施鈞瀚,姚靜,王艷麗,張耀,曹英杰,,4,桂新景,王青曉,岳佑凇,路露,張璐,李學(xué)林,劉瑞新

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室,鄭州 450008;3.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,鄭州 450046;4.河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點實驗室,鄭州 450000;5.河南省中藥臨床應(yīng)用、評價與轉(zhuǎn)化工程研究中心,河南省中藥安全評價與風險防控工程研究中心,鄭州 450000;6.河南省藥品醫(yī)療器械檢驗院,鄭州 450000)

中藥配方顆粒(dispensing granule of Chinese medicine,DGCM)改進了傳統(tǒng)湯劑(traditional decoction,TD)絕大多數(shù)弊端,是對傳統(tǒng)湯劑的一次突破[1-2]。但其試點20多年以來一直發(fā)展緩慢,究其原因就是DGCM與傳統(tǒng)湯劑的等效性問題[2-3]。近年來,研究人員對二者進行了對比研究[4-7],但這些研究并不能解除人們對配方顆粒療效的擔憂[8-9]。此外,對于DGCM的研究主要集中在實驗室條件下的成分對比[10-12],研究者采用同批次飲片自制配方顆粒與其所制傳統(tǒng)湯劑進行比較,或選用由配方顆粒廠家提供的配方顆粒及同來源飲片(同批次),這種方法雖然可以比較制備工藝不同所致差異,但不能完全重現(xiàn)患者在醫(yī)院就診后,依據(jù)醫(yī)師處方所得的傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒的一致性,在飲片質(zhì)量等級和制備工藝的雙重影響下,傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒在真實世界存在很大差異。本實驗在真實世界條件下采集制備傳統(tǒng)湯劑與DGCM樣品,對比研究其化學(xué)成分是否相同。

桂枝甘草湯(Guizhi Gancao decoction,GGD)出自《傷寒論》[11],處方組成為:桂枝(去皮)四兩(12 g),甘草(炙)二兩(6 g)。該方為溫陽益氣、治療心悸基本方,臨床常作為藥對使用,又因為該處方藥味較少,便于研究,同時兼顧研究單煎合煎是否相同,并且處方化學(xué)成分具有代表性,甘草中指標性成分甘草苷和甘草酸銨為水溶性成分,桂枝中指標性成分桂皮醛具有揮發(fā)性,另外還含有活性成分肉桂酸,因此筆者在本實驗以GGD為研究對象,通過高效液相色譜(HPLC)特征圖譜方法,比較傳統(tǒng)湯劑與DGCM化學(xué)成分差異,以期為傳統(tǒng)湯劑改革及配方顆粒合理應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waterse 2695高效液相色譜儀、EmPower色譜工作站(美國沃特世公司);CP225 D電子分析天平(德國Sartorius)。

1.2試藥 乙腈、甲醇、磷酸為色譜純(西格瑪公司);超純水(采用MilliPoreQ,18.2 MQ·cm制備);其他試劑均為分析純。

桂枝(產(chǎn)地:廣西,批號:1801181,180401,180721)、炙甘草(產(chǎn)地:內(nèi)蒙古,批號:180309,180804,190314)飲片購買于多家中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院、鄭州市中醫(yī)院),經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定,桂枝基原為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.;甘草基原為豆科植物光果甘草GlycyrrhizaglabraL.。9批桂枝配方顆粒(A廠3批,每克顆粒相當于飲片12 g,批號:1601628,1607633,1605608;B廠3批,每克顆粒相當于飲片12 g,批號:1609001,1612024,1602031;C廠3批,每克顆粒相當于飲片21 g,批號:16030081,16032685,16030402),9批炙甘草配方顆粒(A廠3批,每克顆粒相當于飲片3 g,批號:1601622,1605616,1608636;B廠3批,每克顆粒相當于飲片3 g,批號:16080116,161003w,1511001s;C廠3批,每克顆粒相當于飲片7 g,批號:16010013,16101025,16120502);甘草苷對照品(批號:111610-201607)、肉桂酸對照品(批號:110786-201604)、桂皮醛對照品(批號:110710-201821)、甘草酸銨對照品(批號:110731-201720)均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.1 mol·L-1磷酸溶液,梯度洗脫程序見表1[12];流量1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm;柱溫25 ℃;進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2樣品的制備

