湯文魁,王國(guó)棟,魏夢(mèng)珍,張丹丹,呂丹薇,劉權(quán)輝,黃 奔,*

(1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,南寧 530004)

神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能被改變的疾病,例如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)[1-5]。目前,神經(jīng)退行性疾病的治療方法主要采用藥物治療,但這些治療方法效果并不理想。自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法建立以來(lái),干細(xì)胞重編程成為了治療神經(jīng)退行性疾病的一種有前途的方法,為再生醫(yī)學(xué)帶來(lái)了希望。因此,細(xì)胞替代療法成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

以往研究通過(guò)引入外源轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為各種類(lèi)型的細(xì)胞,這些研究結(jié)果表明細(xì)胞的命運(yùn)是可逆的[6-8]。研究人員將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞,諸如此類(lèi)的研究在治療神經(jīng)退行性疾病或損傷方面具有一定的前景。

外源性轉(zhuǎn)錄因子在成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá),并直接識(shí)別基因組中的特定位點(diǎn)、招募和協(xié)調(diào)其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來(lái)重塑宿主細(xì)胞的表觀基因組,最終成功誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞[9]。然而,異位基因的插入通常需要病毒載體,而將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到重編程的基因組中會(huì)帶來(lái)插入突變、殘余表達(dá)及轉(zhuǎn)基因活化的風(fēng)險(xiǎn),這可能會(huì)導(dǎo)致宿主癌變[10-11]。此外,其使用復(fù)雜、需要大量時(shí)間、誘導(dǎo)效率低等缺點(diǎn)也削弱了其應(yīng)用價(jià)值[12]。與遺傳學(xué)誘導(dǎo)方法相比,小分子化合物誘導(dǎo)具有多個(gè)重要優(yōu)勢(shì)[13],小分子化合物相對(duì)容易應(yīng)用、優(yōu)化和制造,更容易開(kāi)發(fā)成藥物,更安全[12,14]。這些優(yōu)勢(shì)使小分子化合物調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)在臨床應(yīng)用上更為可行[15-17]。成纖維細(xì)胞是最早成功重編程為多能干細(xì)胞(iPSCs)的一類(lèi)體細(xì)胞[18],iPSCs能在體內(nèi)分化為包括神經(jīng)元在內(nèi)的幾乎任何類(lèi)型的細(xì)胞。與成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs再分化為神經(jīng)元的方法相比,直接將體細(xì)胞重編程為神經(jīng)元可以使起始細(xì)胞不經(jīng)歷脫分化的步驟,避免起始沉默基因自發(fā)地重新激活并介導(dǎo)多能性的恢復(fù)[19-20],從而降低了細(xì)胞移植術(shù)后形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[21]。本試驗(yàn)利用含有單一小分子化合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin)處理小鼠成纖維細(xì)胞12 h后,更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,將其誘導(dǎo)為神經(jīng)元,此研究有望為治療神經(jīng)退行性疾病提供一種有前途的細(xì)胞替代方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠(KM小鼠),購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

DMEM、南美胎牛血清(FBS)、F12、N2添加劑、B27添加劑,購(gòu)自Gibco公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS),購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;Forsklin,購(gòu)自賽默飛公司。

DMEM/F12:神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal)(1∶1),0.5% N2添加劑,1% B27添加劑、100 μmol/L 環(huán)磷酸腺苷(cAMP),20 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGE),20 ng/mL 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF),20 ng/mL 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF), 20 ng/mL 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3) 、青鏈霉素溶液(penicillin/streptomycin)和小分子化合物[即1 mmol/L丙戊酸(VPA)]、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Forsklin、10 μmol/L Y-27632和1 μmol/L Repsox。TRIzol,購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;瓊脂糖,購(gòu)自BIOWEST公司;cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。超凈工作臺(tái),蘇州佳德凈化科技公司產(chǎn)品;離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;電泳儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;PCR儀,Analytikjena公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀,羅氏(Roche)公司產(chǎn)品;安捷倫2100 RNA Nano 6 000 Assay Kit,美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品;K5500分光光度計(jì),北京凱奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。以上儀器、設(shè)備均由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代分離

孕鼠麻醉斷頸處死后,用75%乙醇浸泡一下迅速拿出,取出帶有胚胎的子宮。用PBS緩沖液洗滌后,解剖完整的所有胚胎,用剪刀剪開(kāi)胚胎,剪掉頭部、四肢和內(nèi)臟,其他部分用剪刀剪碎,將細(xì)小組織碎片貼于100 mm的培養(yǎng)皿放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,等其貼壁后加入DMEM(含血清)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 神經(jīng)元的生成

