蔣淑娟 邢美艷

糖尿病 (diabetes mellitus,DM)作為常見的代謝性疾病會引發(fā)一系列并發(fā)癥,當(dāng)前全世界有3.66億人患有DM,已嚴(yán)重威脅人類健康[1]。DM亦可累及大腦,患者腦部出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、軸突變性、突觸形成受阻和突觸可塑性障礙等,表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能障礙,又稱為“糖尿病性認(rèn)知功能障礙(diabetes-associated cognitive dysfunction,DACD)”[2]。然而,當(dāng)前對于治療DACD尚無有效策略。因此,尋求開發(fā)有效的治療藥物對于臨床上防治DACD至關(guān)重要。亞精胺(spermidine,Spd)是一種廣泛分布在生物體內(nèi)的天然多胺,對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、組織再生等具有關(guān)鍵的支持作用,在人體多種組織中扮演抗衰老的角色[3]。已有研究表明Spd對認(rèn)知損傷具有一定改善作用[4],但Spd是否拮抗DACD尚未有人探索。在DM中,由高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞中晚期糖基化終產(chǎn)物 (advanced glycation end products,AGEs) 過度形成被認(rèn)為是大腦認(rèn)知能力下降的重要原因[5]。AGE通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體 (the receptor of advanced glycation end products,RAGE) 控制血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[6]。本研究以鏈脲佐菌素 (streptozocin,STZ) 誘導(dǎo)的DM大鼠為模型主要觀察Spd對DACD的改善作用以及對海馬AGE-RAGE信號通路的影響,旨在為Spd的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40只體重200～250 g的SPF級別的雄性SD大鼠(6～8周齡),購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號為SCXK(皖)2017-001。大鼠單籠飼養(yǎng),允許其自由進(jìn)食與進(jìn)水,室內(nèi)空氣、通風(fēng)良好,人工光/暗周期為12/12 h(光照時間7∶00～19∶00),溫度20～25℃,相對濕度50%左右,并每周更換墊料2～3次以保證大鼠舒適的環(huán)境。所有實驗均遵循國家承認(rèn)的《實驗動物管理條例》和《動物倫理委員會管理條例》。

1.2 實驗藥物與試劑 Spd(批號：S0381)及STZ(批號：S0130,純度>98%)粉末購自美國 Sigma 公司,血糖儀和血糖試紙購自德國羅氏 (ROCHE) 公司。AGE(批號：ab23722)Elisa試劑盒,RAGE(批號：ab37647) 和β-actin(批號：ab8226)蛋白特異性抗體,以及辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記二抗(批號：ab6721)均購于英國Abcam公司。BCA 蛋白檢測試劑盒(批號：P0012)和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：P0012A)均購于上海碧云天生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病模型：大鼠禁食過夜 (12 h) 后,DM模型組用55 mg/kg劑量的STZ腹腔注射,對照組給予相同劑量的檸檬酸鈉溶液。注射STZ后,禁食1 h后再喂食。STZ注射3 d后,用血糖儀檢測大鼠尾靜脈空腹血糖,血糖>16.7 mmol/L為DM大鼠,納入正式實驗。血糖不達(dá)標(biāo)者,等大鼠恢復(fù)到正常血糖狀態(tài)下重新造模。

1.3.2 動物分組及處理：大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：對照組、DM模型組、DM+低劑量Spd (5 mg/kg,腹腔注射)組、DM+高劑量Spd (10 mg/kg,腹腔注射) 組。在STZ處理的大鼠確認(rèn)DM大鼠后,給予不同的藥物處理：Spd組予以不同濃度的Spd,其余組予以等量的蒸餾水。所有大鼠連續(xù)處理4周后進(jìn)行認(rèn)知行為學(xué)試驗,隨后取海馬組織檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖與體重測定：STZ注射前當(dāng)天,注射后第3天及第28天早晨進(jìn)食前采集大鼠尾靜脈血, 用血糖儀檢測4組大鼠空腹血糖。在STZ注射當(dāng)天及注射后第1～4周記錄4組大鼠體重。