2.2.1傳統(tǒng)湯劑樣品 取桂枝12 g、炙甘草6 g,加10倍量水(180 mL)浸泡30 min,加熱至沸騰,并保持微沸狀態(tài)20 min,趁熱濾過,放冷,藥渣加8倍量水(144 mL),再煎煮20 min,趁熱濾過,放冷,合并2次濾液[13],置250 mL量瓶,加水至刻度,備用(取不同批次飲片同法制備3份樣品)。

2.2.2A、B、C廠DGCM 樣品 取相當于桂枝飲片12 g、炙甘草飲片6 g的配方顆粒(按照廠家標示濃縮比折算),置250 mL量瓶,加熱水使溶解,放冷,加水定容至刻度,混勻,即得。取A、B、C廠配方顆粒各3批,分別同法制備樣品。

2.3供試品溶液的制備 取“2.2”項下傳統(tǒng)湯劑及A、B、C廠DGCM 各25 mL,分別置50 mL量瓶,加甲醇至刻度,搖勻,靜置,取上清液過孔徑0.45 μm微孔濾膜,即得。傳統(tǒng)湯劑 3批與3個廠家各3批配方顆粒分別標記為傳統(tǒng)湯劑1、傳統(tǒng)湯劑2、傳統(tǒng)湯劑3、A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。

2.4對照品溶液的制備 分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸對照品,加甲醇溶解,分別制成甘草苷1.126 4 mg·mL-1、甘草酸銨1.216 8 mg·mL-1、桂皮醛1.306 4 mg·mL-1、肉桂酸1.224 0 mg·mL-1儲備液,再分別精密量取儲備液0.5 mL,置10 mL量瓶,加甲醇至刻度,制成甘草苷56.32 μg·mL-1、甘草酸銨60.84 μg·mL-1、桂皮醛65.32 μg·mL-1、肉桂酸61.2 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.5 陰性供試品溶液的制備

2.5.1缺桂枝陰性(即甘草飲片)供試品溶液 原方去桂枝,按傳統(tǒng)湯劑樣品溶液制備方法制備缺桂枝陰性樣品溶液,并按“2.3”項方法制備缺桂枝陰性供試品溶液。

2.5.2缺甘草陰性(即桂枝飲片)供試品溶液 原方去甘草,按傳統(tǒng)湯劑樣品溶液的制備方法制備缺甘草陰性樣品溶液,并按“2.3”項方法制備缺甘草陰性供試品溶液。

2.6方法學(xué)驗證

2.6.1專屬性考察 分別取“2.2”項混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液,按“2.1”項色譜條件,分別進樣并記錄色譜圖。樣品中甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸的色譜峰與對照品一致且無干擾,該方法專屬性良好。

2.6.2重復(fù)性實驗 精密吸取傳統(tǒng)湯劑1供試品溶液,按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次測定,記錄色譜圖。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化,RSD在0.1%～0.2%;相對峰面積RSD集中在0.5%～2.8%;甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸峰面積的RSD分別為2.2%,0.5%,2.5%,1.0%,保留時間的RSD分別為0.1%,0.1%,0.2%,0.1%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6.3穩(wěn)定性實驗 精密吸取傳統(tǒng)湯劑1供試品溶液,分別于0,2,4,8,12,16,24 h按“2.1”項色譜條件進樣分析,結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化,RSD在0.1%～0.6%;相對峰面積RSD集中在0.5%～4.6%;甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸峰面積的RSD分別為2.9%,0.5%,3.1%,1.1%,保留時間的RSD分別為0.1%,0.1%,0.2%,0.1%,結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4線性關(guān)系考察 取甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸對照品溶液,分別配制成0.554 4,0.600 8,0.655 6,0.612 4 mg·mL-1溶液,精密量取以上溶液0.1,0.2,0.5,1,1.5,2 mL,分別置10 mL量瓶,加甲醇定容,搖勻,即得不同濃度對照品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣10 μL,以峰面積積分值為縱坐標(Y)、進樣量為橫坐標(X),進行線性回歸,繪制標準曲線,計算 4個成分的線性回歸方程及線性范圍,結(jié)果見表2。

