［摘要］目的探究血清miR-433和miR-455表達(dá)水平對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。方法選取2020年5月～2022年8月邯鄲市第一醫(yī)院收治的卵巢癌患者作為病例組，根據(jù)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（41例）和非轉(zhuǎn)移組（45例）；同期體檢的健康者86例作為對(duì)照組。行彩色超聲造影定量分析，血清miR-433、miR-455表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。采用ROC曲線分析血清miR-433、miR-455表達(dá)水平及超聲造影定量參數(shù)對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。采用多因素logistic回歸分析卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。結(jié)果觀察組血清miR-433、miR-455表達(dá)水平低于對(duì)照組（Plt;0.05）。轉(zhuǎn)移組的基礎(chǔ)強(qiáng)度低于非轉(zhuǎn)移組（Plt;0.05），達(dá)峰時(shí)間短于非轉(zhuǎn)移組（Plt;0.05），血清miR-433、miR-455表達(dá)水平低于非轉(zhuǎn)移組（Plt;0.05）。logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-433、miR-455以及基礎(chǔ)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間均為卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立保護(hù)因素（Plt;0.05）。ROC曲線顯示，血清miR-433、miR-455、基礎(chǔ)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間四者聯(lián)合對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷的曲線下面積最大。結(jié)論血清miR-433、miR-455聯(lián)合超聲造影定量分析對(duì)早期診斷卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的效能，能夠作為評(píng)價(jià)患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

［關(guān)鍵詞］miR-433；miR-455；卵巢癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；早期診斷

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.05.014

Diagnostic Value of Serum MiR-433 and MiR-455 Expression in LymphNode Metastasis of Ovarian Cancer

Li Xiaokun，Deng Zhenquan，Ji Wenhua，F(xiàn)eng Jie，Zhang Xingxing，Shang Sushuang，Xie Xiuming

Handan First Hospital，Handan056002

［Abstract］ObjectiveTo investigate the diagnostic value of serum miR-433 and miR-455 expression levels for lymph node metastasis of ovarian cancer.MethodsOvarian cancer patients admitted to Handan First Hospital from May 2020 to August 2022 were selected as the case group and divided into metastatic group（41 cases） and non-metastatic group（45 cases） according to the presence or absence of lymph node metastasis;86 healthy subjects examined during the same period were used as the control group.Quantitative analysis of color contrast-enhanced ultrasound was performed，and serum miR-433 and miR-455 expression levels were detected by real-time PCR.ROC curve was used to analyze the diagnostic value of serum miR-433 and miR-455 expression levels and contrast-enhanced ultrasound quantitative parameters for lymph node metastasis of ovarian cancer.Multivariate logistic regression was used to analyze the risk factors for lymph node metastasis in ovarian cancer.ResultsThe serum miR-433 and miR-455 expression levels in the observation group were lower than those in the control group（Plt;0.05）.The basal intensity of the metastatic group was lower than that of the non-metastatic group（Plt;0.05），the time to peak was shorter than that of the non-metastatic group（Plt;0.05），and the serum miR-433 and miR-455 expression levels were lower than those of the non-metastatic group（Plt;0.05）.The results of logistic regression analysis showed that serum miR-433，miR-455 as well as basal intensity and time to peak were independent protective factors for lymph node metastasis of ovarian cancer（Plt;0.05）.ROC curves showed that the combination of serum miR-433，miR-455 levels，basal intensity，and time to peak had the largest area under the curve for the diagnosis of lymph node metastasis in ovarian cancer.ConclusionQuantitative analysis of serum miR-433 and miR-455 combined with contrast-enhanced ultrasound has a high efficacy for early diagnosis of lymph node metastasis in ovarian cancer and can be used as an important indicator to evaluate whether patients develop lymph node metastasis.

［Key words］MiR-433;MiR-455;Ovarian cancer;Lymph node metastasis;Early diagnosis

卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的主要途徑，與卵巢癌復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差有一定的關(guān)系。因此，早期、有效診斷卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)卵巢癌的治療和預(yù)后十分重要。超聲造影定量參數(shù)能夠檢查到卵巢癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，但其易發(fā)生誤診漏診［1］。miRNAs是一段長(zhǎng)度為19～24 nt的非編碼小分子RNA，廣泛參與多種生物學(xué)過程。近年來，miRNAs在腫瘤領(lǐng)域的研究已成為熱點(diǎn)，miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2-3］。miR-433在腫瘤生物學(xué)中具有多種功能，miR-433通過靶向HDAC6抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。miR-433在胃癌、骨髓增生性腫瘤中異常表達(dá)［4-6］。miR-455在肝細(xì)胞癌、胃癌和肺小細(xì)胞癌組織中異常表達(dá)，可以作為診斷腫瘤的一項(xiàng)指標(biāo)［7-9］。本研究旨在探討血清miR-433和miR-455水平在卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷中的價(jià)值，以期提高卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2020年5月～2022年8月邯鄲市第一醫(yī)院收治的卵巢癌患者86例作為病例組，年齡50～81歲，平均（70.14±3.68）歲，病理分期Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期49例；漿液性囊腺癌38例，黏液性囊腺瘤29例，子宮內(nèi)膜樣腺癌11例，透明細(xì)胞癌8例。根據(jù)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（41例）和非轉(zhuǎn)移組（45例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合卵巢癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］；②入院前未進(jìn)行化療或外科治療以及其他任何形式的藥物治療；③患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并多種慢性疾病及自身免疫系統(tǒng)疾??；②合并其他惡性疾病者；③病理資料缺失。另外選擇同期在本院健康體檢的卵巢正常女性86例作為對(duì)照組，年齡51～83歲，平均（70.47±4.24）歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑GE醫(yī)療彩色超聲診斷儀Voluson P6（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）、NanoDrop2000c儀器（Thermo公司）、高通量測(cè)序儀（Illumina公司）、bio-rad伯樂CFX Connect熒光定量PCR儀（上海艾研生物科技有限公司）。聲諾維（Sonovue）超聲造影劑（意大利Bracco公司）。血清miRNA提取試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）、SYBR Green Master Mix（2×）（北京伊塔生物科技有限公司）。

