姜楊，侯繼野，徐桂清，郭林娜，李永濤，沈雷，姚立杰

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市建華醫(yī)院介入科，黑龍江齊齊哈爾 161006

隨著體育運(yùn)動(dòng)常見化，肌腱損傷也變得常見化。肌腱處于低氧微環(huán)境中，缺少血管滋養(yǎng)，組織再生能力較差[1]，傳統(tǒng)手術(shù)不理想，如何修復(fù)損傷肌腱，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域需要主要解決的問題[2]，許多學(xué)者制備復(fù)合肌腱材料來修復(fù)肌腱損傷[3]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]為良好生物相容性和生物降解性可控的材料[4]，但細(xì)胞粘附力低。膠原可被人體吸收，但力學(xué)性能較差，兩者結(jié)合有良好生物相容性和力學(xué)性能[5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是肌腱組織工程常用的種子細(xì)胞之一[6]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor,SDF-1）在損傷部位上調(diào)SDF-1 可募集循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位的間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)受損組織[7-8]。本研究于2021年6 月—2022年6 月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備PLGA∕膠原三維支架，在低氧環(huán)境下SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原三維支架誘導(dǎo)BMSCs 增殖和遷移，為闡明低氧環(huán)境下三維培養(yǎng)BMSCs 在肌腱組織工程應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為4 組，分別37℃，1%O2低氧箱內(nèi)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為低氧對(duì)照組；37℃，1%O2低氧箱內(nèi)PLGA∕膠原支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為低氧P∕C 支架組；37℃，1%O2低氧箱內(nèi)SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原支架為低氧S-P∕C 支架組；37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)為正常對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

材料：胎牛血清；DMEM 培養(yǎng)基；青鏈霉素；胰蛋白酶；4%多聚甲醛；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠SDF-1；PLGA；新鮮牛肌腱。

器材：超凈工作臺(tái)；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；三氣培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；SU3500 掃描電子顯微鏡；Transwell 小室；CCK-8 試劑盒；Emax 酶標(biāo)儀；高速離心機(jī)；震蕩儀；靜電紡絲機(jī)（型號(hào)SS-2535DC）。

1.3 方法

①膠原的制備：采用李曉寅等[9]方法，將購買新鮮的牛肌腱作為原料，剔除周圍的肌肉、筋膜、血管、神經(jīng)等結(jié)構(gòu)，放入冰箱-10℃冷凍硬化，手術(shù)刀清理去除肌腱表面上殘余筋膜，洗凈后，切成薄塊，約1 cm，使用0.05 mol∕L Tirs 緩沖液浸泡24 h，收集沉淀物，含胃蛋白酶的醋酸消化后取上清液，加入3.5 mol∕L NaCl 溶液，收集鹽析沉淀，4℃去離子水透析5 d，測定濃度為4.5%。

②PLGA∕膠原三維生物材料支架的制備：PLGA和膠原按照75∶25 的質(zhì)量比例溶解于六氟異丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, HFIP），室溫下磁力棒攪拌約24 h，配比制成10%的靜電紡絲液，設(shè)置靜電紡絲技術(shù)參數(shù)，正向電壓設(shè)置24 kV，噴絲毛細(xì)管口徑0.5 mm，針口距接收器距離12 cm，紡絲速度0.6 m∕s，紡絲環(huán)境的溫度和濕度分別為（26.0±0.5）℃和（40.0±0.7）%，接收裝置覆蓋鋁箔紙接收，噴射后得到固化PLGA∕膠原三維生物材料放入真空干燥箱內(nèi)干燥24 h，掃描電子顯微鏡下觀察支架超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，等待實(shí)驗(yàn)備用。

③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植PLGA∕膠原三維生物材料支架：將PLGA∕膠原三維生物材料支架剪成圓片，直徑大小約為3 cm，放入培養(yǎng)皿中，在紫外線下消毒1～2 h，培養(yǎng)皿中加入青鏈霉素。加入殼聚糖緩釋的100 ng∕mL 濃度SDF-1，在紫外線下消毒1～2 h。將4×105個(gè)BMSCs 滴加到SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原三維生物材料支架上，于37℃，5%CO2和1%O2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察。

④CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況：按照以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組，0.9×104cells∕孔BMSCs 種植96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在培養(yǎng)第7 天利用CCK-8 試劑盒檢測BMSCs 增殖情況。按照CCK-8試劑盒說明，使用酶標(biāo)儀450 nm 測定各組吸光度值(A 值)，設(shè)置每組為5 個(gè)復(fù)孔。

⑤Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移情況：按照Transwell 試劑盒（8 μm 大小孔徑）說明書進(jìn)行操作，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密度約3×105個(gè)∕mL，將Transwell 小室置于24 孔板中，將制備的支架放入小室底面的通透膜上，取細(xì)胞懸液200 μl 加入無血清DMEM 的Transwell 小室的上室，在Transwell 小室下室中，對(duì)照組為500 μl 的DMEM 培養(yǎng)液，另外3 組分別為500μl DMEM 含120 ng∕mL 濃度SDF-1 因子復(fù)合PLGA∕膠原上清液的培養(yǎng)液和含PLGA∕膠原上清液的培養(yǎng)液，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37℃，放入5% CO2培養(yǎng)箱和1% O2專用低氧箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，去除纖維支架，用無菌紗布擦去小室內(nèi)底面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 清洗兩次，在倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.4 觀察指標(biāo)

①檢測PLGA∕膠原三維生物材料支架微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)；②檢測各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況；③檢測各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA/膠原三維生物材料支架微觀結(jié)構(gòu)觀察

掃描電鏡顯示PLGA∕膠原三維生物材料支架纖維表面光滑，縱橫交錯(cuò)、粗細(xì)均勻、連續(xù)無斷裂，無顆粒串珠，空隙清晰規(guī)則，相互貫通，纖維直徑約為（680.10±3.54）nm，空隙直徑約為（3 160.50±6.89）nm，見圖1。

2.2 BMSCs 在PLGA/膠原三維生物材料支架生長情況

激光共聚焦顯微鏡觀察可見DiL 標(biāo)記的BMSCs在PLGA∕膠原三維生物材料支架生長情況良好，纖維支架表面和間隙內(nèi)均可見BMSCs，見圖2。

圖2 BMSCs 在PLGA/膠原三維生物材料支架生長情況

2.3 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性比較

各組間骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性（吸光度值）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性（吸光度A 值）比較(±s)

表1 各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性（吸光度A 值）比較(±s)

注：在培養(yǎng)第7 天，低氧對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.724，P=0.027）；低氧P∕C 支架組與低氧對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.909，P=0.020）；低氧S-P∕C 支架組與低氧P∕C 支架組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.486，P=0.038）

組別正常對(duì)照組（n=5）低氧對(duì)照組（n=5）低氧P∕C 支架組（n=5）低氧S-P∕C 支架組（n=5）A 值1.07±0.12 1.26±0.10 1.50±0.15 1.71±0.13

2.4 各組細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)量比較

各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)量比較[(±s)，×103個(gè)]

表2 各組細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)量比較[(±s)，×103個(gè)]

注：低氧對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.661，P=0.022）；低氧P∕C 支架組與低氧對(duì)照組細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.993，P=0.040）；低氧S-P∕C 支架組與低氧P∕C 支架組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.816，P=0.048）

組別正常對(duì)照組（n=3）低氧對(duì)照組（n=3）低氧P∕C 支架組（n=3）低氧S-P∕C 支架組（n=3）細(xì)胞數(shù)21.6±3.5 35.2±5.4 47.8±4.9 56.6±2.3

