徐依萍,黃嘉玲,劉忠斌,楊 琨,葛 頌

口腔癌是全球最普遍的癌癥之一,根據(jù)2020年統(tǒng)計(jì),全球每年新發(fā)病例377 713例,死亡177 757例[1]。口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見(jiàn)的口腔癌類(lèi)型,占所有口腔癌的90%以上[2]。盡管OSCC的臨床治療取得了較大進(jìn)展,但OSCC患者的預(yù)后仍然很差,5年生存率僅為40%～50%[3],這極大增加了全球公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。

口腔黏膜暴露于大量微生物中,這些微生物組成了口腔微生物群,其中牙菌斑生物膜是口腔中主要的微生物生態(tài)群體。最近有報(bào)道稱(chēng),齦下微生物群及其代謝副產(chǎn)物會(huì)改變上皮細(xì)胞遺傳特性并促使其發(fā)生癌變[4]。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)是牙菌斑生物膜發(fā)育和成熟的關(guān)鍵參與者,也是口腔感染部位的優(yōu)勢(shì)菌,當(dāng)細(xì)菌群落中的平衡被破壞時(shí),它便能促進(jìn)炎癥和抑制局部免疫反應(yīng)[5]。不僅于此,Fn與OSCC之間同樣存在關(guān)聯(lián)性。越來(lái)越多的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Fn可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移、耐藥性等多種腫瘤生物學(xué)特性,促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展。本文就Fn與OSCC的相關(guān)性和潛在相關(guān)機(jī)制以及Fn在OSCC靶向治療中的作用展開(kāi)綜述,以期為OSCC的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

1 Fn與OSCC的相關(guān)性

Fn是一種革蘭氏陰性專(zhuān)性厭氧無(wú)芽孢桿菌,屬于梭桿菌屬,因其細(xì)長(zhǎng)的形狀和兩端的紡錘狀尖端而得名,是牙周炎主要致病菌之一[5]。隨著研究的不斷深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Fn不僅在OSCC組織中富集,而且能促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展。早在1998年,Nagy等[6]就觀察了與OSCC相關(guān)的口腔細(xì)菌,其中就包括Fn。近年來(lái),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Fn在OSCC組織中相對(duì)豐度高于正常組織,并且是腫瘤組織中代表性最顯著的物種[7-8]。Zhang等[9]使用16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)了與OSCC相關(guān)的微生物群組成的變化,Fn、中間普氏菌(Prevotellaintermedia)、惰性凝集桿菌(Aggregatibactersegnis)、Capnocytophagaleadbetteri、口炎消化鏈球菌(Peptostreptococcusstomatis)等細(xì)菌與OSCC存在潛在關(guān)聯(lián),尤以Fn相關(guān)性最強(qiáng);并運(yùn)用PICRUSt技術(shù)預(yù)測(cè)分析微生物功能發(fā)現(xiàn),促炎因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)生物合成的基因及與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(細(xì)菌趨化及鞭毛組裝)相關(guān)的基因在OSCC組顯著富集,它們本質(zhì)上均具促炎作用,說(shuō)明以Fn為代表的炎癥性細(xì)菌組在介導(dǎo)促癌炎性環(huán)境中發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)宏轉(zhuǎn)錄組分析顯示,Fn是在OSCC腫瘤部位表達(dá)毒力因子最活躍的細(xì)菌,由此被認(rèn)為可能是導(dǎo)致OSCC患者口腔微生物組中毒力因子表達(dá)增加的主要原因[10]。Yang等[11]進(jìn)一步將微生物組的差異與癌癥進(jìn)展聯(lián)系起來(lái),發(fā)現(xiàn)OSCC進(jìn)展期患者Fn豐度顯著高于對(duì)照組(2.98%),其中Ⅳ期患者(7.92%)更為明顯,說(shuō)明Fn的豐度與惡化程度呈正相關(guān)。上述證據(jù)表明,Fn與OSCC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,且對(duì)Fn的檢測(cè)已被建議作為OSCC診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[12]。

2 Fn影響OSCC的潛在機(jī)制

2.1 Fn促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖

OSCC是一種上皮組織惡性腫瘤,Fn能通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、增加原癌基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