在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞(MEFs),第3代后的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí),將MEFs接種到96孔板中,加入DMEM(含血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后,用PBS緩沖液清洗3遍,對(duì)照組加入N2B27培養(yǎng)液,試驗(yàn)組加入含有單一小分子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin),處理12 h后,兩組細(xì)胞均更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,拍照對(duì)比。

1.2.3 誘導(dǎo)神經(jīng)元的RT-qPCR驗(yàn)證

以N2B27培養(yǎng)液處理的小鼠成纖維細(xì)胞為對(duì)照組,誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin)處理的小鼠成纖維細(xì)胞為試驗(yàn)組。使用TRIzol法從樣品中提取總RNA,使用Vazyme HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(貨號(hào)R323-01)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選取神經(jīng)元相關(guān)基因以及成纖維相關(guān)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,以小鼠GAPDH為內(nèi)參,用 Vazyme Q711-02/03 試劑盒的方法對(duì)獲得的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR,引物序列見(jiàn)表1,反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃反應(yīng)15 s。繪制熔解曲線。每個(gè)樣本設(shè)計(jì)4個(gè)技術(shù)重復(fù)孔,在Roche定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算,用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系Tab.2 qRT-PCR reaction system

1.2.4 誘導(dǎo)神經(jīng)元的免疫熒光驗(yàn)證

將小鼠成纖維細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組換N2B27培養(yǎng)液,試驗(yàn)組換誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin),培養(yǎng)12 h更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。誘導(dǎo)后進(jìn)行熒光染色操作,棄去誘導(dǎo)液,用PBS洗3遍,孔板中加入4%的PFA中固定20～30 min;用阻斷液清洗3遍,每次3 min;孔板中加入1%的TritonX-100,室溫孵育15 min;用阻斷液清洗3遍,每次5 min;加入1%的BSA,封閉1.5～2.0 h;TBP清洗3遍,每次5 min;用1%的BSA按照說(shuō)明書(shū)稀釋TUJ1、MAP2然后加入孔板中,4 ℃孵育過(guò)夜;室溫復(fù)溫20 min后,用TBP清洗3遍,每次5 min;將二抗和Hoechst用1%BSA稀釋,常溫孵育二抗1.5 h;TBP清洗3遍,每次5 min;加入PBS后即可拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重編程過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化

為了記錄重編程前后細(xì)胞形態(tài)的變化,對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞進(jìn)行拍照觀察,對(duì)比發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞變圓,并且有突觸出現(xiàn),證實(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞在形態(tài)上與神經(jīng)元細(xì)胞相似(見(jiàn)圖1)。

圖1 小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)前后形態(tài)Fig.1 Morphology of mouse fibroblasts before and after induction

2.2 誘導(dǎo)神經(jīng)元定量PCR驗(yàn)證

收集誘導(dǎo)前后細(xì)胞樣品,對(duì)神經(jīng)元相關(guān)基因TUJ1、MAP2、NSE及成纖維相關(guān)基因Fn、CTGF進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01),成纖維相關(guān)基因極顯著下調(diào)(P<0.01),見(jiàn)圖2。

圖2 誘導(dǎo)神經(jīng)元定量PCR基因表達(dá)水平Fig.2 Quantitative PCR gene expression in induced neurons

2.3 誘導(dǎo)神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達(dá)驗(yàn)證

對(duì)誘導(dǎo)前后的小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元相關(guān)蛋白TUJ1、MAP2的表達(dá)呈陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)。

圖3 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物TUJ1、MAP2表達(dá)量Fig.3 The expression levels of TUJ1 and MAP2 detected by immunofluorescence staining

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)元是終末分化的細(xì)胞,由于轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)景觀的變化,它們?cè)诔墒爝^(guò)程中逐漸失去支持再生的能力[22]。為解決神經(jīng)元在受傷后無(wú)法再生這一問(wèn)題,以往的研究人員通過(guò)將成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs,iPSCs在體內(nèi)分化為神經(jīng)元[18]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞可以通過(guò)重新編程為胚胎外內(nèi)胚層樣狀態(tài),繞過(guò)iPSC階段,直接轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元[23]。這一方法減少了自發(fā)突變發(fā)生的機(jī)會(huì); 也避免了iPSC的生成, 減少了畸胎瘤出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)[24]。