表2 各成分線性回歸方程及線性范圍

2.6.5加樣回收率實驗 精密量取已知各指標成分含量的同一批傳統(tǒng)湯劑樣品6份,每份12.5 mL。分別精密加入1.126 4 mg·mL-1甘草苷溶液0.5 mL、1.216 8 mg·mL-1甘草酸銨溶液2.5 mL、1.306 4 mg·mL-1桂皮醛溶液2.5 mL、1.224 0 mg·mL-1肉桂酸溶液2 mL,加甲醇至25 mL,按照“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣測定,計算回收率,結(jié)果甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸平均加樣回收率分別為100.9%,100.1%,99.3%,100.1%;RSD分別為1.9%,1.5%,1.5%,0.8%,見表3。

表3 桂枝甘草湯加樣回收率實驗結(jié)果

2.7特征圖譜的建立及圖譜采集

2.7.1特征圖譜的建立 分別取桂枝、甘草飲片3批,按照“2.2.1”項下方法制成湯劑,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項下色譜條件進行測定,參照文獻[12]建立GGD特征圖譜,確定肉桂酸為參比峰,并確定25個共有峰作為標準湯劑共有峰。

2.7.2傳統(tǒng)湯劑與DGCM特征圖譜的采集 分別精密吸取“2.3”項各供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,按照“2.1”項所建立的色譜條件進樣測定,記錄GGD 傳統(tǒng)湯劑和3個廠家DGCM的HPLC特征圖譜。結(jié)果見圖1。

圖1 桂枝甘草湯不同樣品匹配色譜圖(254 nm)

2.7.3主要色譜峰的鑒定與歸屬 分別精密吸取“2.3”“ 2.4”“ 2.5”項對照品溶液、傳統(tǒng)湯劑供試品溶液和陰性供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,按照“2.1”項所建立的色譜條件進樣測定,記錄HPLC圖譜。結(jié)果見圖2。

由對照品及陰性供試品對比可知,1,3,4,5,6,7,11,12,17,18號峰為桂枝中成分;2,8,10,13,14,19,20,22,23,24,25號峰為炙甘草中成分;9,15,16,21號峰桂枝甘草中均有。通過峰面積大小對比,9,16,21號峰以桂枝中為主,峰面積約為炙甘草中的10倍,15號峰峰面積兩者相差不大,應(yīng)為兩者共有峰。另外,10號峰為甘草苷,17號峰為肉桂酸,18號峰為桂皮醛,24號峰為甘草酸銨。

2.8特征圖譜比較

2.8.1傳統(tǒng)湯劑、DGCM特征圖譜相關(guān)性 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》評價桂枝甘草湯傳統(tǒng)湯劑、3個廠家DGCM的特征圖譜相關(guān)參數(shù),設(shè)定參照圖譜,將色譜峰自動匹配,生成對照圖譜(R,平均值法),并進行譜峰差異性評價和整體相似性評價。相似度評價結(jié)果表明,傳統(tǒng)湯劑與DGCM相似度較低(相似度<0.4),A、B、C廠家DGCM之間相似度較高(相似度>0.8)。見表4。

2.8.2化學(xué)成分種類和數(shù)目比較 通過比較特征圖譜峰數(shù),傳統(tǒng)湯劑中12,21號峰在3廠家DGCM中均檢測不到;在C廠家DGCM中檢測不到11,13號峰,在A廠家DGCM中18號峰峰面積較小,而B、C廠家DGCM中檢測不到18號峰。通過比較特征圖譜峰面積發(fā)現(xiàn),共有峰色譜峰峰面積不同,與傳統(tǒng)湯劑相比有高有低。綜上所述,DGCM與傳統(tǒng)湯劑在化學(xué)成分種類與數(shù)目上存在一定差異,傳統(tǒng)湯劑共有色譜峰25個,3家DGCM能檢出峰數(shù)目分別為23個(A廠)、22個(B廠)、20個(C廠)。另外,B廠家顆粒比傳統(tǒng)湯劑有明顯多出的色譜峰,原因有2種可能,一種是B廠家所用的原料飲片基原不同,另一種是B廠家所用的加工工藝不同。

