溫增欣，索全義，萬宇宸，王艷紅

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)土壤質(zhì)量與養(yǎng)分資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)生態(tài)安全與綠色發(fā)展自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

近年來，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，為了預(yù)防動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，抗生素被廣泛使用[1-2]。但抗生素很難被動(dòng)物吸收，有30%~90%的抗生素以原形通過糞便和尿液排出體外，導(dǎo)致抗生素在畜禽糞便中大量殘留，造成環(huán)境污染[3-5]。

畜禽糞便可通過好氧堆肥工藝進(jìn)行資源化利用，堆肥過程是利用好氧微生物來降解有機(jī)物的過程，國(guó)內(nèi)外已有許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究[6-7]。梁天等[8]發(fā)現(xiàn)堆肥C/N 為35 時(shí)的堆肥效果最好，徐寧[9]的研究指出堆肥pH 應(yīng)控制在5.5~9.0。上述研究表明，適宜的溫度與C/N 是堆肥正常進(jìn)行的必要條件?？股厥强梢宰柚蛊渌罴?xì)胞發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)，它可以改變微生物的種類、數(shù)量以及群落結(jié)構(gòu)功能，使堆肥方向發(fā)生改變，因此抗生素對(duì)堆肥過程的影響引起了關(guān)注[10]。時(shí)紅蕾等[11]發(fā)現(xiàn)堆肥中存在的抗生素顯著抑制了堆體溫度的升高，增加了水溶性碳的殘留，并阻礙了脫氫酶和脲酶活性。曹永森[12]也發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)堆體溫度影響較大，且對(duì)過氧化氫酶、蛋白酶、脲酶、纖維素酶以及蔗糖酶的活性普遍存在抑制現(xiàn)象。此外，還有研究證明磺胺二甲嘧啶的存在擾亂了堆體微生物多樣性，短期內(nèi)延緩了堆肥進(jìn)程[13]。因此，畜禽糞便中殘留的抗生素會(huì)對(duì)堆體理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，但不同類型的抗生素對(duì)堆體產(chǎn)生的影響是否相同并不明確。

四環(huán)素類抗生素是畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用量最大的抗生素之一[14]，但有關(guān)四環(huán)素類抗生素對(duì)堆肥過程影響的研究相對(duì)較少，因此本研究將四環(huán)素和土霉素分別添加到畜禽糞便中，監(jiān)測(cè)好氧堆肥過程中溫度、pH、電導(dǎo)率、C/N、過氧化氫酶、脲酶等決定好氧堆肥良好運(yùn)行的重要參數(shù)，為含四環(huán)素類抗生素的畜禽糞便資源化和無害化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥裝置

采用自制的保溫泡沫箱堆肥反應(yīng)器，泡沫箱尺寸為535 mm×395 mm×400 mm，在泡沫箱側(cè)方插入兩支水銀溫度計(jì)，并在泡沫箱上打小孔保持通風(fēng)環(huán)境。

1.2 供試材料

供試抗生素為土霉素和四環(huán)素，抗生素購于獸藥店，四環(huán)素規(guī)格≥98%，土霉素規(guī)格≥50%。

堆肥原料：以風(fēng)干羊糞為主材料，玉米秸稈為輔材料進(jìn)行堆料C/N的調(diào)節(jié)。堆肥原料的基本性質(zhì)見表1。

表1 堆肥原料的基本性質(zhì)（干基）Table 1 Basic properties of compost materials（dry base）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)遮雨棚進(jìn)行，采用好氧堆肥的方式。每個(gè)堆肥反應(yīng)器中加入10 kg 風(fēng)干羊糞，每千克羊糞中加入218 g 玉米秸稈混合，調(diào)整C/N 約為30，將初始含水率調(diào)整為60%左右。四環(huán)素類抗生素添加量為10 mg·kg-1（按照各地區(qū)抽樣檢測(cè)平均殘留水平添加，具體見表2）。根據(jù)堆肥溫度變化進(jìn)行翻堆。

表2 各地區(qū)抽樣檢測(cè)抗生素殘留水平Table 2 Antibiotic residue levels in all region by sampling

試驗(yàn)設(shè)置添加四環(huán)素（TC）、添加土霉素（OC）和不加抗生素（CK）3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)。試驗(yàn)從2021 年7 月10 日至8 月13 日，共堆制35 d，于堆肥的第0、3、7、14、24、35 天，在堆體中對(duì)角線三點(diǎn)通體取樣約200 g。取得的樣品均勻混合，風(fēng)干后用于各項(xiàng)指標(biāo)的分析測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

