張琴琴,馬 鳴,花 榮,呂 盈,史般若,吳翹楚,魏 昕

白念珠菌是機(jī)體常見條件致病菌[1],生物膜是其主要致病狀態(tài)。由于胞外基質(zhì)的保護(hù),生物膜狀態(tài)的白念珠菌致病性和耐受性較浮游狀態(tài)更強(qiáng)[2-3]。葡聚糖是白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分,與生物膜的形成密切相關(guān)[4]。細(xì)胞壁和細(xì)胞外基質(zhì)中的葡聚糖成分還能和抗真菌藥物結(jié)合,以阻止藥物到達(dá)深層細(xì)胞。因此,葡聚糖的改變可影響傳統(tǒng)抗真菌藥物對(duì)白念珠菌生物膜細(xì)胞的作用[5]。

法尼醇是一種重要的密度感應(yīng)分子(quorum sensing molecular,QSM),當(dāng)微生物種群密度增加引起細(xì)胞外環(huán)境中QSM的積累達(dá)到閾值濃度時(shí),可以誘導(dǎo)或抑制微生物基因表達(dá)[3,6]。在白念珠菌中,法尼醇參與抑制菌絲及生物膜形成,并且一定濃度的法尼醇還可以抑制白念珠菌的生長,誘導(dǎo)其凋亡[7-8]。目前,關(guān)于法尼醇能否通過影響真菌細(xì)胞壁的葡聚糖來改變白念珠菌細(xì)胞壁的形態(tài),并通過這種細(xì)胞壁形態(tài)的改變影響白念珠菌生物膜耐藥性的相關(guān)研究罕見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬探究法尼醇對(duì)白念珠菌生物膜形態(tài)、葡聚糖基因表達(dá)的影響及白念珠菌耐藥相關(guān)性,以期為白念珠菌感染的治療和真菌耐藥機(jī)制的探索提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(SC5314)由上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。沙堡瓊脂培養(yǎng)基(Sabourd's dextroseagar,SDA)(63.0 g/L)(上 海樊客生物科技有限公司,中國),YPD培養(yǎng)液(2%葡萄糖、1%酵母提取物,BioFroxx,德國),2%胰蛋白胨(Oxoid,英國),PBS緩沖液(索萊寶,中國),RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),氟康唑、法尼醇(Sigma,美國),2.5%戊二醛(北京雷根生物技術(shù)有限公司,中國),KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)(溫州康泰生物科技有限公司,中國),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司,中國),iTaq SYBR Green預(yù)混酶(BIO-RAD,美國),YCP系列二氧化碳培養(yǎng)箱(上海易亮醫(yī)療器械有限公司,中國),低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,德國),透射電鏡(FEI公司,美國)。

1.2 白念珠菌菌懸液的配制

將-70 ℃保存的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314接種到SDA培養(yǎng)基上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,取單克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖床過夜。2 100 ×g離心10 min,收集YPD培養(yǎng)液中的細(xì)胞,無菌PBS洗滌2次,細(xì)胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中,血細(xì)胞計(jì)數(shù)法制備成濃度為5×105CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。

1.3 氟康唑誘導(dǎo)耐藥株形成

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)CLSI M27-A3文件,檢測氟康唑?qū)Π啄钪榫鷺?biāo)準(zhǔn)株SC5314的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

在96孔培養(yǎng)板中加入100 μL氟康唑溶液(濃度依次為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL),再加入100 μL用RPMI 1640稀釋的白念珠菌菌懸液(稀釋后為2.5×103CFU/mL),空白組加入100 μL去離子水和100 μL白念珠菌菌懸液。將96孔板放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果。MIC為抑菌數(shù)量達(dá)80%的實(shí)驗(yàn)組所用的最低藥物濃度。

隨后,按照上面獲得的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的MIC值誘導(dǎo)氟康唑耐藥株。根據(jù)CLSI M27-A3 氟康唑耐藥株的判斷標(biāo)準(zhǔn),MIC≥ 64 μg/mL為耐藥菌株。本實(shí)驗(yàn)選用MIC≥128 μg/mL的菌株為耐藥株。將-70 ℃保種的白念株菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314接種到SDA培養(yǎng)基上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,挑取單克隆菌株于5 mL RPMI 1640中(含2×MIC藥物濃度的氟康唑),30 ℃、180 r/min搖床生長24 h,取100 μL菌懸液涂布于SDA培養(yǎng)基上(含4×MIC藥物濃度的氟康唑),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。用KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)檢測上述在含藥物SDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后白念珠菌的MIC。如果此次檢測所得MIC值<128 μg/mL,則重復(fù)上述步驟,直至MIC≥128 μg/mL。將取得的耐藥株菌懸液加入等體積30%甘油,-70 ℃保種。誘導(dǎo)成功的耐藥株在不含藥物的SDA培養(yǎng)基上每傳2代測1次MIC,以判斷其穩(wěn)定性。按照1.2的方法制備濃度為5×105CFU/mL的耐藥株菌懸液待用。