Fn可通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞DNA損傷促進(jìn)細(xì)胞增殖。Geng等[13]在體外用Fn感染Tca8113舌鱗癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞感染Fn(MOI=500)后,DNA損傷分子標(biāo)記物γ組蛋白H2A(γH2AX)表達(dá)增加,表明腫瘤發(fā)生了嚴(yán)重的DNA損傷,負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展的p27下調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞周期加快,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng);同時(shí),參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的Ku70和p53的表達(dá)被下調(diào);研究者們還通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Ku70,發(fā)現(xiàn)p53的上調(diào)抑制了細(xì)胞增殖能力,因此他們認(rèn)為Fn通過(guò)Ku70/p53途徑在OSCC細(xì)胞中引起DNA損傷并促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外,Fn可活化toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)并向髓樣分化初級(jí)反應(yīng)基因88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)發(fā)出信號(hào)來(lái)增加miR-205-5p的表達(dá),抑制DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)DNA損傷及OSCC細(xì)胞增殖[14]。Fn還可通過(guò)TLR4/MyD88增加miR21的表達(dá),從而激活NF-κB及其下游促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放,增強(qiáng)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)上皮細(xì)胞增殖、遷移能力,促進(jìn)CRC的發(fā)生發(fā)展[15]。已有研究表明,CRC中的Fn菌株與從口腔中分離的該物種的菌株相同,這表明腫瘤內(nèi)Fn可能起源于口腔[16]。因此,我們推測(cè)這也是Fn影響OSCC細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

Fn上調(diào)原癌基因的表達(dá)亦可促進(jìn)細(xì)胞增殖。STAT3、JAK1和MYC是三種原癌基因,對(duì)癌細(xì)胞具有抗凋亡和促增殖作用。體外實(shí)驗(yàn)證明,在Fn體外感染OSCC細(xì)胞中,以上三種癌基因表達(dá)均上調(diào);另一方面,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,感染Fn的OSCC小鼠舌組織切片中癌細(xì)胞增生明顯,核質(zhì)比增加[17],表明Fn有助于OSCC存活并增強(qiáng)其增殖能力。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)也是一種重要的原癌基因,在通過(guò)G1至S期進(jìn)展的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用,其過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào),促進(jìn)細(xì)胞快速增長(zhǎng)[18];此外,Cyclin D1還與OSCC低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)[19]。Fn的FadA黏附素通過(guò)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)上調(diào)膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo),使Cyclin D1等癌基因過(guò)表達(dá),可導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖[20]。

2.2 Fn促進(jìn)OSCC侵襲遷移

Fn可通過(guò)引發(fā)口腔上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和促進(jìn)炎癥因子分泌進(jìn)而促進(jìn)OSCC侵襲轉(zhuǎn)移。

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象[21]。細(xì)胞通過(guò)此過(guò)程可能失去連接和極性,從而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力[22]。ZEB家族和SNAI1的轉(zhuǎn)錄因子在上皮細(xì)胞EMT中起著關(guān)鍵作用,其直接與E-cadherin基因的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá)[23]。值得一提的是,E-cadherin是一種腫瘤抑制劑,負(fù)向調(diào)控細(xì)胞遷移,現(xiàn)已證實(shí)Fn可直接通過(guò)下調(diào)E-cadherin表達(dá)促進(jìn)OSCC細(xì)胞遷移[24]。Harrandah等[17]發(fā)現(xiàn)Fn感染OSCC細(xì)胞能顯著誘導(dǎo)EMT標(biāo)志物ZEB1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)表達(dá)增加;與未感染的對(duì)照組相比,感染Fn的小鼠舌部腫物病變更重。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)也是EMT的重要調(diào)節(jié)劑[25]。張樹(shù)偉等[26]研究發(fā)現(xiàn)Fn感染導(dǎo)致lncRNA MIR4435-2HG的上調(diào),降低其特異性microRNA-296-5p的表達(dá),從而導(dǎo)致其靶基因Akt2表達(dá)增加,進(jìn)而激活了SNAI1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),最終促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變。最新研究發(fā)現(xiàn),Fn還通過(guò)上調(diào)OSCC細(xì)胞中部分EMT(partial-epithelial mesenchymal transition,p-EMT)相關(guān)基因來(lái)增強(qiáng)其侵襲能力[27],且p-EMT較完全EMT會(huì)帶來(lái)更高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[28]。

