陳默 于明 徐萬魁

【摘要】目的：建立頂空氣相色譜法測(cè)定唑來膦酸中殘留溶劑甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯的含量。方法：以含正丙醇的50%吡啶溶液為溶劑；正丙醇為內(nèi)標(biāo)；采用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱；起始溫度40℃，維持8分鐘，以每分鐘10℃的速率升溫至200℃，維持5分鐘；進(jìn)樣口溫度200℃；檢測(cè)器溫度250℃；載氣為氦氣；頂空瓶平衡溫度90℃，平衡時(shí)間20分鐘。結(jié)果：在該色譜條件下5種待測(cè)溶劑分離度良好，在所考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999）；各溶劑的回收率在92.3%～109.2%之間，RSD%（n=9）小于2.4%；重復(fù)性良好，RSD%（n=6）小于2.0%；方法耐用性良好。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于本品殘留溶劑的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】氣相色譜法；唑來膦酸；甲醇；丙酮；異丙醇；乙酸乙酯；氯苯

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.032

Determination of Five Organic Solvent Residuesin Zoledronic Acid by Headspace Gas Chromatography

CHEN Mo，YU Ming，XU Wan-kui*

（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：To establish a headspace gas chromatography method for the determination of residual solvents such as methanol，acetone，isopropanol，ethyl acetate and chlorobenzene in zoledronic acid. Methods：Sample was dissolved in 50% pyridine solution with n-propanol，usingn-propanolastheinternalstandard. Capillarycolumnpackedwith6%cyanopropylphenyl-94% dimethylpolysiloxanewas used.The initial column temperature was kept at 40℃for 8 min with an increase rate of 10℃·min-1to 200℃and sustained for 5 min. The injector port temperature was 200℃and the FID temperature was 250℃. The carrier gas was Helium. The Vials was incubated at 90℃for 20 min. Results Thedetected solvents were separated completely. There was a good linear relationship within the investigated concentration range（r=0.9999）.The mean recoverieswere 92.3%～109.2%，with RSD%（n=9）being no more than 2.4%. The method has good precision and robustness. Conclusion：The method is simple，sensitive and accurate，which can be used for the determination of residual solvents in zoledronic acid.

Key words：headspace gas chromatography；zoledronic acid；methanol；acetone；isopropanol；ethyl acetate；chlorobenzene

唑來膦酸是咪唑雜環(huán)雙膦酸鹽，屬于第三代雙膦酸鹽類藥物，可抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)下的骨質(zhì)代謝和吸收[1]，常見劑型為注射劑，臨床上用于治療惡性腫瘤溶骨性骨轉(zhuǎn)移引起的骨痛和惡性腫瘤引起的高鈣血癥，也可治療骨質(zhì)疏松癥。有機(jī)溶劑在藥物合成反應(yīng)中必不可少，在工藝過程中不能完全去除的有機(jī)溶劑超過一定安全值會(huì)給人體帶來危害。

《中國(guó)藥典》殘留溶劑測(cè)定法[2]中將藥品中常見殘留溶劑分為三類，針對(duì)每一類有不同的限度要求。唑來膦酸合成中普遍使用氯苯，由于各企業(yè)合成工藝不同，使用的其他有機(jī)溶劑略有不同。本文采用頂空氣相色譜法測(cè)定唑來膦酸中甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯的殘留量。

1儀器與試藥

1.1儀器

島津GC-2010Plus型氣相色譜儀，AOC-5000 AUTO INJECTOR，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。METTLER XP 205型電子分析天平。

1.2試藥

甲醇（天津康科德科技有限公司，批號(hào)210401，純度≥99.90%），丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20200608，純度≥99.5%），異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20190722，純度≥99.7%），乙酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20181107，純度≥99.5%），氯苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20110429，純度≥98.5%）。唑來膦酸樣品（E企業(yè)，批號(hào)7ZOP419008、7ZOP419009、7ZOP419010）。吡啶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160617，分析純），正丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)14100209，分析純），實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為DB-624（30 m×0.53 mm，3μm）；起始溫度為40℃，維持8分鐘，以每分鐘10℃的速率升溫至200℃，維持5分鐘；進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測(cè)器溫度為250℃；載氣為氦氣，流速：4 mL/分鐘；分流比5∶1；頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時(shí)間為20分鐘。

