李超然,閆 蕾,王 惠,王學(xué)鍔,蘆 莎,謝琳霞,王 青,朱運(yùn)奎,于 軍,Ronald F Ertl(美國)

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)三科,陜西 西安 710100;2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心,陜西 西安 710100;3.美國內(nèi)布拉斯加州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)部,內(nèi)布拉斯加州 奧馬哈 72662)

新型冠狀病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)感染引起的重癥型肺炎,發(fā)病機(jī)理是機(jī)體免疫系統(tǒng)在病毒入侵后被激活,釋放多種炎性細(xì)胞因子,引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴(Cytokine storm),造成內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)損傷,毛細(xì)血管滲漏,繼而發(fā)生肺水腫,呼吸衰竭[1-6]。在諸多的細(xì)胞因子中,目前已知白細(xì)胞介素-6(Interleukin6,IL-6),腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),γ干擾素(γInterferon,INFγ) 等是最主要的炎性介質(zhì)[1-5]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)也參與了肺損傷[ 7]。但細(xì)胞因子損傷機(jī)制仍不完全清楚。肺泡間質(zhì)是維持肺泡結(jié)構(gòu)完整和功能正常的重要成分,因此細(xì)胞因子損傷肺組織的可能機(jī)理脂之一,是通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase system,MMPs)直接參與肺泡組織細(xì)胞外基質(zhì)降解[8-11],從而損傷肺泡組織。MMPs在TNF-α,IL-1β等炎癥因子刺激下大量產(chǎn)生,直接作用于肺間質(zhì),降解基質(zhì),破壞血管內(nèi)皮和肺泡上皮的完整性,通透性增加,血管內(nèi)液體滲出至組織間隙以及肺泡內(nèi),造成肺泡和間質(zhì)水腫,這是ARDS的病理基礎(chǔ)[12-14]。臨床觀察到,重癥COVID-19肺部感染后,常繼發(fā)肺纖維化,其原因?yàn)樾迯?fù)過程中組織不適當(dāng)?shù)闹厮芩隆Ｔ诮M織修復(fù)重塑過程中,MMPs作用至關(guān)重要[13]。本研究旨在建立肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary mircovascular endothelia cells,HPMEC )-肺成纖維細(xì)胞(Human fetal lung fibroblasts,HFL)-Ⅰ型膠原組成的三維立體(Three dimentional culture,3D)培養(yǎng)模型,模擬肺泡血管內(nèi)皮和間質(zhì)層結(jié)構(gòu),以IL-6、IL-1β、TNF-α和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil ealtase, NE)分別進(jìn)行刺激后,觀察組織細(xì)胞MMP2分泌變化,觀察哪些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)MMP2產(chǎn)生,從而探討細(xì)胞因子誘導(dǎo)MMPs肺損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM和 DMEM/F12購自gibco(中國上海公司);鼠尾Type I Collagen 購自Discovery Lab ware公司; TNF-α 購自Gibco(中國上海公司);IL-6,IL-1β,購自Thermofisher (中國上海公司);NE購自 Bivision USA(中國上海公司)。HFL購自BNCC(中國上海細(xì)胞),HPMEC購自BNCC(中國上海細(xì)胞)。得到原代培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行傳代培養(yǎng),用第4～8代細(xì)胞進(jìn)行三維立體培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)材料購自NEST(西安博達(dá)公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 HFL和HPMEC三維立體混合培養(yǎng)模型:培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后移除含血清培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基DMEM/F12,細(xì)胞稀釋成為5×105/ml細(xì)胞懸液8 ml,在冰盒低溫條件下進(jìn)行操作。依次按比例1∶20∶5加入0.1mol/L NaOH 0.08 ml,5%Ⅰ型膠原1.52 ml,5×DMEM 0.4 ml, 混勻,最終使DMEM為×1濃度,pH為7.4,最后加入含HFL的無血清DMEM細(xì)胞混懸液8 ml,使膠原濃度為0.75 g/ml,使細(xì)胞濃度為4×105/ml?；靹蚝笠悦靠?.5 ml含HFL的膠原溶液分配至24孔培養(yǎng)板內(nèi),放置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)30 min,三維立體半固體膠原形成。于膠原孔上面內(nèi)加入含HPMEC的無血清DMEM混懸液(細(xì)胞濃度為4×105/ml)1 ml。待內(nèi)皮細(xì)胞完全貼附于立體膠原上面后,培養(yǎng)液中加入不同細(xì)胞因子(TNF-α 20 ng/ml,IL-1β10 ng/ml,IL-6 20 ng/ml,或NE 2 ng/ml),放置在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)(5% CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞在膠原內(nèi)生長狀況,3 d后,收集培養(yǎng)上清液,備明膠酶譜檢測用。