此外,Fn還可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子分泌進(jìn)而促進(jìn)OSCC侵襲轉(zhuǎn)移。一方面,Fn可感染牙齦上皮細(xì)胞(gingival epithelial cells,GECs)導(dǎo)致NF-κB的早期激活,上調(diào)前白介素1β(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)基因表達(dá),激活NLRP3炎癥小體,誘導(dǎo)活化半胱天冬酶1(caspase1),caspase1的活化可將pro-IL-1β切割成成熟的致炎因子IL-1β[29];另一方面,IL-1β的過(guò)表達(dá)使腫瘤細(xì)胞分泌致癌細(xì)胞因子IL-6、IL-8和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)癌基因α(growth-regulated oncogene-α,GRO-α),促進(jìn)血管生成并增加OSCC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致晚期OSCC患者不良預(yù)后[30]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)也是促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。研究表明,Fn及其細(xì)菌培養(yǎng)上清液均能上調(diào)OSCC細(xì)胞中MMP-1、MMP-9及IL-8的表達(dá),并增強(qiáng)其侵襲性,這一發(fā)現(xiàn)還說(shuō)明Fn可分泌某些活性物質(zhì),使Fn不與腫瘤細(xì)胞直接接觸即可發(fā)揮致癌作用[17]。Uitto等[31]發(fā)現(xiàn)Fn可刺激上皮細(xì)胞中p38 MAPK活性,進(jìn)而上調(diào)MMP-13 mRNA的表達(dá),促進(jìn)MMP-13的分泌,從而促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移。這一研究結(jié)果與Johansson等研究結(jié)果[32]相符,他們發(fā)現(xiàn)MMP-13在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)并增強(qiáng)OSCC侵襲轉(zhuǎn)移能力。

2.3 Fn增強(qiáng)OSCC耐藥性

化療藥物可縮小腫瘤大小,從而促進(jìn)放療可行性并減小手術(shù)所造成的頜面部破壞范圍[33]。順鉑因其有效的抗癌作用及低成本的優(yōu)勢(shì),被用作抗腫瘤一線治療藥物。它通過(guò)產(chǎn)生不可修復(fù)的DNA損傷來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老或觸發(fā)內(nèi)在的凋亡機(jī)制,從而殺死腫瘤細(xì)胞[34]。但越來(lái)越多研究證明,Fn感染會(huì)導(dǎo)致OSCC對(duì)化療藥物的耐藥性。

Fn可通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路增強(qiáng)OSCC耐藥性。研究發(fā)現(xiàn),Fn的LPS可通過(guò)TLR4/MyD88激活OSCC細(xì)胞中p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路并刺激IL-6、IL-8和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生,這三種細(xì)胞因子均與促血管生成有關(guān),進(jìn)而可能導(dǎo)致OSCC對(duì)順鉑的耐藥性[35];因此,抑制TLR4及其信號(hào)通路可能會(huì)提高對(duì)順鉑的敏感性,并有助于改善OSCC患者的預(yù)后。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用Fn預(yù)處理口腔舌鱗癌細(xì)胞系Cal-27和HSC-3細(xì)胞,與對(duì)照組未處理的癌細(xì)胞相比,各組加入順鉑后,Fn組癌細(xì)胞死亡率更低;這可能與Fn可上調(diào)Wnt5a的轉(zhuǎn)錄水平,激活Wnt/Ca2+通路,并通過(guò)活化T細(xì)胞核因子3(nuclear factors of activated T cells 3,NFATc3)下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白p53表達(dá)有關(guān)。因此,Fn可能通過(guò)Wnt/NFAT通路促進(jìn)OSCC細(xì)胞的順鉑耐藥[24]。

Fn還可通過(guò)促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌中的細(xì)胞自噬產(chǎn)生化療耐藥性。一項(xiàng)臨床隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn),瘤內(nèi)Fn水平較高的食管鱗癌(oesophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者對(duì)化療抵抗力更大;通過(guò)體外Fn感染ESCC細(xì)胞研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Fn使化療條件下的ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)速率加快、凋亡降低,細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)顯著高于對(duì)照組且與FnDNA的量呈正相關(guān)[36]。頭頸部鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是ESCC的第二多見(jiàn)原發(fā)癌、與ESCC之間存在密切相關(guān)性[37],而OSCC是HNSCC主要類(lèi)型之一,且口腔與食管同屬上消化道,致病環(huán)境相通。因此,我們推測(cè)細(xì)胞自噬導(dǎo)致的耐藥機(jī)制在OSCC中同樣存在;同時(shí),這也提示自噬標(biāo)志物及FnDNA表達(dá)水平可能成為疾病進(jìn)展及預(yù)后的臨床標(biāo)志物[36]。

3 以Fn為靶點(diǎn)的OSCC治療策略

3.1 抗生素治療

甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾?lèi)藥物,是一種針對(duì)革蘭氏陰性菌的強(qiáng)效抗菌藥[38]。研究發(fā)現(xiàn),以甲硝唑?yàn)榇淼目股刂委熆韶?fù)向調(diào)節(jié)由Fn誘導(dǎo)的多種腫瘤進(jìn)展。甲硝唑可降低結(jié)腸癌小鼠Fn負(fù)載、癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[39],預(yù)防乳腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移[40],逆轉(zhuǎn)Fn誘導(dǎo)的ESCC化療藥物耐藥性[36]。為避免全身多劑量用藥導(dǎo)致的耐藥及菌群失調(diào)風(fēng)險(xiǎn),OSCC患者可采用口腔局部用藥的方式,如含漱或局部涂擦[41]。然而,目前仍缺乏抗生素通過(guò)降低Fn負(fù)載抑制OSCC發(fā)生發(fā)展的直接證據(jù),因此,基于上述作用機(jī)制開(kāi)展大規(guī)模多中心臨床研究、深入挖掘靶標(biāo)于Fn的抗生素對(duì)OSCC的治療潛力是非常必要的。

