雷艷?詹世淮?施曉華?楊蘭?王佳偉　王水良?張勝行

【摘要】目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體（hUC-MSC-Exo）對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（HKC）凋亡的作用。方法 利用衣霉素誘導(dǎo)HKC產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；蛋白免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、GRP94和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；hUC-MSC-Exo經(jīng)分離與流式細(xì)胞術(shù)表面標(biāo)志物鑒定后，檢測(cè)不同濃度外泌體（0、40、60、80、100、150、200 μg/mL）對(duì)細(xì)胞活性的影響；resazurin法與流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)外泌體與衣霉素共處理組的細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果 1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制HKC的細(xì)胞增殖活性并呈濃度依賴性；不同濃度衣霉素均可誘導(dǎo)HKC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。100、150、200 μg/mL外泌體能增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性；與衣霉素2 μg/mL組相比，衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)；此外，衣霉素2 μg/mL組細(xì)胞凋亡率為（14.16±1.58）%，衣霉素2 μg/mL+外泌體150 μg/mL組細(xì)胞凋亡率為（8.18±0.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體；細(xì)胞凋亡；衣霉素；腎小管上皮細(xì)胞

Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes protect renal tubular epithelial cells against tunicamycin-induced apoptosis Lei Yan△， Zhan Shihuai， Shi Xiaohua， Yang Lan， Wang Jiawei， Wang Shuiliang， Zhang Shenghang. △Fujian Key Laboratory of Aptamers Technology， the 900th Hospital of Joint Logistics Support Force， Fuzhou 350025， China

Corresponding author， Zhang Shenghang， E-mail： fzzyyzsh@126.com

【Abstract】Objective To investigate the role of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes （hUC-MSC-Exo） in the tunicamycin-induced apoptosis of renal tubular epithelial cells （HKC）. Methods Endoplasmic reticulum stress （ERS） was induced by tunicamycin in HKC cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The expression levels of ERS-related proteins of glucose-regulated protein 78 （GRP78）， GRP94 and C/EBP homologous protein （CHOP） were determined by Western blot. Cell apoptosis was assessed by flow cytometry. hUC-MSC-Exo were isolated and identified by flow cytometry. The effects of different concentrations of hUC-MSC-Exo （0， 40， 60， 80， 100， 150 and 200 μg/mL） upon cell activity were evaluated. Cell proliferation and apoptosis after co-treatment with hUC-MSC-Exo and tunicamycin were assessed by resazurin assay and flow cytometry. Results Treatment with 1， 2 and 4 μg/mL tunicamycin could inhibit the proliferation of HKC in a concentration-dependent manner. Different concentrations of tunicamycin could induce ERS and cell apoptosis in HKC. Treatment with 100， 150 and 200 μg/mL hUC-MSC-Exo could enhance cell proliferation. Compared with the 2 μg/mL tunicamycin group， cell proliferation was significantly increased in the?2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group （P < 0.05）. The apoptosis rate in the 2 μg/mL tunicamycin group was （14.16±1.58）%， and （8.18±0.58）% in the 2 μg/mL tunicamycin and 150 μg/mL hUC-MSC-Exo co-treatment group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion hUC-MSC-Exo can significantly alleviate HKC apoptosis induced by ERS.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress； Mesenchymal stem cell-derived exosome； Apoptosis； Tunicamycin；

Renal tubular epithelial cell

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是細(xì)胞應(yīng)激的一種重要方式，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白蓄積過(guò)多會(huì)導(dǎo)致ERS發(fā)生［1］。ERS參與了缺氧、腎缺血再灌注損傷（IRI）、腎毒性和炎癥等引起的急性腎損傷（AKI）發(fā)病機(jī)制，這些病理狀態(tài)均能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生ERS，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2-3］。衣霉素作為ERS的常用誘導(dǎo)劑，通過(guò)抑制N-糖基化并阻斷N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶，引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累而誘導(dǎo)ERS［4-5］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體（hUC-MSC-Exo）攜帶著蛋白分子、mRNA、微RNA及長(zhǎng)鏈非編碼RNA等作為細(xì)胞與細(xì)胞通信之間的聯(lián)系［6］。研究表明，hUC-MSC-Exo通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）信號(hào)通路的激活而抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡［7］。MSC-Exo通過(guò)上調(diào)miR-146b的水平從而抑制NF-κB活性和減輕炎癥反應(yīng)，降低膿毒癥相關(guān)的AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平，抑制了腎小管細(xì)胞凋亡［8］。盡管MSC-Exo顯示出腎臟保護(hù)作用，但MSC-Exo對(duì)ERS狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在研究ERS狀態(tài)下MSC-Exo對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、材 料

1. 試 劑

衣霉素購(gòu)自瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。胎牛血清、 抗體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、GRP94、C/EBP同源蛋白（CHOP）、裂解的核糖聚合酶（c-PARP）、CD9、CD81、脂筏結(jié)構(gòu)蛋白1（Flotin1）、 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、兔抗IgG、鼠抗IgG均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。流式抗體CD63、CD9、CD81購(gòu)自Biolenged公司。二辛可寧酸（BCA） 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司?；贚uminol 的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）底物試劑蛋白顯色液購(gòu)自德國(guó)Advansta公司。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biolenged公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)MedChem公司。Adamas life刃天青（resazurin）細(xì)胞活性檢測(cè)染料購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司。ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)SBI公司。

