王瑾瑜，王文娟，曹慧珍

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）在目前生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對(duì)細(xì)胞、病例等微小信號(hào)進(jìn)行觀察和檢測(cè)起到了重要的作用，是熒光成像和細(xì)胞組織分析的重要工具之一[1-2]。它是以激光束為光源，在顯微鏡的基礎(chǔ)上增加了掃描單元、共軛小孔和檢測(cè)單元。LSCM對(duì)熒光樣品激發(fā)以后，共軛小孔排除非焦面的信號(hào)，獲得高信噪比、高分辨率的圖像[3]。LSCM 可以檢測(cè)細(xì)胞、組織、活體等帶有熒光標(biāo)簽的樣品，可適配35 mm/50 mm/60 mm 培養(yǎng)皿、載玻片、腔室培養(yǎng)皿、孔板等培養(yǎng)容器，但均需人工操作。將樣品放于LSCM上，用低倍鏡觀察并將感興趣的區(qū)域放于視野中央，切換到所需的高倍鏡下觀察。

近年來(lái)，生物學(xué)的研究越來(lái)越依靠大數(shù)據(jù)說(shuō)明具體的問(wèn)題，這就需要保證實(shí)驗(yàn)的規(guī)模和數(shù)據(jù)的層次，單一的成像檢測(cè)已經(jīng)滿足不了相關(guān)的研究，因此，高通量成像逐步興起，在獲得大量數(shù)據(jù)的同時(shí)，還可解決人工手動(dòng)操作的問(wèn)題。

目前高通量成像主要被用于藥物研發(fā)中，樣品主要以細(xì)胞為主，培養(yǎng)細(xì)胞以孔板為主[4-7]，它結(jié)合了高通量篩選技術(shù)的效率和細(xì)胞影像學(xué)技術(shù)的成像和分析能力，能夠快速地從復(fù)雜的生物系統(tǒng)中收集到大量數(shù)據(jù)[8]。對(duì)于做免疫熒光的細(xì)胞和組織制作成裝片，很難用目前市面上的設(shè)備進(jìn)行高通量的拍攝，市面上有玻片掃描儀可進(jìn)行多玻片的熒光成像和病理成像，但是均基于普通的寬場(chǎng)顯微鏡[9]，相較于LSCM 來(lái)說(shuō)，這些設(shè)備分辨率低，放大倍數(shù)通常為4X、10X、20X、40X。而LSCM 的放大倍數(shù)可以達(dá)到100X，數(shù)值孔徑可達(dá)1.49。對(duì)于一些比較簡(jiǎn)單的細(xì)胞計(jì)數(shù)，普通玻片掃描儀也可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，但是?duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)有要求的實(shí)驗(yàn)，必須使用LSCM，其分辨率高、信噪比高。針對(duì)這一問(wèn)題，筆者使用本實(shí)驗(yàn)室的LSCM 以免疫熒光脾臟裝片為例，介紹如何利用LSCM 進(jìn)行高通量的自動(dòng)拍攝。

1 LSCM 載物臺(tái)適配器的設(shè)計(jì)

隨著技術(shù)的發(fā)展，目前光學(xué)顯微鏡的載物臺(tái)都是電動(dòng)載物臺(tái)，可以做大圖拼接成像[10]，但是大部分顯微鏡的樣品夾都只能放置單張載玻片，如圖1（a）所示。需要成像的實(shí)驗(yàn)人員手動(dòng)單張更換載玻片，延長(zhǎng)了拍攝時(shí)間，而且需要大量的人工尋找樣品信息位置。這不僅限制了多樣本的檢測(cè)，還限制了自動(dòng)拍攝程序的應(yīng)用。目前市面上也有可以采購(gòu)的玻片掃描儀和做藥篩的高內(nèi)涵[11-12]，但是這些設(shè)備價(jià)格昂貴，成像效果一般，不夠靈活。之前也有多載玻片夾持組件的設(shè)計(jì)[13]，但比較復(fù)雜，機(jī)械臂價(jià)格昂貴，不能普及到每一臺(tái)光學(xué)顯微鏡上。

圖1 顯微鏡通用樣品適配器

倒置熒光顯微鏡和倒置激光掃描共聚焦顯微鏡電動(dòng)載物臺(tái)的移動(dòng)范圍是128 mm×86 mm，原設(shè)備廠家設(shè)計(jì)的載玻片適配器只能放一片載玻片，寬度為76 mm×26 mm。盡最大可能利用本身電動(dòng)載物的移動(dòng)范圍設(shè)計(jì)適配器，最大容量可以放置4 個(gè)載玻片，如圖1（b）所示。

2 高通量程序的應(yīng)用

HCA/Jobs 是NIS-Elements 自帶用于復(fù)雜圖像采集和數(shù)據(jù)分析的可編寫的自動(dòng)化程序模塊。目前針對(duì)固定樣品和活細(xì)胞樣品做了2 個(gè)模板，包括孔板、玻片、小皿等全部拍攝和部分拍攝，在拍攝后期直接可以增加分析和統(tǒng)計(jì)程序獲得結(jié)果，包括Excel、柱形圖、散點(diǎn)圖等。此外，在模板之外，還會(huì)幫用戶解決一些特殊的高通量實(shí)驗(yàn)。