2.8.3共有峰峰面積比較 將3批傳統(tǒng)湯劑色譜圖中各共有峰總峰面積均值定為1,采用歸一化法求得其他供試品共有峰總峰面積相對值,結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)湯劑比較,A廠家配方顆粒圖譜有7個峰峰面積明顯較高(P<0.05),8個峰峰面積相當,10個明顯較低(有2個測不到峰面積);B廠家配方顆粒圖譜中有6個峰峰面積明顯較高,8個峰峰面積相當,11個較低(有3個測不到峰面積);C廠家配方顆粒圖譜中有3個峰峰面積相當,其余均明顯較低(有5個測不到峰面積)。以3批傳統(tǒng)湯劑色譜圖中所有共有峰總峰面積的均值定為1,采用歸一化法求得其他供試品共有峰總峰面積的相對值。結(jié)果顯示4類供試品(傳統(tǒng)湯劑及A、B、C廠DGCM)中各成分含量的相對總和比值分別為1,0.64,0.47,0.14,說明DGCM中各成分含量總和均低于傳統(tǒng)湯劑。

圖3 不同GGD樣品共有峰峰面積

2.8.4已知成分含量比較 采用外標一點法計算甘草苷、甘草酸銨、桂皮醛、肉桂酸含量。運用t檢驗評價A、B、C廠DGCM供試品中含量與傳統(tǒng)湯劑供試品的差異,以傳統(tǒng)湯劑中各指標成分含量平均值為1,采用歸一化法求得其他供試品中各指標成分含量相對值,結(jié)果見圖4。由圖4可知,不同供試品中甘草苷含量:A廠>B廠(P<0.01)≈傳統(tǒng)湯劑(P>0.05)>C廠(P<0.05);甘草酸銨含量:A廠>B廠(P<0.01)≈傳統(tǒng)湯劑(P>0.05)>C廠(P<0.01);肉桂酸含量:B廠>傳統(tǒng)湯劑(P<0.01)≈A廠(P>0.05)>C廠(P<0.05);3個廠家配方顆粒中桂皮醛含量極低,遠低于傳統(tǒng)湯劑(P<0.01)。

圖4 GGD不同樣品中甘草苷、甘草酸銨、肉桂酸、桂皮醛含量

3 討論

3.1樣品來源的選擇與確定 筆者在本實驗以臨床常用經(jīng)典藥對GGD為研究載體,所用飲片和配方顆粒均從醫(yī)療機構(gòu)購買,選擇臨床醫(yī)療實際中真實存在的兩類湯劑形式——由醫(yī)療機構(gòu)購得的飲片制備的傳統(tǒng)湯劑與由醫(yī)療機構(gòu)購得的配方顆粒制備的配方顆粒湯劑——作為對比對象,而對該兩類對比對象的制備原料——飲片批次不做統(tǒng)一要求,目的是反映患者的真實用藥情況。基于課題組之前對當歸補血湯[13]的研究經(jīng)驗,筆者在后期實驗設(shè)計中,有意按照“科研結(jié)合臨床、科研結(jié)合實際”原則,以“黑箱”方法和“整體觀”思想為指導(dǎo),以問題為導(dǎo)向、以結(jié)果為導(dǎo)向,大膽拋開各類“過程”的復(fù)雜影響,化繁為簡,直接對真實世界中帶有自身固有特征的兩類對象進行對比,試圖發(fā)現(xiàn)共性問題和規(guī)律,使結(jié)論更能反映臨床實際,更能指導(dǎo)臨床合理使用配方顆粒。

3.2色譜條件的選擇 色譜條件采用文獻[12]方法,該方法經(jīng)反復(fù)驗證,穩(wěn)定可靠。本實驗樣品及供試品處理方法略有不同,供試品濃度比之前研究中供試品濃度高,樣品中峰面積更為突出,因而所選共有峰僅有3個較小的峰不同,其余共有峰均相同。