1.2.2 明膠酶譜法制備:用明膠溶液制成3%明膠凝膠膜,標(biāo)本槽內(nèi)加入25 μl上述標(biāo)本/緩沖液,在120 V電壓下電泳約3 h,取出凝膠,以2.5% Triton ×100進(jìn)行脫洗,然后加入含鋅、鈣的孵育液,搖床內(nèi)37 ℃放置12 h過夜。用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色和脫色,取得理想條帶凝膠,照相分析。

2 結(jié) 果

2.1 3D培養(yǎng)下HFL和HPMEC的形態(tài)變化 三維立體培養(yǎng)條件下,HFL單獨(dú)或混合培養(yǎng)條件下,生長在膠原內(nèi)以三維方向伸開,呈條索狀、網(wǎng)狀(圖1A、C);HPMEC在膠原面上生長,基底部植于膠原基質(zhì),上部暴露于培養(yǎng)液,鏡下觀察到HPMEC呈橢圓狀伸展于膠原內(nèi),趨于形成環(huán)狀,生長良好且有明顯增殖(圖1B、D)?；旌?D培養(yǎng)時(shí),可以看到HFL和HPMEC共存的狀態(tài)(圖1C、D)。

注:A為三維立體混合培養(yǎng)中HFL位于膠原內(nèi),呈條索狀,三維分布呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu); B為三維立體培養(yǎng)中HPMEC,胞體較短嵌于膠原,呈環(huán)狀分布;C為HFL和HPMEC混合三維立體培養(yǎng)中的HFL,通過變焦觀察表面和深部細(xì)胞狀態(tài),HFL的基本形態(tài)和單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相似,混合培養(yǎng)時(shí)與血管內(nèi)皮細(xì)胞交織共存;D為混合3D培養(yǎng)時(shí)的HPMEC呈現(xiàn)良好生長狀態(tài),較起初時(shí)細(xì)胞密度增加,也呈環(huán)狀分布,表層也可看到成纖維細(xì)胞,深層則以成纖維細(xì)胞為主,血管內(nèi)皮細(xì)胞不向膠原深部生長圖1 HFL、HPMEC單獨(dú)或混合3D培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

2.2 兩種不同細(xì)胞單獨(dú)或混合3D培養(yǎng)時(shí)MMP2變化 HPMEC與Ⅰ型膠原 3D培養(yǎng),細(xì)胞數(shù)為4×105/ml。培養(yǎng)液為無血清DMEM,3 d后收集培養(yǎng)液,制備明膠酶譜檢測MMP2,結(jié)果顯示,單獨(dú)HPMEC 3D培養(yǎng)時(shí)MMP2的分泌量極少(圖2)。HFL與Ⅰ型膠原3D培養(yǎng),細(xì)胞數(shù)為4×105/ml。培養(yǎng)液為無血清DMEM,3 d后收集培養(yǎng)液,制備明膠酶譜檢測MMP2。結(jié)果顯示,HFL單獨(dú)3D培養(yǎng)中,能分泌較多的MMP2(圖3)。HPMEC/HFL以不同細(xì)胞濃度組合進(jìn)行3D混合培養(yǎng),+表示該細(xì)胞為常規(guī)數(shù)量4×105/ml,1/4、1/2, 2×,4×表示該細(xì)胞數(shù)量為常規(guī)的倍數(shù);培養(yǎng)液為無血清DMEM,3 d后收集培養(yǎng)液,制備明膠酶譜檢測MMP2。結(jié)果顯示,HPMEC數(shù)量不變,隨著HFL數(shù)量的增加,MMP2的分泌量相應(yīng)增加(圖4)。HFL數(shù)量不變,HPMEC數(shù)量增加,MMP2的產(chǎn)量沒有明顯變化(圖4)。以上實(shí)驗(yàn)證明,在混合3D培養(yǎng)條件下,MMP2主要由HFL產(chǎn)生,HPMEC只產(chǎn)生極微量MMP2。

