楊紹華　桂毅杰　陳?！≈苁绶摇￡愒诮堋⑷A清　王鋒

摘 要：分蘗角度是水稻重要的株型性狀，合適分蘗角是實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)的關(guān)鍵因素。針對(duì)控制水稻分蘗角度的主效基因TAC1的功能位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了基于STARP（Semi-thermal asymmetric reverse PCR）技術(shù)的特異性分子標(biāo)記S-TAC1，并對(duì)56份已測(cè)序常規(guī)水稻品種及164份雜交水稻進(jìn)行了基因型鑒定。S-TAC1準(zhǔn)確地鑒定了56個(gè)已測(cè)序常規(guī)品種的基因型，緊湊純合基因型tac1/tac1 36份，松散純合型TAC1/TAC1 20份，表明S-TAC1分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在164份雜交水稻中，雜合基因型

TAC1/tac1 62份，松散純合型TAC1/TAC1 102份。本研究開發(fā)的功能標(biāo)記為通過分子標(biāo)記輔助選擇培育理想株型的水稻品種提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：水稻；TAC1基因；分子標(biāo)記；STARP（Semi-thermal asymmetric reverse PCR）技術(shù)

中圖分類號(hào)：S 511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2023）04-0007-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.04.002

Development of STARP Markers for TAC1 Gene in Rice andAnalysis of TAC1 Genotypes in

164 Hybrid Rice

YANG Shao-hua， GUI Yi-ie， CHEN Rui， ZHOU Shu-feng， CHEN Zai-jie， LIU Hua-qing， WANG Feng

（Fujian Key Laboratory of Agricultural Genetic Engineering / Institute of Biotechnology，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The tillering angle was an important plant type trait of rice， and the suitable tillering angle was the key factor to achieve the high yield of rice. The specific molecular marker S-TAC1 based on STARP （Semi-thermal asymmetric reverse PCR） technology was designed for the functional site of TAC1， which was the major efficiency gene controlling the tillering angle of rice， and the genotype identification of 56 sequenced conventional rice varieties and 164 hybrid rice varieties were conducted. S-TAC1 accurately identified the genotypes of 56 sequenced conventional varieties， including 36 compact homozygous genotypes tac1/tac1 and 20 incompact homozygous genotypes TAC1/TAC1， which indicated that the S-TAC1 typing results were accurate and reliable. Among 164 hybrid rice varieties， 62 were heterozygous genotypes TAC1/tac1 and 102 were incompact homozygous genotypes TAC1/TAC1. The functional markers developed in this study provided technical support for the cultivation of rice varieties with ideal plant type by molecular marker-assisted selection.

Key words： Rice； TAC1 gene； Molecular marker； STARP （Semi-thermal asymmetric reverse PCR） technology

分蘗角度是指分蘗與主莖之間的夾角，是水稻最直觀的農(nóng)藝性狀之一。較大的分蘗角有利于單個(gè)分蘗獲得更充足的光照，以及良好的通風(fēng)透氣性，但不利于水稻密植，降低了單位面積產(chǎn)量；緊湊型水稻由于分蘗間空間過小，導(dǎo)致光合效率降低，且不利于通風(fēng)透氣，增加了紋枯病等病害的感病概率。因此培育分蘗角度合適的理想株型水稻品種是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。目前，已明確功能的水稻分蘗角控制基因包含有PROG1[1-2]、LPA1[3]、LAZY1[4]、LAZY2[5]、LAZY3[6]、OsLIC[7]、TIG1[8]、TAC1[9]、TAC3[10]和TAC4[11]等。在上述已克隆基因中，大多在野生稻或突變體中克隆獲得，匍匐生長或分蘗角度過大，在栽培稻中缺乏應(yīng)用價(jià)值。TAC1基因是秈稻和粳稻分化的重要基因，粳稻中緊湊型的tac1基因位于3′UTR的內(nèi)含子剪切位點(diǎn)由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致分蘗角降低[9]。大部分粳稻為緊湊型的tac1基因，而秈稻中基因存在分化，大部分為松散型的TAC1基因，但在保持系中有一定比例的緊湊型tac1基因。由于TAC1基因的共顯性，雜合態(tài)基因型分蘗夾角適中，被認(rèn)為是雜種優(yōu)勢(shì)貢獻(xiàn)的重要基因[12]。因此準(zhǔn)確高效鑒定水稻品種中TAC1的基因型對(duì)育種實(shí)踐具有非常重要的參考價(jià)值。