3.3指標性成分的確定 桂枝中含有化學(xué)成分苯丙素、木脂素、簡單芳香小分子等化合物,也含少量萜類、黃酮類、苷類等化合物。其中揮發(fā)油類主要成分為桂皮醛,具有良好的抗腫瘤、抗炎、血管保護、抗過敏等作用[14-15]。另外,桂枝中還含有肉桂酸,具有抗炎、發(fā)汗等功效,桂皮醛具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[15]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版把桂皮醛作為桂枝藥材的指標性成分進行含量控制[16]。甘草苷、甘草酸銨是甘草中主要活性成分,具有保肝、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、殺菌等作用[17-21],因此選桂皮醛、肉桂酸、甘草苷、甘草酸銨為含量測定指標。

3.4指標性成分含量分析比較 通過對比傳統(tǒng)湯劑和3個廠家DGCM指標性成分的含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于化學(xué)成分甘草苷、甘草酸銨,與傳統(tǒng)湯劑相比,A廠家配方顆粒含量高,B廠配方顆粒無差異,而C廠配方顆粒含量低;對于肉桂酸,A廠配方顆粒無差異,B廠配方顆粒含量高,而C廠配方顆粒含量低;對于桂皮醛,3廠配方顆粒中含量均低,幾乎檢測不到。

復(fù)方煎煮過程中,會導(dǎo)致一些成分含量發(fā)生變化,甚至產(chǎn)生新成分[22]。3個廠家配方顆粒中桂皮醛含量極低,而肉桂酸含量相對較高,因為桂皮醛為揮發(fā)性成分,并且不穩(wěn)定,易氧化成肉桂酸,因此推測可能桂枝配方顆粒制備或存放過程中,桂皮醛因具有揮發(fā)性和還原性,可能揮發(fā)或者氧化而幾乎全部損失了。

另外,B廠家DGCM中有明顯多出的色譜峰,本實驗主要研究傳統(tǒng)湯劑與DGCM的差異,并不能確定是原料基原不同還是加工工藝不同所致,這也從另一方面說明統(tǒng)一配方顆粒行業(yè)標準的必要性。此外,筆者在本實驗對傳統(tǒng)湯劑的選擇僅為鄭州市3家醫(yī)院,一定程度上只代表本地域內(nèi)傳統(tǒng)湯劑與DGCM差異,后期將進一步擴大傳統(tǒng)湯劑樣本選擇范圍,以期得到更具普遍意義的結(jié)論。

3.5特征圖譜的分析比較 特征圖譜技術(shù)能全面反映中藥飲片或制劑內(nèi)在化學(xué)特征,具有“整體性”和“模糊性”特點,適用于評價DGCM質(zhì)量[23]。筆者在本實驗通過比較GGD 傳統(tǒng)湯劑與3個廠家DGCM特征圖譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個廠家DGCM與傳統(tǒng)湯劑相比,化學(xué)成分種類和含量均有一定差異,傳統(tǒng)湯劑化學(xué)成分種類較多,DGCM中化學(xué)成分而有升有降,其中C廠家各指標成分含量及峰面積相對均較小。并對其相關(guān)性進行分析,結(jié)果3個廠家配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的相似度<0.4,3個廠家配方顆粒之間相似度>0.8。

綜上所述,患者實際使用的傳統(tǒng)湯劑與DGCM相比,其化學(xué)成分含量存在差異。原因可能與中藥飲片、制備工藝等不同所致。由此可見,國家統(tǒng)一配方顆質(zhì)量標準確有必要,否則會影響臨床使用效果[24]。這也進一步提示,臨床用藥時應(yīng)以傳統(tǒng)湯劑為參考標準,結(jié)合各類湯劑的成分特點、藥性特點及疾病特點等全面權(quán)衡,合理確定給藥劑量。筆者在本實驗僅從體外化學(xué)成分層面對其進行對比,其入血成分及相應(yīng)藥理作用的對比,課題組后續(xù)將進行深入探討,以獲取更全面的二者差異規(guī)律。