注:M為標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白標(biāo)記 ;72 kDa 為MMP2圖2 單獨(dú)HPMEC 3D培養(yǎng)時(shí)MMP2的表達(dá)

注:M為標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白標(biāo)記;72 kDa 為MMP2; 82 kDa 為MMP2 前體圖3 單獨(dú)HFL3D培養(yǎng)時(shí)MMP2的表達(dá)及其細(xì)胞因子對(duì)MMP2的影響

注:M為分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);72 kDa為MMP2圖4 HPMEC/HFL混合3D培養(yǎng)不同細(xì)胞數(shù)時(shí)MMP2的表達(dá)

2.3 細(xì)胞因子對(duì)MMP2的影響 單獨(dú)HFL 3D培養(yǎng)時(shí),可以產(chǎn)生一定量的MMP2,TNF-α,IL-1β可以誘導(dǎo)HFL產(chǎn)生更多MMP2,條帶明顯增加,但I(xiàn)L-6促進(jìn)HFL產(chǎn)生MMP2的作用不明顯(圖3)。NE具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)MMP2產(chǎn)生的作用,條帶明顯增寬(圖3);如果聯(lián)合TNF-α或IL-1β,誘導(dǎo)產(chǎn)生更多MMP2,3種細(xì)胞因子與NE聯(lián)合均明顯增寬MMP2的條帶(圖3)。但在單獨(dú)HPMEC 3D培養(yǎng)時(shí),各種細(xì)胞因子均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的MMP2(圖2)。HPMEC/HFL(4×105/ml)進(jìn)行3D混合培養(yǎng),在無血清DMEM培養(yǎng)液中分別加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、NE(2 μmol),然后在3種炎性因子刺激的基礎(chǔ)上再加入IL-6(20 ng/ml),3 d后收集培養(yǎng)液,制備明膠酶譜檢測MMP2,結(jié)果顯示,IL-1β、TNF-ɑ、NE 均可誘導(dǎo)MMP2的產(chǎn)生,IL-6則無明顯誘導(dǎo)增強(qiáng)作用(圖5),即使加倍劑量亦不能(圖6)。若先加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、IL-6(20 ng/ml),再將NE(2 μmol)加入已有其他炎性細(xì)胞因子的培養(yǎng)液中,結(jié)果顯示NE加入使MMP2得分泌量顯著增加,且與TNF-ɑ、IL-1β有協(xié)同作用(圖7)。試驗(yàn)證明TNF-α、IL-1β、NE均可誘導(dǎo)HFL產(chǎn)生更多MMP2,尤其NE作用更為明顯,不同炎癥因子聯(lián)合作用時(shí)效果更佳,IL-6不具備誘導(dǎo)HFL產(chǎn)生MMP2的作用。

注:M為分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);82 kDa為 MMP2前體;72 kDa為MMP2;54 kDa為MMP2活化部分圖5 不同細(xì)胞因子對(duì)HPMEC/HFL3D混合培養(yǎng)下MMP2表達(dá)的影響

注:M為分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);72 kDa為MMP2圖6 不同濃度IL-6對(duì)HFL/HPMEC混合3D培養(yǎng)下MMP2表達(dá)的影響

注:M為分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn); 72 kDa為MMP2;82 kDa為MMP2 前體圖7 NE對(duì)HPMEC/HFL混合3D培養(yǎng)時(shí)MMP2表達(dá)的影響

2.4 NE對(duì)HPMEC/HFL混合3D培養(yǎng)時(shí)MMP2的影響 HPMEC/HFL混合3D培養(yǎng),在不同條件下再加入NE,均可使MMP2條帶增寬,與TNF-α 和IL-1β共同刺激下能產(chǎn)生更多MMP2,且活化條帶增加,IL-6不增加MMP2,但NE與IL-6共同作用,MMP2條帶明顯增厚。表明NE可以誘導(dǎo)HFL 產(chǎn)生MMP2,也有促進(jìn)其活化作用(圖7)。

