。由擬合出的方程計(jì)算出當(dāng)Y為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間t值，即為橡膠樹枝條樹皮組織半致死時(shí)間LT50。半致死時(shí)間越長(zhǎng)，該樹種耐寒性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對(duì)電導(dǎo)率變化情況及耐寒性比較

所測(cè)42 份種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率的變化情況詳見(jiàn)表1，-2℃低溫下，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，橡膠樹樹皮組織細(xì)胞的膜透性增大，電解質(zhì)滲透率隨之增加，相對(duì)電導(dǎo)率呈不同程度的“S”型上升趨勢(shì)。在8 h 時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率均值為32.79%，與對(duì)照相比，相對(duì)電導(dǎo)率值增加了6.08 個(gè)百分點(diǎn)，受寒害程度較??；16 h 時(shí)，已有6 份種質(zhì)（占總種質(zhì)14.28%）相對(duì)電導(dǎo)率超過(guò)50%，其中最大的已達(dá)到82.00%（64 號(hào)種質(zhì)），說(shuō)明這6 份種質(zhì)的耐寒性表現(xiàn)最差；在18 h 時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率均值為49.89%，已接近50%，且21 h 時(shí)，有17 份種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率超過(guò)50%，18～21 h 時(shí)間段為多數(shù)種質(zhì)的耐寒能力敏感期；在24 h 時(shí)，40 份種質(zhì)的相對(duì)電導(dǎo)率已超過(guò)50%，且均值已高達(dá)85.02%，表現(xiàn)出對(duì)此低溫時(shí)長(zhǎng)的極不耐受，僅19 號(hào)（44.13%）和20 號(hào)（49.28%）種質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒能力。

表1 42份橡膠樹種質(zhì)持續(xù)低溫處理下相對(duì)電導(dǎo)率變化、耐寒性及樹皮厚度比較

根據(jù)Logistic 方程Y=K/(1+ae-bt) 進(jìn)行擬合，對(duì)橡膠樹枝條半致死時(shí)間（LT50）進(jìn)行計(jì)算（表1）,42 份種質(zhì)的半致死時(shí)間變幅為9.34～30.49 h，變幅較大；Logistic 方程擬合度R2均值為0.800，擬合效果較好；半致死時(shí)間均值為17.76 h，半致死時(shí)間高于18 h 的種質(zhì)有15 份，此時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行耐寒性種質(zhì)篩選的入選率為35.71%；高于21 h 的有6 份種質(zhì)，占比為14.29%。

2.2 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

對(duì)42 份橡膠樹種質(zhì)資源的不同低溫處理時(shí)長(zhǎng)下的相對(duì)電導(dǎo)率與半致死時(shí)間、樹皮厚度進(jìn)行相關(guān)性分析（表2）可知：-2℃低溫下，持續(xù)處理16 h、18 h 及21 h 三個(gè)時(shí)間段的相對(duì)電導(dǎo)率值均互相呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)；半致死時(shí)間與5個(gè)不同處理時(shí)間段的相對(duì)電導(dǎo)率均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)最大的是21 h 的；由表1 可知，所測(cè)42 份種質(zhì)的樹皮厚度在0.47～0.92 mm，變幅較大，均值0.66 mm，樹皮厚度與半致死時(shí)間呈顯著（P＜0.05）正相關(guān)，說(shuō)明樹皮越厚，可能半致死時(shí)間越長(zhǎng)；而與處理24 h 的相對(duì)電導(dǎo)率值呈顯著負(fù)相關(guān)，表明樹皮越厚可能對(duì)低溫的耐受性更強(qiáng)。

表2 各低溫處理時(shí)長(zhǎng)下的相對(duì)電導(dǎo)率與半致死時(shí)間、樹皮厚度之間的相關(guān)性分析

2.3 耐寒性聚類分析

根據(jù)42 份橡膠樹種質(zhì)資源的半致死時(shí)間，利用歐式距離（Euclidean distance）法進(jìn)行聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖1。聚類結(jié)果表明，當(dāng)聚類閾值在5 左右的位置時(shí)，可將42 份種質(zhì)資源聚類成3 大組。其中第一組包含34 份種質(zhì)，占比最大（80.95%），結(jié)合表1 可知，該組的特點(diǎn)是耐寒性中等，該組下又可以劃分為2 個(gè)小組，耐寒性中上的有8 份，占總?cè)后w的19.05%，中下的有26 份，占總?cè)后w的45.24%，耐寒性較強(qiáng)的種質(zhì)占比相對(duì)較少。第2大組包含6 份種質(zhì)資源，耐寒性最差。第3 大組僅2 份種質(zhì)，耐寒性最強(qiáng)，占比僅4.76%。

圖1 42份橡膠樹種質(zhì)資源耐寒性聚類圖

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過(guò)同一低溫下不同時(shí)長(zhǎng)處理，對(duì)42份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性比較，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各無(wú)性系枝條組織相對(duì)電導(dǎo)率呈“S”型變化趨勢(shì)。當(dāng)處理時(shí)間為18 h 時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率的均值已近50%，整體開始表現(xiàn)對(duì)低溫的不耐受性，與本課題組之前結(jié)果（選用4 個(gè)品種進(jìn)行室內(nèi)抗寒性測(cè)定，結(jié)果為以-2℃低溫處理15 h的條件快速鑒定橡膠樹種質(zhì)抗寒性［12］）存在一些差異，有待進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

不同無(wú)性系的樹皮厚度變幅較大，且與半致死時(shí)間呈顯著正相關(guān)，樹皮厚度越厚，耐寒性表現(xiàn)越強(qiáng)，與本課題組之前的研究結(jié)果相符［8］，進(jìn)一步說(shuō)明在抗寒鑒定時(shí)可將樹皮厚度列為表觀形態(tài)篩選指標(biāo)。

42 份種質(zhì)的半致死時(shí)間在9.34～30.49 h，各無(wú)性系間差異較大，均值為17.76 h，半致死時(shí)間高于18 h 的種質(zhì)有15 份，占總?cè)后w的35.71%。從半致死時(shí)間的聚類分析來(lái)看，耐寒性表現(xiàn)最強(qiáng)的一組僅2 份種質(zhì)，分別是170 號(hào)和189 號(hào)；耐寒性最差的有6 份；耐寒性中下等的無(wú)性系占比最多，占45.24%。從聚類占比可知，總?cè)后w中耐寒性強(qiáng)的種質(zhì)相對(duì)偏少?？紤]到橡膠樹對(duì)低溫脅迫時(shí)間段表現(xiàn)出的敏感性，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可選取在-2℃低溫下處理18～21 h 來(lái)快速篩選出耐寒性較強(qiáng)的種質(zhì)。

在同一低溫、不同處理時(shí)長(zhǎng)條件下對(duì)大批量的橡膠樹種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性鑒定具有省時(shí)省力、操作性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究?jī)H對(duì)一年生苗期的耐寒性進(jìn)行鑒定，后期可探討將此方法進(jìn)一步運(yùn)用于橡膠樹不同林齡的抗寒鑒定上，為縮短抗寒種質(zhì)鑒定時(shí)間及提高鑒定準(zhǔn)確性提供理論依據(jù)。