1.4 白念珠菌生物膜的構(gòu)建及法尼醇干預(yù)

將白念珠菌分為對(duì)照組、法尼醇處理組和耐藥株組,制備各組菌懸液并調(diào)整濃度為5×105CFU/mL,對(duì)照組及法尼醇處理組加入白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314菌懸液,耐藥株組加入耐藥株菌懸液,分別加入6孔板中。37 ℃、5% CO2孵育1 h后,移除培養(yǎng)液,無菌PBS輕洗3次以去除未黏附的細(xì)胞,加入RPMI 1640培養(yǎng)液。法尼醇處理組中加入法尼醇(濃度為100 μmol/L),對(duì)照組和耐藥株組中加入等體積的去離子水。在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至6、12、24、36 h。

1.5 透射電鏡觀察生物膜

將上述3組6、12、24、36 h生物膜用無菌刮刀剝離,收集于1.5 mL EP管中,2 100×g離心10 min,棄上清液。加入2.5%戊二醛1 mL,4 ℃固定6 h,送電鏡室脫水,包埋,切片,觀察。白念珠菌生物膜成熟大約需要24 h,因此本實(shí)驗(yàn)選擇24 h這一具有代表性時(shí)相的生物膜,分析細(xì)胞壁電子顆粒層和厚度。

1.6 白念珠菌總RNA提取

分組同1.4。選用50 mL的培養(yǎng)瓶作為生物膜構(gòu)建的載體,將6 mL濃度為5×105CFU/mL菌懸液加入培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2孵育1 h,此時(shí)在培養(yǎng)瓶底壁部形成白念珠菌早期生物膜。移出培養(yǎng)液,無菌PBS緩慢沖洗培養(yǎng)瓶3次,加入6 mL RPMI 1640培養(yǎng)液。法尼醇處理組中加入法尼醇(濃度為100 μmol/L),對(duì)照組和耐藥株組中加入等體積的去離子水,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。用無菌細(xì)胞刮刀刮取上述3組的24 h白念珠菌生物膜,并收集于15 mL離心管中,2 100×g離心10 min。棄上清液,每管加入400 μL TES和400 μL水飽和酚,劇烈振蕩混勻,63 ℃水浴1 h,其間每隔10 min劇烈振蕩1次。隨后,4 ℃冰浴5 min,12 000 r/min離心15 min。上層水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL水飽和酚劇烈振搖混勻,4 ℃、12 000 r/min離心15 min后將上層水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL氯仿劇烈振搖混勻,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,再將上層水相移至1.5 mL EP管中,加入40 μL的醋酸鈉(NaAc 3 mol/L,pH 5.2)及1 mL無水乙醇,-20 ℃靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min,棄上清液,加入700 μL 75%乙醇,8 000 r/min 離心5 min。棄上清液,室溫干燥后,加入30 μL DEPC水溶解,提取獲得RNA用于qPCR檢測。

1.7 qPCR檢測葡聚糖相關(guān)基因表達(dá)

葡聚糖相關(guān)基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)genebank白念珠菌SC5314基因序列設(shè)計(jì)并合成(表1),18S rRNA為內(nèi)參。使用前引物用無菌雙蒸水稀釋至20 μmol/L,參照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒說明書,將反應(yīng)物放在基因擴(kuò)增儀內(nèi)反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,采用iTaq SYBR Green預(yù)混酶進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)體系:10.0 μL iTaq SYBR Green預(yù)混酶,20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL,10倍稀釋的cDNA 1.0 μL,滅菌蒸餾水8.2 μL,反應(yīng)總體積20 μL。加好樣本的孔板放在ABI 7300 FAST型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),設(shè)置熒光定量PCR循環(huán)條件:95 ℃,2 min;95 ℃,10 s,循環(huán)40次;60 ℃,30 s;72 ℃,20 s;最后4 ℃冷卻。采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物Tab.1 qPCR primer