3 討 論

本研究設(shè)計(jì)模擬肺泡毛細(xì)血管和間質(zhì)結(jié)構(gòu),將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于肺成纖維細(xì)胞和Ⅰ型膠原三維立體培養(yǎng)膠上,形成微血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、基質(zhì)膠原共同構(gòu)成的3D模型,在不同細(xì)胞因子刺激下,觀察了MMP2的誘導(dǎo)與活化。通過單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞呈比例增減的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞只能生成微量的MMP2,在細(xì)胞因子刺激下也不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的MMP2,這可能與其結(jié)構(gòu)功能相適應(yīng)。在病理性損傷中,如果內(nèi)皮附著的基質(zhì)完好,損傷較輕也容易修復(fù),如果基質(zhì)部分被降解破壞,證明損傷嚴(yán)重,就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毛細(xì)血管滲漏[6]。

本研究表明,在內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合3D培養(yǎng)模型中,肺成纖維細(xì)胞是生成MMP2的主要組織細(xì)胞。這與其支撐維持基質(zhì)結(jié)構(gòu)和重塑功能相關(guān)。正常狀態(tài)下,成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生一定量的MMP2,用于維持基質(zhì)成分的降解更新。當(dāng)遇到細(xì)胞因子風(fēng)暴后, 在TNF-α,IL-1β等細(xì)胞因子刺激下,產(chǎn)生大量的MMP2,同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的其他MMPs,降解更多的基質(zhì)成分[8-13], 尤其是支撐毛細(xì)血管壁的基質(zhì)膠原成分,進(jìn)而加重附著在基質(zhì)的內(nèi)皮和上皮細(xì)胞損傷,發(fā)生急性肺損傷、肺泡水腫、急性呼吸窘迫綜合征(ADRS)[12-14]。肺成纖維細(xì)胞參與炎性細(xì)胞因子肺損傷的作用需要高度重視和進(jìn)一步研究。

采用盲腸結(jié)扎壞死誘導(dǎo)的膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn),IL-6、IL-10、TNF-α,MCP-1 等細(xì)胞因子顯著升高,參與急性肺損傷[15]。細(xì)胞因子風(fēng)暴在各種急性嚴(yán)重感染所致的膿毒癥病理過程中,參與組織損傷、引起器官功能障礙和衰竭,是致病的關(guān)鍵因子。但是,細(xì)胞因子是如何損傷組織和細(xì)胞的機(jī)理極為復(fù)雜,不同細(xì)胞因子作用途徑不同,細(xì)胞因子之間也有協(xié)同或抑制的機(jī)制?；|(zhì)金屬蛋白酶損傷機(jī)理是直接降解維持組織結(jié)構(gòu)完整的基質(zhì)成分,從而造成組織破壞損傷[12]。本研究探討了細(xì)胞因子風(fēng)暴中,哪種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)MMP2。結(jié)果證明TNF-α、IL-1β是誘導(dǎo)MMP2最主要的細(xì)胞因子,與以前作者的研究以及文獻(xiàn)報(bào)告一致[16],TNF-α、IL-1β可以誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞和支氣管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生大量MMP1,2,3,9,導(dǎo)致三維立體培養(yǎng)的膠原大量降解。如果這種情況出現(xiàn)在肺泡,肺泡基質(zhì)被降解,通透性增加,肺泡會(huì)發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。在臨床,IL-1β和TNF-α并沒有得到高度重視,不是常規(guī)檢測因子,也沒有列為重癥肺炎檢測的預(yù)警指標(biāo)。在新冠病毒感染和膿毒癥臨床研究中發(fā)現(xiàn),IL-6是重要的促炎因子,是多效性細(xì)胞因子,可能通過促進(jìn)漿細(xì)胞存活、促炎性T淋巴細(xì)胞的分化和激活,分泌更多的TNF-α、IL-1β,在MODS病理生理學(xué)中發(fā)揮多重作用[17]。IL-6可激活T細(xì)胞,大量產(chǎn)生更多炎性細(xì)胞因子,從而形成炎癥風(fēng)暴,導(dǎo)致嚴(yán)重肺部和其他器官的免疫損傷[3-4]。本研究證明,IL-6不能直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP2,其對(duì)MMP2的作用可能是通過誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-1β從而誘導(dǎo)MMPS間接損傷肺泡組織。與IL-6不同,炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α可以直接上調(diào)成纖維細(xì)胞MMP2表達(dá),導(dǎo)致基底膜膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的降解,引發(fā)組織通透性滲出、水腫,在這一病理機(jī)制中占主導(dǎo)作用。