目前，針對(duì)TAC1的基因型已開發(fā)了基于等位基因特異擴(kuò)增的四引物分子標(biāo)記ARMS[13]和PARMS標(biāo)記[14]。前者需要通過電泳，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，而PARMS為商業(yè)化標(biāo)記，依賴于商業(yè)公司，成本相對(duì)較高。STARP技術(shù)[15]為近年來新出現(xiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)，原理與KASP和PARMS類似，也是基于等位基因競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增。STARP技術(shù)的主要特點(diǎn)在于通過在位點(diǎn)特異引物的3′末端的倒數(shù)第3位和第4為分別引入錯(cuò)配堿基，增加2個(gè)不同等位基因擴(kuò)增的差異性，使得利用普通Taq酶也能實(shí)現(xiàn)包括SNP和INDEL在內(nèi)的多種類型的多態(tài)位點(diǎn)分析。由于其低成本和高通量的特點(diǎn)，目前已在小麥等作物中大量應(yīng)用[16-17]。本研究針對(duì)水稻TAC1基因的功能位點(diǎn)開發(fā)了基于STARP技術(shù)的分子標(biāo)記，并鑒定164份雜交稻的基因型，為

TAC1基因的有效利用提供參考，并為分子標(biāo)記輔助選擇提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以93-11、日本晴、蜀恢498及福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已測(cè)序的56份常規(guī)水稻品種作為分子標(biāo)記準(zhǔn)確性的驗(yàn)證材料，164份雜交稻品種為福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室本課題組收集保存。所有材料種植在福州市壽山鄉(xiāng)。

1.2 TAC1基因的STARP分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)TAC1基因第4內(nèi)含子剪切位點(diǎn)堿基A突變?yōu)镚的單堿基變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)STARP引物S-TAC1，截取變異位點(diǎn)5′端19 bp作為位點(diǎn)特異擴(kuò)增引物。位點(diǎn)特異引物TAC1-F1的3′末端的倒4位堿基由T替換為C，5′末端接Tail2，TAC1-F2的3′末端的倒3位堿基由G替換為a，5′末端接Tail1，公共反向引物TAC1-commonR為5′-CATCACTGGCGAGCGAATAGG-3′（表1）。通用熒光引物為PEA1-QFAM：5′-d FAM-AGCTGGTT-Sp9-GCAACAGGAACCAGC-T（Dabsyl）-ATGAC-3′，PEA2-QHEX：5′-d HEX-ACTGCTCA-Sp9-GACGCAAGTGAGCAG-T（Dabsyl）-ATGAC-3′ ，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)接頭的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物中松散型等位基因TAC1（A）為Hex信號(hào)，而緊湊型等位基因tac1（G）為Fam信號(hào)。

1.3 DNA提取及基因型分析

取水稻苗期葉片，利用CTAB法提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系參考Long等[15]，10 uL反應(yīng)體系中分別添加10 μmol·L-1的TAC1-F1、TAC1-F2、TAC1-commonR、PEA1-QFAM和PEA2-QHEX引物0.04、0.04、0.2、0.1和0.1 μL，takara Taq（5 U·μL） 0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min變性；第1階段循環(huán)為9℃ 20 s，56℃退火延伸2 min，每個(gè)循環(huán)降低1℃，共6個(gè)循環(huán)；第2階段循環(huán)為94℃ 20 s，62℃退火延伸90 s，42個(gè)循環(huán)；最后62℃延伸2 min。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudioTM 3上讀取熒光信號(hào)值，根據(jù)信號(hào)比值判斷TAC1基因型。2 結(jié)果與分析

2.1 水稻功能分子標(biāo)記S-TAC1的驗(yàn)證

為驗(yàn)證所開發(fā)的功能標(biāo)記的準(zhǔn)確性，用S-TAC1分析已知基因組序列的常規(guī)水稻品種共56份（圖1）。日本晴、93-11和蜀恢498為已公布參考基因組序列的水稻品種，基因型分別為tac1、TAC1和TAC1，其余53份樣品為本課題組已測(cè)序水稻品種。S-TAC1分型結(jié)果顯示所有56份樣品明顯分為兩個(gè)不同類群（圖1），其中緊湊純合型tac1/tac1 36份，松散純合型TAC1/TAC1 20份（表2）?；蛐蜑榫o湊純合型tac1/tac1的36份水稻為日本晴、南粳9108等20份常規(guī)粳稻、天豐B等7份保持系、農(nóng)香22等5份常規(guī)秈稻、R143等4份恢復(fù)系。秈稻93-11、蜀恢498等20份秈稻為松散純合TAC1/TAC1基因型。分型結(jié)果和已測(cè)序結(jié)果完全一致，表明S-TAC1能準(zhǔn)確區(qū)分TAC1不同基因型，可以用于TAC1基因型的鑒定。