1.2.2樣品采集抽取受試者清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離上清，保存于-80℃冰箱。

1.2.3超聲診斷使用GE醫(yī)療彩色超聲診斷儀進(jìn)行超聲檢查，探頭頻率為3.5 MHz。先對(duì)卵巢癌患者進(jìn)行常規(guī)超聲檢查，確定卵巢癌的位置及形態(tài)等信息，再對(duì)患者進(jìn)行腹超聲造影檢查，Sonovue造影劑中加入5 mL生理鹽水，混勻后抽取2 mL注入患者肘靜脈，沖管后開啟計(jì)時(shí)器進(jìn)行計(jì)時(shí)，并儲(chǔ)存動(dòng)態(tài)圖像。記錄各定量參數(shù)，包括基礎(chǔ)強(qiáng)度、峰值強(qiáng)度、到達(dá)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、灌注時(shí)間。

1.2.4血清miR-433、miR-455 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，按照血清miRNA提取試劑盒操作步驟分離提取血清總RNA，并測(cè)定其濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用bio-rad伯樂CFX Connect熒光定量PCR儀檢測(cè)血清中miR-433、miR-455 mRNA相對(duì)的表達(dá)情況。內(nèi)參為U6，引物經(jīng)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)后由上海生工生物工程有限公司合成。miR-433上游引物5′-GCGGCGGATCATGATGGGCTCC-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-455上游引物5′-GAACTGCAGTCATGGGAT-3′，下游引物5′-GGGGTCGAGGTATTC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA（50 ng/μL）2 μL，SYBR Green Master Mix（2×）10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。使用2-ΔΔCt方法（Ct為循環(huán)閾值）計(jì)算miR-433、miR-455 mRNA的相對(duì)表達(dá)。為降低實(shí)驗(yàn)誤差，各樣品檢測(cè)重復(fù)3次，取均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析；ROC曲線分析血清miR-433、miR-455對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值；多因素logistic回歸分析卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素；Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清miR-433、miR-455表達(dá)水平比較

觀察組血清miR-433（1.30±0.39）、miR-455表達(dá)水平（0.56±0.12）低于對(duì)照組（miR-433：6.24±1.38，miR-455：1.20±0.21），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.946、24.539，Plt;0.05）。

2.2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組超聲造影定量參數(shù)及血清miR-433、miR-455表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)移組的基礎(chǔ)強(qiáng)度低于非轉(zhuǎn)移組，達(dá)峰時(shí)間短于非轉(zhuǎn)移組，血清miR-433、miR-455表達(dá)水平低于非轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.3卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素分析

以卵巢癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為因變量（否=0，是=1），以血清miR-433、miR-455水平、基礎(chǔ)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間作為自變量（連續(xù)變量原值帶入）進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-433、miR-455、基礎(chǔ)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間均為卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立保護(hù)因素（Plt;0.05）。見表2。

2.4各指標(biāo)對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

采用二元logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測(cè)方程：Logit（P）=-4.605-0.327×miR-433-0.453×miR-455-0.309×基礎(chǔ)強(qiáng)度-0.355×達(dá)峰時(shí)間。四者聯(lián)合診斷的曲線下面積最大，診斷效能最佳，見表3。

3討論

miRNAs在多種機(jī)體生理和病理過程中起作用，研究表明，miRNAs作為抑癌基因或致癌基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮作用［11］。馬保錄等研究表明，miR-433的表達(dá)在膀胱癌患者中呈低表達(dá)，其表達(dá)與膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。趙軼峰等研究顯示，胃癌組織中miR-433表達(dá)降低，上調(diào)miR-433可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲［13］。且上調(diào)miR-433的表達(dá)后，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和增殖［14］。本研究結(jié)果提示，血清miR-433可能參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，且血清miR-433的表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，血清miR-433有望作為診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

miR-455已被證明在多種腫瘤中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-455在乳腺癌組織和細(xì)胞中下調(diào)，過表達(dá)miR-455可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，低表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的增殖［15］。miR-455在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進(jìn)展中起作用，miR-455的表達(dá)在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中急劇降低，且低表達(dá)與患者總生存率較差有關(guān)，過表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞的增殖和遷移［16］。miR-455在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中降低，miR-455的下調(diào)與患者預(yù)后較差有關(guān)，在體內(nèi)和體外均能抑制肝細(xì)胞癌的增殖及細(xì)胞侵襲能力［17］。本研究結(jié)果提示miR-455下調(diào)可能有助于卵巢癌的進(jìn)展，miR-455的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，血清miR-455水平對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的診斷價(jià)值。

本研究中miR-433、miR-455及基礎(chǔ)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間聯(lián)合診斷的曲線下面積最大，說明在超聲診斷的基礎(chǔ)上增加miR-433、miR-45檢測(cè)能夠提高對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能。

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（2023-04-15收稿）