溫度的測(cè)定使用水銀溫度計(jì)，每天14：00 測(cè)定堆體中層偏下點(diǎn)位溫度及室內(nèi)溫度；pH 采用pH計(jì)測(cè)定，電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀測(cè)定，水土比均為10∶1；總有機(jī)碳采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，全氮采用凱氏定氮法測(cè)定；總腐植酸的測(cè)定采用焦磷酸鈉浸提-重鉻酸鉀容量法；酶活性測(cè)定參照關(guān)松蔭[19]的方法，脲酶采用納氏比色法，過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法。

積溫計(jì)算方法如下：

式中：k為堆肥第j天時(shí)堆體溫度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行基本運(yùn)算和制圖，采用SAS 通過單因素方差分析法進(jìn)行相同時(shí)間、不同處理間差異顯著性檢驗(yàn)，以評(píng)估Duncan 多重極差檢驗(yàn)在0.05水平上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素類抗生素對(duì)堆肥溫度的影響

溫度是影響堆肥過程的重要因素之一，它影響微生物的代謝活動(dòng)及有機(jī)物的降解速率，并對(duì)堆肥的腐殖化程度起著決定性作用[20]。從圖1 可知，各處理溫度變化趨勢(shì)基本相同，均經(jīng)歷升溫期、高溫期、降溫期和后熟期4個(gè)階段。

圖1 抗生素對(duì)堆肥過程中溫度的影響Figure 1 Effects of antibiotics on temperature during composting

3 個(gè)處理均經(jīng)歷1 d 的升溫期后進(jìn)入高溫期（表3），CK、TC 和OC 處理均在堆肥第3天達(dá)到最高溫度，分別為56、53、55 ℃。從表3可以看出，各處理的高溫期持續(xù)時(shí)間表現(xiàn)出差異，持續(xù)時(shí)間由長(zhǎng)到短排序?yàn)镃K>OC>TC，其中，CK 處理與TC、OC 處理之間差異達(dá)到顯著水平，由此可知抗生素的添加抑制了堆體溫度的上升，縮短了堆體的高溫期持續(xù)時(shí)間。將各處理高溫期積溫進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素與土霉素的加入并未顯著影響堆肥高溫期積溫的變化。在降溫期與后熟期，抗生素對(duì)溫度的影響較小，3 個(gè)處理溫度基本一致，與CK 處理總積溫相比，TC 處理顯著下降49.3 ℃。由此得知，抗生素主要在堆肥前期對(duì)堆體溫度產(chǎn)生一定程度的影響，且四環(huán)素對(duì)堆體溫度的影響大于土霉素。

表3 抗生素對(duì)堆體關(guān)鍵溫度參數(shù)的影響Table 3 Effects of antibiotics on key temperature parameters of the reactor

2.2 四環(huán)素類抗生素對(duì)堆肥過程中化學(xué)性質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)pH的影響

pH 也是影響堆肥過程的重要因素，表4為3個(gè)處理pH 的變化趨勢(shì)。抗生素對(duì)pH 的影響主要在堆肥的3~14 d，在堆肥第3 天時(shí)，CK、TC、OC 處理的pH 分別為8.65、8.60、8.55，相比CK 處理，OC 處理顯著降低了0.10 個(gè)單位，TC 處理pH 有所降低，但并未達(dá)到顯著水平。隨著堆肥的進(jìn)行，各處理pH開始上升，在堆肥第7 天時(shí)，CK、TC、OC 處理的pH 分別達(dá)到8.73、8.65、8.68，與CK 處理相比，添加抗生素處理的pH 相對(duì)較低。在堆肥第14 天時(shí)各處理pH 達(dá)到峰值，分別為9.15、9.10、8.99。與CK、TC處理相比，OC處理顯著降低，降幅為0.11~0.16 個(gè)單位。14 d 后各處理間pH差異逐漸縮小，至堆肥結(jié)束時(shí)CK、TC 和OC 處理的pH 分別為8.77、8.73、8.78。上述結(jié)果表明，土霉素的添加能夠輕度降低堆體的pH。