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件對(duì)對(duì)照組和耐藥組、對(duì)照組和法尼醇處理組的細(xì)胞壁厚度和qPCR結(jié)果分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 氟康唑耐藥株模型構(gòu)建成功

氟康唑?qū)Π啄钪榫鷺?biāo)準(zhǔn)株SC5314的MIC為0.5 μg/mL(圖1A)。經(jīng)KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測顯示,當(dāng)誘導(dǎo)株的MIC≥128 μg/mL時(shí),表示氟康唑耐藥菌株構(gòu)建完成(圖1B),每傳2代進(jìn)行菌株MIC的鑒定。

A:白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314,MIC值為0.5 μg/mL;B:氟康唑誘導(dǎo)耐藥株,MIC≥128 μg/mL

2.2 透射電鏡觀察白念珠菌生物膜

透射電鏡結(jié)果見圖2。白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的6、12、24、36 h生物膜的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整,未見明顯異常。法尼醇處理后,各時(shí)相生物膜出現(xiàn)細(xì)胞壁厚度不均勻、細(xì)胞壁溶解、細(xì)胞壁膜分離、波浪狀的細(xì)胞壁及細(xì)胞器形態(tài)改變等,法尼醇對(duì)各時(shí)相生物膜的抑制作用。在耐藥株組,可以觀察到各時(shí)相的細(xì)胞壁厚度有所增加,同時(shí)結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞器形態(tài)正常。

A～D:對(duì)照組;E～H:法尼醇處理組;I～L:耐藥株組

選取24 h白念珠菌生物膜,在200 000倍透射電鏡下觀察法尼醇干預(yù)后白念珠菌生物膜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化(圖3)。對(duì)照組中白念珠菌生物膜的細(xì)胞壁內(nèi)、外層分別是低密度電子層和高密度電子層,同時(shí)存在很多散在的電子顆粒,厚度約為(220.10±2.25)nm。與對(duì)照組相比,法尼醇處理組中白念珠菌生物膜細(xì)胞壁中電子顆粒減少,細(xì)胞壁的厚度((145.90±4.05)nm)也明顯更薄(P<0.05);耐藥株組白念珠菌生物膜細(xì)胞壁中電子顆粒增多,并且細(xì)胞壁的厚度((299.47±3.33)nm)也有所增加,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

A:對(duì)照組;B:法尼醇處理組;C:耐藥株組

2.3 葡聚糖相關(guān)基因表達(dá)

葡聚糖相關(guān)基因qPCR結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比,法尼醇處理組PIR1表達(dá)上調(diào)(P<0.01),PHR2表達(dá)上調(diào)(P<0.05),GSC1表達(dá)下調(diào)(P<0.05),BGL2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);耐藥株組PHR2表達(dá)下調(diào)(P<0.05),GSC1表達(dá)上調(diào)(P<0.01),PIR1和BGL2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與對(duì)照組相比,*:P<0.05,**:P<0.01

3 討 論

由于廣譜抗生素和皮質(zhì)類固醇濫用、侵入性醫(yī)療程序增加等,白念珠菌感染患者數(shù)不斷上升且耐藥株開始出現(xiàn)[9-11]。生物膜狀態(tài)下的白念珠菌被細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋保護(hù),能夠有效對(duì)抗藥物殺菌作用,維持微生物的毒性作用[2-3],耐藥性較浮游狀態(tài)大大增加[12],是目前臨床治療白念珠菌感染的難題。因此本實(shí)驗(yàn)選用生物膜狀態(tài)下的白念珠菌作為研究對(duì)象。氟康唑是臨床上治療白念珠菌感染的一線藥物,臨床分離的耐藥株中常見氟康唑耐藥株,故本實(shí)驗(yàn)選用氟康唑誘導(dǎo)構(gòu)建白念珠菌耐藥模型,探索其耐藥的機(jī)制。