2. 細(xì) 胞

人腎小管上皮細(xì)胞（HKC）細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供；hUC-MSC由福建省干細(xì)胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供，取P3代細(xì)胞進(jìn)行研究。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

hUC-MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的低糖培養(yǎng)基中；腎小管上皮細(xì)胞HKC培養(yǎng)于10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基中，細(xì)胞均置于含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中。

2. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的分離

按文獻(xiàn)［9］方法操作：取P3代的hUC-MSC，無(wú)血清純DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集上清，經(jīng)3 000×g 15 min離心去除細(xì)胞碎片，按照ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒的說(shuō)明書，將10 mL上清液與2 mL ExoQuick-TC試劑輕輕混合，于4℃過(guò)夜（至少12 h），在孵育期間離心管保持直立且不能搖動(dòng)。經(jīng)1 500×g離心30 min吸棄上清液，1 500×g離心5 min后，輕輕吸棄所有的液體，避免干擾到底部的外泌體沉淀。最后經(jīng)100～500 μL無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸即可得到外泌體溶液。

3. 不同濃度衣霉素對(duì)細(xì)胞存活的影響

采用CCK-8法：HKC正常傳代培養(yǎng)，胰酶消化后鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，5 000個(gè)/孔接種于96孔板，次日用含0.5%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基將衣霉素稀釋成不同的濃度（0、1、2、4 μg/mL），每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h，將96孔板置于酶標(biāo)儀上，測(cè)定450 nm處吸光度值，以對(duì)照組為100%，則細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

4. 不同濃度外泌體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

每孔5 000個(gè)HKC接種于96孔板中，次日加入不同濃度［0（Con）、40、60、80、100、150、200 μg/mL］外泌體或2 μg/mL衣霉素作用24 h后，按照上述CCK-8法測(cè)定450 nm吸光度。

5. resazurin法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

每孔5 000個(gè)HKC接種于24孔板中，次日實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組，作用24 h后，每孔加入30 μL的resazurin溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，在590 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

6. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組收集的總蛋白用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，隨后取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。室溫下4%牛血清白蛋白BSA搖床上封閉1 h后，與1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20（TBST）洗膜3次，加入不同比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST、PBS各洗膜3次后，加入ECL發(fā)光液孵育3 min后進(jìn)行曝光顯影。各蛋白表達(dá)量均以 β-actin為內(nèi)參。

7. 流式熒光激活細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

HKC經(jīng)不同濃度衣霉素或與外泌體聯(lián)合處理24 h，胰酶消化后收集細(xì)胞沉淀，經(jīng)預(yù)冷的細(xì)胞染色液洗滌2次，加入試劑盒中的結(jié)合液重懸至細(xì)胞濃度為1×107/mL。每管吸取100 μL的細(xì)胞懸液，加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI）混勻后避光染色15 min。每管加入400 μL 結(jié)合液重懸后即上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置正常組細(xì)胞不染色調(diào)電壓，經(jīng)FITC Annexin Ⅴ和PI分別單染的細(xì)胞調(diào)補(bǔ)償。

8. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物

將提取的40 μL外泌體與5 μL硫酸鹽微珠室溫共孵育15 min，加入5 μL 100 μmol/L的BSA溶液，室溫孵育15 min。加入1 mL PBS孵育75 min，580×g離心5 min，棄上清液。將外泌體微珠（beads）的結(jié)合體中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室溫孵育30 min，經(jīng)離心PBS洗滌2次后，重懸在350 μL PBS中，每管50 μL分裝于流式管中，加入CD9、CD63、CD81的一抗（1∶200）避光孵育45 min，離心重懸后立即上機(jī)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析結(jié)果，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，取各濃度的平均值進(jìn)行分析；熒光強(qiáng)度檢測(cè)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔；流式細(xì)胞術(shù)分析3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，取各次實(shí)驗(yàn)的均值為最后結(jié)果。連續(xù)變量以表示，多組間比較使用單因素方差分析，多重比較使用Dunnett-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、衣霉素誘導(dǎo)HKC細(xì)胞產(chǎn)生ERS并誘導(dǎo)凋亡

不同濃度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的細(xì)胞存活率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F = 26.650，P = 0.001），隨后使用Dunnett-t檢驗(yàn)顯示，1、2、4 μg/mL衣霉素均能抑制細(xì)胞增殖（P均< 0.05），且細(xì)胞存活率隨著衣霉素濃度增加呈下降趨勢(shì)（圖1A）。1、2、4 μg/mL衣霉素均能誘導(dǎo)ERS相關(guān)蛋白GRP78、GRP94和CHOP表達(dá)上調(diào)（圖1B），2、4 μg/mL衣霉素誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡早期標(biāo)志物c-PARP蛋白表達(dá)增強(qiáng)（圖1C）；流式細(xì)胞術(shù)顯示，不同濃度衣霉素（0、1、2、4 μg/mL）作用HKC 24 h的細(xì)胞凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 59.960，P < 0.001），且1、2、4 μg/mL衣霉素作用下HKC凋亡加重（P均< 0.05），其中1、2、4 μg/mL衣霉素作用于HKC 24 h的細(xì)胞凋亡率分別為（6.32±0.23）%、（11.29±2.89）% 和（18.03±0.21）%（圖1D）。