2.2溶液的制備

2.2.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取正丙醇適量，用50%吡啶溶液稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

取本品約0.2 g，精密稱定，置10 mL頂空瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL使溶解，密封。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甲醇0.3198 g、丙酮0.5063 g、異丙醇0.4803 g、乙酸乙酯0.5185 g、氯苯0.04012 g，置20 mL量瓶，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液Ⅰ，精密量取對(duì)照品貯備液Ⅰ1 mL置50 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液Ⅱ，精密量取2 mL，置10 mL頂空瓶中，密封。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性試驗(yàn)

精密量取內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，置10 mL頂空瓶中，密封，作為空白內(nèi)標(biāo)溶液；精密量取50%吡啶溶液2 mL，置10 mL頂空瓶中，密封。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖?？梢?，內(nèi)標(biāo)溶液對(duì)甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯的檢測(cè)無干擾，50%吡啶溶液對(duì)正丙醇（內(nèi)標(biāo)）色譜峰無干擾；丙酮峰與異丙醇峰的分離度、氯苯峰與相鄰色譜峰的分離度分別為2.28、1.69，均滿足能分離度要求（分離度不小于1.5）。見圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.3”中對(duì)照品貯備液Ⅰ0.5 mL、1 mL和2 mL，分別置50mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液④⑤⑥。

精密量取線性溶液⑤0.25 mL、0.5 mL和5 mL，分別置50 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①②③。

精密量取各線性溶液2 mL，分別置10 mL頂空瓶中，密封，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)。

以對(duì)照品溶液中各待測(cè)溶劑濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)溶劑與內(nèi)標(biāo)溶劑峰面積的比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各待測(cè)溶劑的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

2.3.3檢測(cè)限和定量限

精密量取線性溶液①2.5 mL、5 mL、6.5 mL和12.5 mL，分別置50 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，分別作為丙酮和乙酸乙酯檢測(cè)限溶液（a），甲醇、異丙醇和氯苯檢測(cè)限溶液（b），丙酮和乙酸乙酯定量限溶液（c），甲醇、異丙醇和氯苯定量限溶液（d）。

精密量取上述溶液各2 mL，分別置10 mL頂空瓶中，密封，搖勻。

照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖，當(dāng)S/N=2～3和S/N=10時(shí)，分別計(jì)算檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表1。

2.3.4精密度試驗(yàn)

2.3.4.1系統(tǒng)精密度

精密量取“2.2.3”中對(duì)照品貯備液Ⅱ2 mL，置10 mL頂空瓶中，密封，同法制備6份。

照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)。甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯峰面積與正丙醇峰面積比值的RSD%分別為1.10%、1.48%、0.93%、1.42%和1.79%。

2.3.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

樣品約0.2 g，精密稱定，置10 mL頂空瓶中，共6份，分別精密加入“2.3.2”中對(duì)照品貯備液Ⅱ2 mL，使溶解，密封，作為加標(biāo)供試品溶液。

對(duì)照品溶液見“2.3.4.1”。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)。6份加標(biāo)供試品溶液中甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯峰面積與正丙醇峰面積比值的RSD%分別1.53%、1.25%、1.22%、1.34%、2.03%，含量的RSD%分別為1.31%、1.04%、1.16%、1.19%、1.27%。

2.3.5準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取“2.2.3”中對(duì)照品貯備液Ⅰ0.5 mL、1 mL和1.2 mL，分別置50 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為50%、100%、120%三個(gè)濃度水平混合對(duì)照品貯備液。取樣品約0.2 g，精密稱定，置10 mL頂空瓶中，共9份，分別精密加入三個(gè)濃度的混合對(duì)照品貯備液2 mL，使溶解，密封，各3份，作為供試品溶液。

精密量取“2.2.3”中對(duì)照品貯備液Ⅱ2 mL，置10 mL頂空瓶中，密封，作為對(duì)照品溶液。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，分別測(cè)定供試品溶液中待測(cè)溶劑含量，將測(cè)得量與樣品中含量的差值與加入量比較，計(jì)算回收率。

結(jié)果，甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯的回收率平均值分別為98.01%、108.18%、104.54%、109.25%和92.26%，RSD%（n=9）分別為1.89%、2.20%、2.36%、2.04%和1.67%。