1.4.2 認(rèn)知功能：藥物干預(yù)結(jié)束后,所有大鼠經(jīng)Morris水迷宮試驗評估空間學(xué)習(xí)和記憶能力。實驗分2個階段：①定位航行 (place navigation)：水池分為4個象限,將直徑20 cm的平臺放置于其中一個象限中央,水面下5 cm處。大鼠隨機(jī)位置放入水中,每次記錄找到平臺的時間(逃避潛伏期)。每次試驗最長120 s;若超過120 s未找到平臺(逃避潛伏期記為120 s),則引導(dǎo)動物到平臺,讓動物在平臺上停留20 s。每只動物每天訓(xùn)練4次(每次從不同的象限開始,每天的順序不同),2次訓(xùn)練間隔15～20 min,連續(xù)訓(xùn)練5 d;每天取4次平均值為最終結(jié)果。②空間探索 (spatial probe)：第6天去掉平臺,將大鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中,記錄其在120 s內(nèi)在目標(biāo)象限(原放置平臺的象限)所花的時間和跨越原平臺次數(shù)。

1.4.3 Western blot檢測大鼠海馬RAGE蛋白表達(dá)：大鼠斷頭處死后取海馬組織勻漿,4℃,12 000×g條件下離心,10 min,后取上清液,使用BCA蛋白定量試劑盒確定樣本蛋白濃度。將海馬蛋白樣品加入制備好的SDS-page膠中,電泳分離蛋白質(zhì),用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚二氟乙烯 (PDVF)膜上。轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF膜放于5%脫脂牛奶內(nèi),常溫下?lián)u床封閉孵育2～3 h,加入一抗 (1∶1 000) 于4℃冰箱孵育過夜。第2天將膜取出用T-BST清洗 (5 min ×5),加入相對應(yīng)的二抗 (1∶5 000) 孵育2 h。最后將膜用T-BST漂洗干凈后,加入化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像儀 (tanon-5600 imaging system) 中顯影。蛋白條帶用AlphaImager 2200進(jìn)行條帶灰度值掃描,以β-actin蛋白為內(nèi)在參照,分析各組蛋白的表達(dá)水平。

1.4.4 Elisa檢測大鼠海馬AGEs含量：大鼠斷頭處死后取海馬組織勻漿,離心后收集上清液,使用BCA蛋白定量試劑盒確定樣本蛋白濃度。隨后遵照試劑盒說明書要求在96孔板上加入相同量的4組組織上清液及相應(yīng)的試劑,在搖床上避光孵育30 min。最后用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測每孔的吸光度,計算出海馬中AGEs含量。

2 結(jié)果

2.1 亞精胺不影響STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖和體重水平 注射STZ (55 mg/kg) 后3 d,DM模型組、DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠血糖水平均顯著高于對照組。第28天,3組大鼠血糖水平仍顯著升高(P<0.05),同時DM模型組、DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠血糖水平無顯著差異(P>0.05)。注射STZ后每周測量1次體重：與對照組比較,DM模型組、DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠體重明顯降低(P<0.05),同時DM模型組、DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠體重?zé)o差異(P>0.05)。表明注射STZ導(dǎo)致大鼠DM狀態(tài),但Spd不影響DM大鼠血糖水平和體重。見表1、2。

表1 4組大鼠空腹血糖水平比較 n=10,mmol/L,

表2 4組大鼠體重水平比較 n=10,

2.2 亞精胺改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)記憶 Morris水迷宮測試結(jié)果顯示：在定位導(dǎo)航期間,與對照組比較,DM模型組大鼠在試驗第2～5天的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05),而DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠逃避潛伏期較DM模型組明顯縮短 (P<0.05),表明Spd給藥能明顯縮短DM大鼠的逃避潛伏期,改善DM大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。在空間探索期：DM模型組大鼠在目標(biāo)象限停留時間百分比和跨越平臺的次數(shù)明顯少于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而DM模型組、DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組的目標(biāo)象限停留時間百分比和跨越平臺的次數(shù)較DM模型組明顯增加(P<0.05),表明Spd明顯提高DM大鼠的空間記憶能力。見表3、4。

表3 水迷宮試驗中4組大鼠空間學(xué)習(xí)能力比較 s,

表4 水迷宮試驗中4組大鼠空間記憶能力比較

2.3 亞精胺下調(diào)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬AGE/RAGE信號水平 Western blotting 和Elisa結(jié)果顯示：與對照組比較,DM模型組大鼠海馬組織中AGEs含量明顯增加,RAGE蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05);但DM+低劑量Spd組和DM+高劑量Spd組大鼠海馬組織中AGEs含量顯著減少,RAGE蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),表明Spd明顯抑制DM大鼠海馬AGE/RAGE信號水平。見表5。