表4 抗生素對(duì)堆體pH的影響Table 4 Effects of antibiotics on heap pH

2.2.2 對(duì)電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率反映了堆肥浸提液中可溶性鹽的含量，與堆肥原料性質(zhì)及發(fā)酵過程相關(guān)[21]。由圖2 可知，3 個(gè)處理的堆體電導(dǎo)率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，0~7 d 堆體電導(dǎo)率上升，14~35 d 堆體電導(dǎo)率下降?？股貙?duì)堆體電導(dǎo)率的影響主要在堆肥第14 d 時(shí)，此時(shí)，CK、TC、OC 處理的電導(dǎo)率分別為2.94、3.83、4.74 mS·cm-1，受四環(huán)素類抗生素影響，堆體第14 天時(shí)的電導(dǎo)率有所增加，與CK 處理相比，OC 處理電導(dǎo)率增加較為明顯，顯著高于CK 處理1.80 mS·cm-1（P<0.05），而TC 處理電導(dǎo)率增加了0.89 mS·cm-1，并未達(dá)到顯著水平。堆肥14 d 后，3 個(gè)處理電導(dǎo)率差異開始減小，直至堆肥結(jié)束時(shí)，CK、TC、OC 處理的電導(dǎo)率分別為4.38、4.40、4.60 mS·cm-1。

圖2 抗生素對(duì)堆體電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effects of antibiotics on electrical conducivity of pile

2.2.3 對(duì)C/N的影響

碳氮元素是微生物的重要能源物質(zhì)，許多研究將C/N 的變化作為堆肥過程中的重要指標(biāo)。四環(huán)素與土霉素的添加對(duì)堆肥過程中C/N 的影響見圖3，整個(gè)堆肥過程中3 個(gè)處理的變化趨勢(shì)相同，即先降低趨于穩(wěn)定并在后期有短暫上升的趨勢(shì)?？股貙?duì)堆體C/N 的影響主要在堆肥的3~14 d，在堆肥3~7 d 時(shí)，CK、TC 與OC 的C/N 分 別 從26.5、27.7、27.2 降至22.5、25.2、24.4，分別下降15.1%、9.0%、10.3%。在堆肥第14 天時(shí)，CK、TC、OC 處理的C/N 分別為18.6、20.1、20.4，與CK 處理相比，四環(huán)素與土霉素的添加使堆體的C/N 增高。在堆肥第24 天時(shí)CK、TC、OC 處理的C/N 達(dá)到最低值，其比值均降至20 以下，分別為16.9、18.7、18.1。上述結(jié)果說明抗生素的添加使堆體有機(jī)質(zhì)分解速率減慢。

圖3 抗生素對(duì)碳氮比的影響Figure 3 Effects of antibiotics on C/N

2.2.4 對(duì)腐植酸含量的影響

腐植酸及其各組分是腐殖化過程中生成的最具代表性的次生產(chǎn)物，其變化與堆肥的穩(wěn)定性與腐熟程度密切相關(guān)。如圖4 所示，CK、TC、OC 3 個(gè)處理總腐植酸含量均呈現(xiàn)先下降后短暫上升的趨勢(shì)，說明堆料中原本存在的腐植酸并不穩(wěn)定，在前期會(huì)大量礦化分解，后期才能形成穩(wěn)定的腐植酸。在整個(gè)堆肥過程中抗生素的添加并未對(duì)總腐植酸含量產(chǎn)生顯著影響，但在堆肥前期，添加抗生素處理的總腐植酸含量相對(duì)較高，證明TC與OC處理腐植酸礦化分解較弱。在堆肥后期各處理差異逐漸減小，至堆肥結(jié)束時(shí)，腐植酸含量分別為11.5%、10.3%、11.9%。

2.3 四環(huán)素類抗生素對(duì)堆肥過程中酶活性的影響

2.3.1 過氧化氫酶

過氧化氫酶是好氧堆肥過程中的重要酶之一，與堆肥中有機(jī)質(zhì)（主要為木質(zhì)素）的轉(zhuǎn)化速度密切相關(guān)。從圖5 可以看出，在整個(gè)堆肥過程中，抗生素對(duì)過氧化氫酶產(chǎn)生影響的時(shí)期主要在7~24 d。在堆肥第7天時(shí)，添加抗生素處理組的酶活性相對(duì)較低，其中TC處理的過氧化氫酶活性為3.22 mg·g-1·min-1，與CK 相比顯著降低0.24 mg·g-1·min-1。CK、TC 和OC 處理在堆肥第14 天時(shí)的過氧化氫酶活性分別為3.41、3.17、3.28 mg·g-1·min-1，相比CK 處理，TC 和OC 處理分別降低7.0%、3.8%，顯著抑制了堆體的過氧化氫酶活性（P<0.05）。在堆肥第24天時(shí)，CK、TC、OC處理的過氧化氫酶活性分別為3.80、3.42、3.79 mg·g-1·min-1，證明過氧化氫酶活性受到了四環(huán)素與土霉素抑制，但TC和OC 處理影響程度不同，其中TC 處理顯著低于CK處理，降低了10.0%，而OC 處理降低幅度較小，未達(dá)到顯著水平。