繼發(fā)于新冠病毒感染的肺纖維化發(fā)病率高達(dá)44.9%[17-18],比特發(fā)纖維化的發(fā)病率還要高,因?yàn)樾鹿诓《靖腥救丝诨鶖?shù)巨大,發(fā)生纖維化的絕對(duì)數(shù)也多,值得高度重視和深入研究。臨床觀察到細(xì)胞因子風(fēng)暴的強(qiáng)弱與新冠肺炎疾病嚴(yán)重程度相關(guān),而新冠肺炎病情嚴(yán)重程度與繼發(fā)纖維化相關(guān),病情越重,纖維化發(fā)生率越高,纖維化程度也越嚴(yán)重[19-20]。研究也表明,肺纖維化與MMPs活性直接相關(guān)[18]。在炎癥期,MMPs主要降解基質(zhì)。在損傷修復(fù)期,MMPs參與組織重塑,如果重塑失控,就會(huì)導(dǎo)致纖維化。纖維化的肺組織內(nèi)膠原沉積增厚,成纖維細(xì)胞增值,膠原濃度增加,肺泡組織收縮變小,間隔變厚,彈性變差,影響氣體交換,出現(xiàn)低氧血癥和呼吸衰竭。臨床觀察到,繼發(fā)于新冠肺炎的間質(zhì)性肺纖維化有部分可逆性,說明重塑功能正常時(shí),組織結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行重構(gòu),重構(gòu)過程首先需要把過多、過厚的纖維基質(zhì)降解,然后重新構(gòu)建肺泡組織。降解過程主要依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)量和活性。所以在肺纖維化病理過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的作用至關(guān)重要?；|(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)龐大的家族,約有二十余種不同結(jié)構(gòu)的MMPs,不同MMPs的作用機(jī)制基本相同,降解基質(zhì)成分。但不同MMPs,針對(duì)的降解成分有所不同,MMP2主要是降解基質(zhì)中最重要的成分-膠原,其活性在許多疾病中起重要作用。

本研究建立的HFL與HPMEC在Ⅰ型膠原三維立體培養(yǎng)體外模型,模擬細(xì)胞因子損傷時(shí)MMP2的產(chǎn)生細(xì)胞來源主要是HFL、HPMEC產(chǎn)生的MMP2量很少,對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)反應(yīng)也不強(qiáng),表明組織損傷時(shí)產(chǎn)生的MMP2主要來自間質(zhì)細(xì)胞?；|(zhì)組織的成分的合成與降解主要由成纖維細(xì)胞分泌的MMPS調(diào)控。風(fēng)暴細(xì)胞因子中IL-6的作用通過調(diào)控其他炎性介質(zhì)損傷肺組織,因?yàn)樗亲钤缬裳准?xì)胞產(chǎn)生的促炎因子。

本研究通過HFL與MPEC 3D培養(yǎng)模型證實(shí),作為細(xì)胞因子風(fēng)暴的重要成分,TNF-α、IL-1β及NE能誘導(dǎo)組織細(xì)胞HFL分泌更多的MMP2,在此模型IL-6不誘導(dǎo)HFL分泌MMP2,其損傷機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α參與肺泡組織基質(zhì)的降解損傷,HPMEC不能被細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生更多MMP2。MMPs既是急性肺損傷形成的基礎(chǔ),又是形成肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵組織蛋白酶。

在新冠病毒感染的重癥患者,繼發(fā)肺纖維化發(fā)生率明顯高于其他原因引起的肺炎,其機(jī)理尚不清除,MMPs可能起關(guān)鍵作用[17-20]。因此研究有關(guān)MMPs的肺損傷和肺纖維化機(jī)制具有重要要義。細(xì)胞因子風(fēng)暴包含了多種炎性細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎性介質(zhì),在它們的共同作用下引起肺損傷和ARDS,網(wǎng)絡(luò)型細(xì)胞因子調(diào)控?fù)p傷機(jī)理極為復(fù)雜,MMPS也受多重因素的調(diào)控,本研究只選擇了IL-1β、TNF-α、IL-6、NE等幾種最常見的炎性介質(zhì),也只選擇了MMP2一種代表性MMPs,需要進(jìn)一步擴(kuò)大深入研究。