二、hUC-MSC外泌體的鑒定

蛋白免疫印跡分析顯示，常氧及缺氧培養(yǎng)條件下hUC-MSC外泌體均共表達(dá)CD9、CD81和Flotin1這些外泌體的代表性標(biāo)志物。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)來(lái)源于hUC-MSC外泌體中CD9（59.2%）、CD63（73.4%）和CD81（63.5%）均呈陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖2。

三、hUC-MSC-Exo對(duì)HKC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

不同組別作用HKC 24 h的細(xì)胞增殖活性總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F = 449.200，P < 0.001），隨后使用Dunnett-t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，加入40、60、80 μg/mL外泌體未明顯促進(jìn)HKC的細(xì)胞增殖活性，而加入100 μg/mL 外泌體處理的HKC細(xì)胞增殖活性為113.41%（P = 0.006）；經(jīng)150 μg/mL和200 μg/mL 外泌體處理HKC細(xì)胞增殖活性分別為122.51%（P = 0.004）和141.68%（P = 0.001），見(jiàn)圖3A。resazurin法檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果表明，衣霉素2 μg/mL組的熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組（P = 0.002），而衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的熒光強(qiáng)度高于衣霉素組（P =0.012），見(jiàn)圖3B、C。對(duì)照組、衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組的細(xì)胞凋亡率分別為（0.18±0.01）%、（14.16±1.58）%、（8.18%±0.58）%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 152.000，P < 0.001），對(duì)照組與衣霉素2 μg/mL組、衣霉素2 μg/mL組與衣霉素2 μg/mL +外泌體150 μg組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），見(jiàn)圖3D。

討論

腎臟缺氧/缺血、重金屬毒性、抗癌免疫抑制藥及急慢性炎癥反應(yīng)等多種因素均是AKI的誘因，最終都會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，嚴(yán)重的損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡［10-11］。ERS和AKI之間的關(guān)系已被體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，AKI患者的腎活檢中，ERS標(biāo)志分子物表達(dá)與AKI的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［12］。腎臟缺血再灌注后近端小管細(xì)胞Grp78蛋白表達(dá)快速增加，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）啟動(dòng)，在缺血損傷初期發(fā)揮保護(hù)作用，在嚴(yán)重ERS的狀態(tài)下通過(guò)CHOP促進(jìn)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［1］。

MSC-Exo在治療AKI中起重要作用，然而，MSC-Exo對(duì)ERS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究還很局限，因此研究MSC-Exo對(duì)ERS誘導(dǎo)的腎損傷的分子機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究中不同濃度的衣霉素（1、2、4 μg/mL）均能誘導(dǎo)HKC細(xì)胞產(chǎn)生ERS，相關(guān)的分子GRP78、GRP94和CHOP表達(dá)上調(diào)，并呈濃度依賴性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也表明ERS狀態(tài)下能誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡。hUC-MSC-Exo處理組能明顯增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性；衣霉素誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率為（14.16±1.58）%，而外泌體與衣霉素共處理組細(xì)胞凋亡率為（8.18±0.58）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者所在課題組的前期研究表明，hUC-MSC-Exo能通過(guò)攜帶的miR-21抑制ERS和p38 MAPK的磷酸化，從而減緩ERS并明顯降低了胰島內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率［13］。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，hUC-MSC-Exo能明顯減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而在AKI中發(fā)揮保護(hù)作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo可通過(guò)激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路，減輕髓核細(xì)胞ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14］。Buono等［15］以衣霉素誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細(xì)胞ERS為模型，MSC釋放的細(xì)胞外囊泡（EV）能夠誘導(dǎo)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中ERS相關(guān)基因ATF4、GRP78、XBP1、CHOP顯著下調(diào)，并抑制caspase-3蛋白的表達(dá)，其機(jī)制是通過(guò)MSC-EV中與ERS靶向性的微RNA分子，如miR-222-3p、miR-125b-5p、miR-21-5p轉(zhuǎn)移至角膜內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮潛在的治療作用。Xie等［16］的研究表明MSC-Exo中miR-31-5p負(fù)調(diào)節(jié)ERS分子ATF6，通過(guò)miR-31-5p/ATF6/ER應(yīng)激通路調(diào)節(jié)抑制椎體終板軟骨細(xì)胞凋亡和鈣化，這表明MSC-Exo在不同的ERS模型中均發(fā)揮一定的抗凋亡作用。本研究中，在ERS狀態(tài)下，MSC-Exo可以減緩衣霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，但外泌體發(fā)揮作用的信號(hào)通路及外泌體中的何種成分參與了ERS的調(diào)控將是我們下一步研究中要關(guān)注的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究表明hUC-MSC-Exo能明顯抑制ERS狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-09-30）

（本文編輯：林燕薇）