圖5 抗生素對(duì)過氧化氫酶活性的影響Figure 5 Effects of antibiotics on catalase activity

圖6 抗生素對(duì)脲酶活性的影響Figure 6 Effects of antibiotics on urease activity

堆肥結(jié)束時(shí)，添加抗生素處理與CK 處理未產(chǎn)生顯著變化，但TC 處理與OC 處理產(chǎn)生差異，TC 處理顯著低于OC 處理0.24 mg·g-1·min-1（P<0.05），抑制了堆體的過氧化氫酶活性?？傮w來看，四環(huán)素類抗生素的添加抑制了堆肥過程中過氧化氫酶活性，且四環(huán)素和土霉素對(duì)過氧化氫酶活性的影響表現(xiàn)出差異，過氧化氫酶活性受四環(huán)素的影響較大。

2.3.2 脲酶

脲酶作為水解酶是堆肥過程中含氮有機(jī)物礦化的關(guān)鍵酶，與堆肥過程中的氮元素密切相關(guān)，其活性可以表明含氮有機(jī)物降解的速度與強(qiáng)度[22]。在發(fā)酵前期各處理間脲酶活性差異較小，主要在堆肥第14天和第35天時(shí)有顯著影響。在堆肥第14天時(shí)，CK處理和OC 處理的脲酶活性分別為43.73、42.12 mg·g-1·d-1，TC 處理脲酶活性最高，達(dá)到62.12 mg·g-1·d-1，此時(shí)，TC 處理脲酶活性顯著高于CK 處理18.39 mg·g-1·d-1（P<0.05），促進(jìn)了堆體脲酶活性，OC 處理與CK 相比未達(dá)顯著水平，但與TC 處理相比產(chǎn)生差異，TC 處理脲酶活性顯著高于OC 處理，證明不同種類抗生素對(duì)堆體脲酶活性的影響有所差異。

堆肥結(jié)束時(shí)，CK、TC 和OC 處理的脲酶活性分別為22.80、40.18、43.74 mg·g-1·d-1，說明四環(huán)素類抗生素的添加促進(jìn)了堆體脲酶活性，與CK 相比，TC 和OC 處理分別顯著增加17.38、20.94 mg·g-1·d-1（P<0.05）。綜上所述，四環(huán)素類抗生素的添加促進(jìn)了堆體脲酶活性。

3 討論

溫度的變化反映了堆肥進(jìn)程，是堆肥過程中需要監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗生素對(duì)堆體溫度的影響主要表現(xiàn)在堆肥前期，四環(huán)素和土霉素的添加縮短了堆肥高溫期持續(xù)時(shí)間，添加抗生素并未對(duì)高溫期積溫產(chǎn)生顯著影響，但3 個(gè)處理堆體的總積溫表現(xiàn)出差異，其中CK處理總積溫高于TC和OC處理，且與TC處理達(dá)到顯著差異水平。證明四環(huán)素和土霉素的添加均能抑制堆體溫度的升高。這與馬駿[23]的研究結(jié)果一致，但馬駿的研究中添加抗生素組溫度下降得較為明顯，而在本試驗(yàn)中抗生素組溫度下降幅度較小，這可能是馬駿的研究中抗生素添加量較大的原因。在堆肥后熟期所有處理均達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的溫度并逐漸接近室溫，Sun 等[24]的研究也得到相同的結(jié)果。這是由于隨著堆肥過程的進(jìn)行，抗生素逐漸降解，濃度減小，對(duì)微生物活動(dòng)的抑制作用減弱[25]。楊振邊[26]曾指出抗生素的降解主要發(fā)生在堆肥高溫期，且經(jīng)過50 d堆肥處理，抗生素的去除率高達(dá)92%；Sel-vam 等[27]也發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素較喹諾酮類抗生素更容易被降解，21 d內(nèi)四環(huán)素類抗生素的去除率高達(dá)100%，這為本試驗(yàn)結(jié)果提供了理論支撐。