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)材料為成年的B6 小鼠，實(shí)驗(yàn)的儀器型號(hào)為超分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡Nikon A1 HD25。實(shí)驗(yàn)的具體操作流程如下：①對(duì)成年B6 小鼠進(jìn)行手術(shù)，取其脾臟；②冠狀切面（35 μm）用低溫切片機(jī)（Leica）切割；③組織切片用含有5%的BSA（牛血清白蛋白）和0.3%的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的PBS（磷酸緩沖鹽溶液）封閉；④免疫熒光標(biāo)記熒光探針；⑤盡可能多地鋪展在載玻片上，滴上封片劑，蓋上蓋玻片，制成裝片；⑥成像所需物鏡為1X、20X、40X，將蓋玻片朝下放置于多玻片適配器上，用螺絲固定在電動(dòng)載物臺(tái)上。

多玻片高通量自動(dòng)化程序的編寫如下：①打開(kāi)NIS-Elements AR 5.2 的HCA/Jobs 模塊；②選擇工作區(qū)域，StageArea 確定區(qū)域rectangle 92.2 mm×38.6 mm；③確定1X 物鏡下的拍攝參數(shù)（128×128 分辨率模式，單通道熒光強(qiáng)度和HV 確保信背比為3∶1），掃描速度為4 fps，確定高倍物鏡（10X、20X、40X）下拍攝參數(shù)（1 024×1 024 分辨率模式，多通道熒光強(qiáng)度和HV確保信號(hào)足夠亮，但不過(guò)曝）；④將低倍物鏡切換到高倍物鏡時(shí)，pinhole 的大小沒(méi)有辦法關(guān)聯(lián)，可以寫一個(gè)命令，在切換物鏡后，通過(guò)macro 將pinhole size 調(diào)整到1.2 A U ；⑤用1 X 物鏡掃描所有區(qū)域，scan stageArea.StageArea.Area；⑥使用GA 分析模塊，通過(guò)therhold 將脾臟的區(qū)域選擇出來(lái)；⑦將所有的區(qū)域作為一個(gè)RegionList；⑧切換20X 物鏡，通過(guò)Autofocus 鎖定每個(gè)脾臟的焦面，對(duì)每個(gè)脾臟進(jìn)行成像。多玻片高通量拍攝程序如圖2 所示。

圖2 多玻片高通量拍攝程序

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

編寫好的多波片高通量拍攝程序會(huì)自動(dòng)切換到1X 物鏡下，以4 fps 的速度自動(dòng)尋找每個(gè)玻片上的脾臟切片，然后定位，將選定區(qū)域加載為一個(gè)列表作為高倍鏡成像的選定區(qū)域。然后自動(dòng)切換到高倍鏡下，轉(zhuǎn)換到雙通道拍攝，自動(dòng)對(duì)焦，根據(jù)1X 物鏡下定位的樣品依次完成高倍鏡大圖拼接成像。即使大量樣品焦面不一致，儀器也可以自動(dòng)校正。成像結(jié)果如圖3 所示。

圖3 成像結(jié)果

3 結(jié)束語(yǔ)

組織切片免疫熒光染色及成像是研究組織形態(tài)和組織原位抗原表達(dá)非常重要的檢測(cè)手段，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究和臨床病例診斷的各個(gè)領(lǐng)域。近年來(lái)，人們對(duì)于免疫熒光成像不僅僅局限在幾個(gè)樣品，或者是局部位置；而且更關(guān)注原位抗原表達(dá)在整個(gè)組織切片中的位置或者數(shù)量，這就需要研究者們運(yùn)用大圖拼接的方式去對(duì)信號(hào)進(jìn)行成像，即利用高倍鏡的高分辨率，又可以通過(guò)多張拍攝拼接起來(lái)獲得整體的組織圖像。因此，將高通量自動(dòng)化拍攝和激光掃描共聚焦顯微鏡聯(lián)合起來(lái)，不僅利用激光掃描共聚焦顯微鏡獲得高分辨率、高信噪比的圖像，而且使用高通量的拍攝程序達(dá)到自動(dòng)化、多樣品的目的?？蒲腥藛T只需要將樣品放置于適配器上，以Z軸高度置于焦面附近，啟動(dòng)程序即可完成拍攝任務(wù)。

經(jīng)過(guò)多次測(cè)試，成年小鼠的脾臟，一次可完成20個(gè)樣品的全自動(dòng)拍攝；小鼠腦片一次可完成40 個(gè)左右樣品的拍攝，因此高通量自動(dòng)化拍攝彌補(bǔ)了現(xiàn)在商業(yè)化共聚焦無(wú)法離開(kāi)人的短板，而這也是高端精密儀器的趨勢(shì)，盡量能自動(dòng)化、智能化。讓公共平臺(tái)的儀器可達(dá)到7 d 24 h 全時(shí)段的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而釋放平臺(tái)的服務(wù)潛能，提高儀器的使用效率。另外，本研究編寫的拍攝程序只是針對(duì)多玻片的拍攝，后續(xù)可根據(jù)用戶需求增加圖像處理的程序。在拍攝完成之后，直接以Excel、散點(diǎn)圖、柱形圖等出示需要分析和統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。該研究成果可以運(yùn)用到大部分類似的激光掃描共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡上，對(duì)顯微鏡的配置要求是裝有Nis-elements AR 5.2版本以上的軟件，并包含HCA/Jobs模塊，顯微鏡主體型號(hào)為Nikon Ti-E 或者Nikon Ti2，希望可以給相關(guān)研究提供一定的借鑒和參考。