葡聚糖作為白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分,與念珠菌耐藥密切相關(guān)。有研究表明,當(dāng)靜止相白念珠菌生長相關(guān)葡聚糖增多時(shí),白念珠菌對(duì)兩性霉素B的易感性減弱[13]。葡聚糖酶處理后,可明顯增強(qiáng)氟康唑和兩性霉素B對(duì)生物膜的抑制作用[5,14-15]。念珠菌細(xì)胞壁的低密度電子層和電子顆粒主要是葡聚糖和殼多糖[16]。葡聚糖起初為顆粒狀,繼而形成細(xì)纖維,隨后分出許多細(xì)絲形成纖維結(jié)構(gòu),接著大量β-葡聚糖分子聚集,形成念珠菌細(xì)胞壁的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17]。本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡觀察24 h的白念珠菌生物膜,發(fā)現(xiàn)耐藥株較白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞壁厚度增加,電子顆粒增多,增多的電子顆?？赡苁浅跗诘钠暇厶穷w粒。葡聚糖含量的改變導(dǎo)致細(xì)胞壁厚度的改變。此外,葡聚糖可以與抗真菌藥物結(jié)合,隨著結(jié)合的藥物增多,外來的藥物就不能到達(dá)深層的細(xì)胞。這表明耐藥株組的細(xì)胞壁厚度和葡聚糖含量增加可能與其耐藥性相關(guān)。

法尼醇由念珠菌分泌,能抑制白念珠菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變,進(jìn)而抑制生物膜的形成[6,18]。本實(shí)驗(yàn)觀察到在100 μmol/L的法尼醇作用下,白念珠菌細(xì)胞壁變形,厚度變薄,同時(shí)電子顆粒減少,表明細(xì)胞壁中葡聚糖含量減少。法尼醇可能通過降低細(xì)胞壁的厚度及細(xì)胞壁中葡聚糖的含量來增加抗真菌藥物的易感性。

本實(shí)驗(yàn)采用qPCR檢測葡聚糖相關(guān)基因PIR1、PHR2、BGL2和GSC1的表達(dá)。PIR1基因編碼的Pir1p是β-1,3葡聚糖連接的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白,當(dāng)念珠菌從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變時(shí),PIR1的表達(dá)下降[19]。單臂敲除PIR1基因后,缺陷菌株生長緩慢、形態(tài)異常,細(xì)胞之間抱團(tuán)成簇,并且表現(xiàn)出對(duì)剛果紅和卡爾科弗盧爾熒光染色劑的高度敏感性,表明PIR1基因在念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變和維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性上起重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)中,法尼醇處理后,PIR1表達(dá)上調(diào),推測原因可能是法尼醇處理后酵母相細(xì)胞增多所致。PHR2基因編碼β-1,6葡聚糖所需的糖苷酶,其主要作用在白念珠菌細(xì)胞壁上β-1,6-葡聚糖的連接處,可水解葡聚糖,同時(shí)也可直接作為pH感應(yīng)受體起作用。在酸性環(huán)境下,PHR2基因表達(dá),抑制白念珠菌由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中,PHR2在法尼醇處理組表達(dá)上調(diào),細(xì)胞中糖苷酶含量升高,進(jìn)而促進(jìn)葡聚糖分解。法尼醇作用后使原本在酸性環(huán)境中高表達(dá)的PHR2基因在堿性培養(yǎng)基中表達(dá)也出現(xiàn)了上調(diào),抑制了白念珠菌形態(tài)的轉(zhuǎn)換。相反,在耐藥株組中,PHR2基因表達(dá)下調(diào),細(xì)胞中糖苷酶含量下降,葡聚糖的降解減少,菌絲相白念珠菌增加,有利于生物膜的形成,葡聚糖含量增多增加了白念珠菌生物膜細(xì)胞的耐藥性。GSC1基因編碼β-1,3葡聚糖酶催化亞基[22],當(dāng)敲除該基因后,會(huì)造成葡聚糖合成酶活性減弱以及葡聚糖合成量降低,導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性的破壞。本實(shí)驗(yàn)中法尼醇組GSC1的表達(dá)降低,造成β-1,3葡聚糖含量減少,細(xì)胞壁的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變;而耐藥株高表達(dá)GSC1基因,通過促進(jìn)葡聚糖的合成,增加白念珠菌生物膜的耐藥性。BGL2基因表達(dá)的蛋白Bgl2p屬于白念珠菌細(xì)胞壁葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,其主要參與催化β-1,3-葡聚糖末端二糖的合成過程[4]。BGL2基因的表達(dá)在對(duì)照組、法尼醇處理組和耐藥組間沒有明顯差異,推測BGL2基因與白念珠菌的耐藥不相關(guān),也不是法尼醇作用的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果表明,法尼醇可以在一定程度上改變葡聚糖相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分,而細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化與白念珠菌耐藥性相關(guān)。