研究人員將成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)元主要通過(guò)兩類(lèi)方法,分別是以外源性轉(zhuǎn)錄因子傳遞方法和非整合基因傳遞方法,細(xì)胞膜可滲透蛋白質(zhì)和小分子化合物。研究人員找出了一些與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)的基因,轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞,成功得到誘導(dǎo)性神經(jīng)元。但該試驗(yàn)得到的神經(jīng)元不具備特異性。而后研究人員聯(lián)合應(yīng)用11種因子并在此基礎(chǔ)上添加NEUROD1,就可將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)元[25]。在動(dòng)物方面,豬成纖維細(xì)胞能夠被microRNA(miR-9 / 9*和miR124)和Ascl1直接重編程為神經(jīng)元[26]。但是外源性轉(zhuǎn)錄因子、異位基因等方法效率較低并存在一些安全問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題,研究人員開(kāi)始選擇加入小分子的方法來(lái)提高誘導(dǎo)效率。研究人員篩選出與神經(jīng)元生物發(fā)生過(guò)程相關(guān)的小分子,并聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子NGN2將人胚肺成纖維細(xì)胞重編程成神經(jīng)元[27-28]。隨后該團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上將慢病毒載體感染皮膚成纖維細(xì)胞,并添加小分子誘導(dǎo)得到神經(jīng)元,但是該神經(jīng)元生物活性較差。在低氧條件下[29],通過(guò)小分子化合物組合誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞重編程神經(jīng)前體細(xì)胞,該細(xì)胞具有體內(nèi)與體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的潛能。在大鼠上,可以通過(guò)小分子化合物組合(SMs)將大鼠胚胎成纖維細(xì)胞在體內(nèi)和體外有效重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)元[30]。鄧宏魁團(tuán)隊(duì)利用小分子組合將小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程成為功能性神經(jīng)元[31]。

Forskolin具備影響神經(jīng)元產(chǎn)生和活動(dòng)等作用,據(jù)報(bào)道通過(guò)一種轉(zhuǎn)錄因子Ascl1和化合物Forsklin聯(lián)合作用將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)小白蛋白神經(jīng)元[32],同時(shí)Forskolin可以通過(guò)提高cAMP水平作用軸突CB1受體來(lái)影響神經(jīng)元的活動(dòng)[33]。本課題組的研究通過(guò)改變多種小分子組合的誘導(dǎo)方式,利用單一小分子化合物Forskolin誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元,并在基因和蛋白層面表達(dá)神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo)志物。

本研究無(wú)需低氧條件,利用單一小分子化合物組合將小鼠成纖維細(xì)胞重編程成神經(jīng)元,誘導(dǎo)條件十分簡(jiǎn)便。與成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs、iPSCs再分化為神經(jīng)元方法相比,不經(jīng)過(guò)iPSC階段直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元安全性更高,這主要由于iPSCs細(xì)胞除具有全能性之外,同時(shí)還擁有其起始細(xì)胞的分子痕跡[24]。在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域, 無(wú)法排除腫瘤或其他畸變細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn), 并最終無(wú)法安全應(yīng)用于細(xì)胞類(lèi)型的臨床醫(yī)療當(dāng)中。與小分子化合物介導(dǎo)重編程相比,傳統(tǒng)重編程方法主要是依賴(lài)于病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引入外源性遺傳物質(zhì),被用于促進(jìn)細(xì)胞命運(yùn)的變化,它們具有將外來(lái)DNA片段整合到基因組中的潛在風(fēng)險(xiǎn),這會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的副作用,例如腫瘤形成。此外將目的基因瞬時(shí)引入細(xì)胞這一傳統(tǒng)重編程方法相對(duì)更安全,也被用于誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的變化,但其具有效率低、試驗(yàn)設(shè)置復(fù)雜和成本高等缺點(diǎn)[34]。小分子化合物安全性和效率更高,成本更低,使用條件易于優(yōu)化,不需要改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì),使用小分子可以提供獨(dú)特的控制[35],因此小分子化合物對(duì)細(xì)胞重編程是安全的,對(duì)于后續(xù)臨床應(yīng)用是更為理想的選擇。

綜上所述,利用單一小分子化合物將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元這一方法為治療神經(jīng)退行性疾病或損傷提供了重要的理論基礎(chǔ),并為化學(xué)重編程和細(xì)胞治療提供了臨床應(yīng)用的可能性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)分離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代并傳代培養(yǎng),利用單一小分子化合物Forskolin處理該細(xì)胞直接重編程獲得神經(jīng)元。這將為神經(jīng)元無(wú)法再生造成的神經(jīng)退行性疾病提供更為簡(jiǎn)便、快捷、高效的治療方法,對(duì)將Forskolin等用于控制細(xì)胞命運(yùn)、狀態(tài)和功能的小分子推向再生醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用提供新的研究方向。