試驗(yàn)前期pH 出現(xiàn)短暫的下降趨勢(shì)，這是由于微生物的代謝將堆料中的糖類、淀粉等物質(zhì)分解為小分子的脂肪酸，導(dǎo)致堆料在最初幾天產(chǎn)生了酸化現(xiàn)象[28]。本研究結(jié)果表明添加抗生素處理組相比CK 處理pH 上升幅度慢，這可能是由于加入的抗生素抑制了微生物分解含氮有機(jī)物，因此產(chǎn)生的氨相比CK 處理較少。Liu 等[29]曾報(bào)道過抗生素可以抑制氨的釋放，因此pH上升幅度低于對(duì)照處理，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。不同時(shí)期的結(jié)果表明四環(huán)素和土霉素的添加使堆體可溶性鹽含量增加，推測(cè)其原因可能是由于抗生素的添加促進(jìn)了硝化細(xì)菌的增殖，使堆體物料不斷礦化，生成大量的NO-3促使堆體電導(dǎo)率增加[30]。這與李金津等[31]報(bào)道的不同添加量的抗生素并未顯著影響好氧堆肥電導(dǎo)率變化趨勢(shì)的結(jié)論相反，這可能是由堆肥材料不同導(dǎo)致的，李金津等采用的是蚯蚓好氧堆肥，王亞飛等[32]曾報(bào)道不同材料的畜禽糞便在堆肥過程中的各項(xiàng)指標(biāo)變化存在明顯不同。C/N 與總腐植酸的結(jié)果表明，抗生素的加入使堆體有機(jī)物分解速率減慢，并隨著時(shí)間的推移影響逐漸減弱。這與李維華等[33]的研究結(jié)果相同。這與抗生素的加入使堆體中微生物代謝受到影響有關(guān)。林輝等[34]的研究表明磺胺類抗生素的添加抑制了堆體早期微生物代謝，但在14 d 內(nèi)抗生素降解率高達(dá)100%，因此，抑制作用會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。郭夢(mèng)婷等[35]的研究表明抗生素不利于堆肥過程中水分的散失，造成堆肥結(jié)束后堆體高含水率。這為本研究結(jié)果的解釋提供了理論支撐。

好氧堆肥中酶促反應(yīng)的速度可以揭示堆肥過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化程度。從過氧化氫酶活性的結(jié)果來看，抗生素的添加抑制了堆體過氧化氫酶活性，這可能是由于抗生素抑制了微生物分泌相關(guān)酶，進(jìn)而抑制了過氧化氫酶活性。本試驗(yàn)結(jié)果與李亞寧等[36]報(bào)道的磺胺類抗生素濃度的增加使過氧化氫酶活性顯著降低的研究結(jié)果相似。而李敏清等[37]發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶活性與放線菌群有顯著正相關(guān)，因此，可能是抗生素的添加抑制了堆體中放線菌群的活性，使得過氧化氫酶活性降低，這也與Chessa 等[38]報(bào)道的外源四環(huán)素的添加會(huì)對(duì)土壤微生物活性產(chǎn)生不利影響的研究結(jié)果一致。徐晨光等[39]發(fā)現(xiàn)無論較高含量（>10 mg·kg-1）還是較低含量（<1 mg·kg-1）的抗生素均會(huì)顯著抑制微生物活性，使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。添加抗生素處理的脲酶活性要高于CK 組，這可能是由于抗生素的添加刺激了有利于含氮有機(jī)物降解的微生物。這與張凱煜等[40]報(bào)道的低濃度抗生素的添加可以促進(jìn)脲酶活性的研究結(jié)果相似。綜上所述，四環(huán)素類抗生素的添加對(duì)堆體內(nèi)物化指標(biāo)產(chǎn)生了較為復(fù)雜的影響，物化指標(biāo)與微生物活性密切相關(guān)。李文兵等[41]的研究表明評(píng)價(jià)細(xì)菌群落豐富度的Chao1 指數(shù)與腐熟度指標(biāo)之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，因此，四環(huán)素類抗生素的存在可能會(huì)對(duì)堆體腐熟度與品質(zhì)造成影響，王桂珍等[42]曾報(bào)道當(dāng)抗生素含量高于50 mg·kg-1時(shí)會(huì)抑制堆肥過程順利進(jìn)行并影響堆體腐熟度。因此，堆體中物化指標(biāo)的變化與抗生素削減規(guī)律及堆料腐熟度的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

畜禽糞便中10 mg·kg-1四環(huán)素和土霉素的存在會(huì)顯著影響堆肥過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化，四環(huán)素的添加使堆體總積溫顯著下降49.3 ℃，有機(jī)質(zhì)分解速率及礦質(zhì)化過程受到一定程度影響，最高使過氧化氫酶活性降低10.0%，并促進(jìn)脲酶活性增加76.2%，相比之下，土霉素對(duì)好氧堆肥過程中物化指標(biāo)影響較小。因此，不同抗生素對(duì)堆肥過程產(chǎn)生的影響表現(xiàn)出差異，在堆肥過程中要嚴(yán)格監(jiān)控堆肥指標(biāo)變化情況，合理控制堆肥條件，保證堆肥發(fā)酵質(zhì)量。在人為控制和管理的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)預(yù)期的堆肥效果。