3.2 益生菌輔助

近年來(lái),大量研究證明了益生菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)Fn的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),活的和熱滅活的益生菌對(duì)Fn均有較強(qiáng)的抑制作用,尤以活益生菌效果更佳,其具有作為抗菌和抗致瘤劑的治療潛力[42]。乳酸菌代謝產(chǎn)物苯乳酸能改變Fn細(xì)胞膜的通透性使胞內(nèi)蛋白外泄;并降低Fn黏附性,破壞生物膜結(jié)構(gòu),從而達(dá)到對(duì)Fn良好的抑菌作用[43]。Kamarajan等[44]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素乳酸鏈球菌素可逆轉(zhuǎn)Fn通過(guò)TLR/MyD88所介導(dǎo)的OSCC遷移、侵襲及瘤體增大。然而,益生菌輔助療法存在菌血癥或敗血癥的風(fēng)險(xiǎn),為保證其安全性,仍需進(jìn)行長(zhǎng)期的評(píng)估與研究[45]。

3.3 Fn致癌相關(guān)蛋白抑制劑

針對(duì)Fn致癌相關(guān)蛋白,包括Fn表面關(guān)鍵蛋白及腫瘤細(xì)胞表面受體TLR4的特異性靶向藥物對(duì)OSCC具有較好的療效。FomA是Fn表達(dá)最高的外膜蛋白之一,在Fn自聚集及入侵口腔上皮細(xì)胞等方面起到重要作用[46]。靶向FomA的疫苗可抑制Fn共聚、生物膜形成及入侵靶細(xì)胞[41]。研究證明,Fn表面蛋白Fap2可與人抑制受體TIGIT結(jié)合,抑制自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞等免疫細(xì)胞毒性從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,靶向Fap2的疫苗可恢復(fù)NK細(xì)胞的殺傷能力[47]。這些藥物理論上均可阻礙OSCC進(jìn)展。同時(shí),鑒于Fn促進(jìn)OSCC進(jìn)展需通過(guò)TLR4介導(dǎo),研究發(fā)現(xiàn)在miR-195高表達(dá)的OSCC細(xì)胞中,TLR4蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng),從而發(fā)揮抗腫瘤作用[48]。但TLR4對(duì)維持機(jī)體正常生理活動(dòng)起到重要作用,因此其不良反應(yīng)也有待深入研究。

3.4 噬菌體療法

由于細(xì)菌生物膜對(duì)常規(guī)抗菌療法具有高度耐藥性,對(duì)口腔生物膜進(jìn)行生物控制的創(chuàng)新方案層出不窮,其中噬菌體療法具有一定代表性[49]。噬菌體作為一種特異性感染的病毒,對(duì)細(xì)菌具有強(qiáng)殺傷力,可在活菌內(nèi)自我增殖,并可滲透至口腔生物膜中[50]。已有研究證明噬菌體FNU1能破壞Fn生物膜,并能有效殺傷生物膜內(nèi)細(xì)胞,它可被配制成糊劑涂抹至黏膜上,使噬菌體緩慢釋放[51],對(duì)OSCC發(fā)揮靶向抗腫瘤作用。噬菌體還可與其他抗菌劑一起使用,以提高生物膜控制的有效性[52],但其最佳給藥方式還需進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

Fn能夠通過(guò)促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力、產(chǎn)生對(duì)化療藥物耐藥性等機(jī)制促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展(圖1)。其中TLR4/MyD88、NF-κB及p38MAPK等途徑參與多個(gè)致癌過(guò)程,MMP及IL等炎性因子也在多條致病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,因此,以Fn及其相關(guān)致病分子為靶點(diǎn)的靶向精準(zhǔn)治療可能成為OSCC防治或改善預(yù)后的新思路。目前以Fn為對(duì)象的治療策略主要集中在抗生素、益生菌、Fn致癌相關(guān)蛋白抑制劑及噬菌體方面,但這些治療方法的有效性缺乏臨床應(yīng)用證據(jù),其開(kāi)發(fā)與利用需更全面地考量。

圖1 Fn增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性的分子機(jī)制Fig.1 Molecular mechanism of Fn enhancing proliferation, invasion, metastasis and drug resistance of OSCC cells

所有作者聲明不存在利益沖突。