3 討論

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，全球體育運(yùn)動(dòng)的興起，許多人都加入體育運(yùn)動(dòng)中。但是，許多人由于體育運(yùn)動(dòng)方式的不恰當(dāng)或老齡化等因素導(dǎo)致肌肉損傷、斷裂等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病。肌腱損傷是常見的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有3 000 萬例的肌腱損傷的病例[10]，手術(shù)治療后容易發(fā)生再次斷裂[11]。肌腱組織工程給肌腱損傷治療帶來了希望。

3.1 肌腱組織工程支架材料

支架材料包括天然高分子材料、人工合成高分子材料、復(fù)合材料。天然高分子材料主要有膠原、蠶絲、小腸黏膜下層，具有可降解性、無毒，親水性和細(xì)胞粘附性好的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)為力學(xué)性能差、降解速度快、加工性差。人工合成高分子材料主要有聚乳酸（polylactic acid, PLA）、聚羥基乙酸（polyglycolic acid, PGA）、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（PLGA）3種，優(yōu)點(diǎn)是來源廣泛、易加工、可降解，缺點(diǎn)為細(xì)胞親水性差、細(xì)胞粘附性差。復(fù)合材料由天然材料和人工合成材料復(fù)合而成，取兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有力學(xué)性能好、降解性好、細(xì)胞粘附性好等特性。本研究掃描電鏡結(jié)果顯示PLGA∕膠原三維支架纖維粗細(xì)均勻、光滑無結(jié)節(jié)、孔隙率高、且相互連通。激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞在支架材料生長情況良好，在纖維空隙內(nèi)和表面可見細(xì)胞黏附，細(xì)胞和三維支架相容性良好。

3.2 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）作為趨化因子，即CXCL12，CXCR4 作為趨化因子CXC 受體，兩者親和力極高，SDF-1 和CXCR4 結(jié)合后可以產(chǎn)生定向遷移的作用，能趨化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。上調(diào)SDF-1 有效的召集間循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)損傷部位[12]。

3.3 肌腱組織工程支架性能

CCK8 實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞培養(yǎng)第7 天，正常對(duì)照組吸光度值為（1.07±0.12）、低氧對(duì)照組吸光度值為（1.26±0.10）、低氧PLGA∕膠原支架組吸光度值為（1.50±0.15）、低氧SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原支架組吸光度值為（1.71±0.13），姜楊等[13]研究低氧PLGA∕膠原支架組是低氧對(duì)照組的（1.350±0.545）倍，低氧對(duì)照組是正常對(duì)照組的（1.417±0.55）倍，同時(shí)與王洋等[14]認(rèn)為CXCL12∕CXCR4 軸增加BMSCs 生存活性及增殖等作用相一致，在第7 天吸光度值低氧S-P∕C 支架組為最大。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與正常對(duì)照組比較，低氧對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量相對(duì)表達(dá)量增高；與低氧對(duì)照組比較，低氧PLGA∕膠原支架組細(xì)胞遷移數(shù)量相對(duì)表達(dá)量增高（P＜0.05）；與低氧PLGA∕膠原支架組比較，低氧SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原支架組細(xì)胞遷移數(shù)量相對(duì)表達(dá)量增高（P＜0.05），說明在低氧環(huán)境下，細(xì)胞具有一定遷移性，趨化因子SDF-1 與其受體CXCR4 之間相互作用是BMSCs 趨化過程的主要調(diào)節(jié)因素，與郝璐等[15]研究發(fā)現(xiàn)低氧條件可增強(qiáng)BMSCs 的遷移能力，而在加入SDF-1 的刺激下，BMSCs 遷移能力較大提升的結(jié)論相一致。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M肌腱周圍低氧環(huán)境，SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原三維立體支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)二維空間更具準(zhǔn)確性，證實(shí)SDF-1 復(fù)合PLGA∕膠原支架三維立體支架具有良好的生物相容性，可有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。下一步進(jìn)行建造動(dòng)物肌腱損傷模型，在動(dòng)物體內(nèi)放入三維仿生支架，評(píng)價(jià)仿生三維支架對(duì)肌腱損傷的修復(fù)影響，為治療肌腱損傷提供有力的理論基礎(chǔ)。