2.2 164份雜交稻TAC1基因型分析

由表3可知，164份雜交稻品種只有TAC1/TAC1松散純合型和TAC1/tac1雜合型等2種基因型，未檢測(cè)到tac1/tac1緊湊純合型。TAC1/tac1雜合型雜交水稻62份，其中有以秈粳雜種優(yōu)勢(shì)而聞名的甬優(yōu)系列雜交水稻6份，以谷豐A為母本的谷優(yōu)2736和谷優(yōu)353，以泰豐A為母本的泰優(yōu)068，以天豐A為母本的天優(yōu)382、天優(yōu)827和天優(yōu)華9。而TAC1/TAC1松散純合型雜交水稻102份，全部為秈型雜交水稻。

3 討論與結(jié)論

水稻是一種多分蘗的禾本科作物，其產(chǎn)量由單位面積內(nèi)的穗數(shù)、穗粒數(shù)及粒重等3個(gè)主要因素構(gòu)成。緊湊的株型雖然單位面積有效穗數(shù)增多，但會(huì)導(dǎo)致光合效率下降，田間通風(fēng)透氣性降低，抗病性下降。大分蘗角的株型采光透氣性良好，但由于分蘗數(shù)減少，影響水稻產(chǎn)量。因此在育種中培育適中的分蘗角是水稻株型育種的一個(gè)重要考量因素。

TAC1基因是利用松散型的秈稻品種IR24和粳稻品種Asominori構(gòu)建的近等基因系，通過經(jīng)典的圖位克隆鑒定的一個(gè)控制水稻分蘗角度的基因。秈稻中大多為松散型的TAC1基因，而粳稻為緊湊型的tac1基因。陳宗詳?shù)萚18]研究發(fā)現(xiàn)TAC1基因與tac1基因相比較，分蘗角度僅增加8.4°～13.7°，顯性的TAC1基因可以改善株型緊湊品種的分蘗角，提高紋枯病抗性水平。Huang等[12]認(rèn)為由于TAC1基因的半顯性效應(yīng)使得雜交稻有合適的分蘗角，是雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵基因。在本研究中，鑒定了164份雜交水稻，雜合型TAC1/tac1基因?yàn)?2份，特別是以秈粳雜種優(yōu)勢(shì)利用為主要特點(diǎn)的甬優(yōu)系列雜交水稻都為雜合型。松散型TAC1/TAC1純合基因型的雜交水稻有102份，但有意思的是，在本研究中沒有檢測(cè)到tac1/tac1緊湊型基因的雜交水稻。一方面的原因在于目前所使用恢復(fù)系大多為松散型TAC1基因型[12]，另一方面可能在于過于緊湊的株型的雜交水稻育種實(shí)踐沒有被選擇。對(duì)164份雜交水稻TAC1基因型檢測(cè)結(jié)果暗示過于緊湊的株型可能不利于雜交水稻，特別是秈型雜交水稻的生產(chǎn)。分析結(jié)果有助于在育種實(shí)踐中更好地利用TAC1基因。

本研究所開發(fā)的基于STARP技術(shù)的S-TAC1標(biāo)記能準(zhǔn)確快速地鑒定TAC1基因型，和四引物分子標(biāo)記系統(tǒng)相比，省去了凝膠電泳步驟，適合高通量大規(guī)模的檢測(cè)，提高分子標(biāo)記輔助選擇的效率。而和PARMS標(biāo)記相比，基于STARP技術(shù)的分子標(biāo)記同樣高效，但由于其在位點(diǎn)特異引物的3′端倒3或倒4位分別引入錯(cuò)配堿基，更有利于2條位點(diǎn)特異引物的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，能對(duì)包括SNP和INDEL等多種類型的變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。STARP技術(shù)使用普通Taq酶，不依賴于特定的商業(yè)公司，降低了檢測(cè)成本?；赟TARP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，目前已在小麥等多種作物獲得了較為廣泛的應(yīng)用

[16-17]，但在水稻中還較少應(yīng)用。本研究針對(duì)水稻TAC1基因所開發(fā)的S-TAC1為標(biāo)記輔助選擇提供了高效低成本的分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-03-16

作者簡介：楊紹華，男，1976年生，博士，副研究員，主要從事水稻分子遺傳與育種研究。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類項(xiàng)目（2019R1027-9）；福建省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)（2020NZ08017）。