表5 4組大鼠海馬組織中AGEs含量和RAGE蛋白表達(dá)比較

3 討論

DM及其并發(fā)癥和治療可導(dǎo)致一過性或永久性的認(rèn)知異常,這些異常是由急性和慢性血糖穩(wěn)態(tài)紊亂引起的[2]。DM的患病率在全球范圍內(nèi)急劇增加,2030預(yù)計將有5.52億患者[1]。隨著糖尿病的日益流行和人口老齡化,DACD預(yù)計將上升,并成為未來健康影響的一個挑戰(zhàn)。最近的研究表明,作為一種天然的促進(jìn)自噬的多胺,飲食中的Spd具有保護(hù)健康和延長壽命的作用。Gupta等[7,8]發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充Spd可在果蠅中抑制年齡誘發(fā)的記憶損傷和保持突觸靈活性;后續(xù)研究中Spd也被證明可逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠記憶缺陷[9]。此外,腹腔或腦內(nèi)注射Spd可顯著增強(qiáng)嚙齒動物在不同任務(wù)中的認(rèn)知能力[10]。近期研究發(fā)現(xiàn)Spd影響老年小鼠在家庭環(huán)境任務(wù)中的行為,改善空間學(xué)習(xí)[11];并且在臨床試驗中Spd顯著提升老年人群及阿爾茲海默癥患者的認(rèn)知表現(xiàn)[12,13]。

Morris水迷宮是主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位) 的學(xué)習(xí)記憶能力,被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、海馬/外海馬研究等領(lǐng)域[14]。本研究中,我們通過一次性STZ腹腔注射構(gòu)建DM認(rèn)知障礙模型。水迷宮結(jié)果顯示：與正常對照組比較,大鼠DM制模成功4周后出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙,表現(xiàn)為逃避潛伏期明顯延長,在目標(biāo)象限停留時間和跨越平臺的次數(shù)明顯降低;Spd干預(yù)后DM大鼠的逃避潛伏期明顯縮短,目標(biāo)象限停留時間和跨越平臺的次數(shù)顯著增加。這些結(jié)果表明Spd改善DM大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙,驗證了Spd在預(yù)防DM模型記憶障礙方面的藥理活性。同時,我們結(jié)論與上述前人研究基本一致,進(jìn)一步拓展了Spd在不同疾病模型中的學(xué)習(xí)記憶改善作用。

已有研究發(fā)現(xiàn),Aβ-AGE通過RAGE通路加重了大鼠的認(rèn)知障礙[15]。同時,DM與幾種腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙高度相關(guān),如腦血管中脂質(zhì)[16]和AGEs[17,18]過度積聚。隨后,這些變化導(dǎo)致血流減少,神經(jīng)血管解偶聯(lián),以及低氧應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷[19],最終導(dǎo)致腦梗塞和血管性癡呆的發(fā)病[20]。大量研究表明,AGE-RAGE通路的激活與DM患者的微血管和大血管功能以及認(rèn)知功能障礙有關(guān)[21]。因此,我們推測Spd對DACD的拮抗作用可能涉及對AGE-RAGE通路的調(diào)控。結(jié)果顯示：與正常對照組比較,DM大鼠海馬組織中AGEs含量增加,RAGE蛋白表達(dá)上調(diào);Spd干預(yù)后,DM大鼠海馬組織AGEs含量明顯減少,RAGE蛋白表達(dá)顯著下調(diào),表明Spd抑制DM大鼠海馬AGE-RAGE信號通路。因此我們認(rèn)為下調(diào)海馬AGE-RAGE信號通路參與了Spd對DACD的改善作用,這也提示海馬AGE-RAGE信號可能作為防治DACD的有效靶點。當(dāng)前,炎性和氧化還原敏感的AGE-RAGE通路可作為阿爾茨海默病的治療靶點[22],這也佐證了我們的觀點。

綜上所述,Spd對STZ 誘導(dǎo)的DM大鼠認(rèn)知功能障礙具有改善作用,其機(jī)制與抑制海馬AGE-RAGE信號通路有關(guān)。