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

50%吡啶溶液對(duì)唑來膦酸樣品具有較好的溶解性，由于待測(cè)殘留溶劑中有乙酸乙酯，而50%吡啶具有弱堿性，對(duì)乙酸乙酯有水解作用。

取對(duì)照品溶液2份，分別于0時(shí)和17時(shí)，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)。0時(shí)和17時(shí)色譜圖中f乙醇/f乙酸乙酯（%）的相對(duì)平均偏差為2.84%，結(jié)果表明17小時(shí)內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定性良好。乙酸乙酯的水解反應(yīng)主要發(fā)生在頂空氣-液平衡過程中，溫度高水解反應(yīng)加快，但所用溶劑對(duì)乙酸乙酯的水解作用較弱，可忽略不計(jì)。

2.3.7色譜條件耐用性考察

本方法以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（或極性相近）為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱，更換不同品牌或內(nèi)徑的色譜柱，并相應(yīng)改變升溫速率和柱流速進(jìn)行測(cè)定。

①TG-624（30 m×0.53 mm，3μm），升溫速率6℃·min-1，其他色譜條件不變：丙酮峰與異丙醇峰、氯苯峰與相鄰色譜峰的分離度分別為1.86和1.67；

②DB-624UI（30 m×0.32 mm，1.8μm），流速2.30 mL·min-1，其他色譜條件不變：丙酮峰與異丙醇峰、氯苯峰與相鄰色譜峰的分離度分別為1.89和2.82。

2.4樣品測(cè)定

取三批唑來膦酸原料藥，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。7ZOP419008批樣品和7ZOP419009批樣品中未檢出甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯，7ZOP419010批樣品中未檢出丙酮、乙酸乙酯和氯苯，檢出甲醇和異丙醇，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比值計(jì)算，甲醇和異丙醇含量均為0.00046%，其中異丙醇?xì)埩袅啃∮诙肯蕖?h3> 3討論

采用頂空氣相色譜法測(cè)定殘留溶劑時(shí)，首先應(yīng)選擇合適的溶劑溶解樣品。唑來膦酸在水中微溶，在二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑中幾乎不溶。林生文[3]用0.1 mol/ L氫氧化鈉溶液為溶劑，姚曦等[4]用1 mol/L氫氧化鈉溶液為溶劑。本文測(cè)定的殘留溶劑中有乙酸乙酯，因在頂空加熱條件下乙酸乙酯可被堿水解生成乙醇，故不宜選擇氫氧化鈉溶液溶解樣品。2 mL 50%吡啶溶液對(duì)0.2 g唑來膦酸具有較好的溶解性，其弱堿性對(duì)乙酸乙酯的水解作用可忽略不計(jì)。

以50%吡啶溶液為溶劑溶解唑來膦酸樣品，采用外標(biāo)法測(cè)定5種殘留溶劑時(shí)，由于存在基質(zhì)效應(yīng)，丙酮和乙酸乙酯的回收率接近120%。以正丙醇為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯的回收率在90.0%～110.0%之間，RSD（n=9）小于5.0%，滿足了頂空氣相色譜法測(cè)定殘留溶劑的方法學(xué)要求。

4結(jié)論

本文建立了頂空氣相色譜法測(cè)定唑來膦酸中甲醇、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯和氯苯等5種殘留溶劑的方法，方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠。

【參考文獻(xiàn)】

[1]劉瑤，劉治軍，傅得興.新一代二膦酸鹽類藥物唑來膦酸的藥理與臨床[J].中國(guó)新藥雜質(zhì)，2004，13（11）：1058-1060.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020.

[3]林生文.頂空氣相色譜法測(cè)定唑來膦酸氯苯的殘留量[J].西北藥學(xué)雜質(zhì)，2013，28（4）：369-432.

[4]姚曦，李偉玲.頂空氣相色譜法測(cè)定唑來膦酸的7種殘留溶劑[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，34（4）：430-432.

【作者簡(jiǎn)介】

陳默，男，1984年出生，主管藥師，學(xué)士，主要研究方向?yàn)榛瘜W(xué)藥品質(zhì)量分析。

于明，女，1970年出生，主任藥師，博士，主要研究方向?yàn)榛瘜W(xué)藥品質(zhì)量分析。

通訊作者：徐萬魁，男，1975年出生，主任藥師，碩士，主要研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量控制技術(shù)研究。聯(lián)系電話：024-31266300，郵箱地址：xuwank@163.com。

（本稿審讀：龐燕軍）