丁彥敏,袁顥宸,王寧

山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355

中藥梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實,其主要功效為瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒,外用涼血消腫,臨床用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍等,也可外用以治療扭挫傷痛[1]。梔子入選第一批藥食兩用中藥材目錄,逐漸被人們了解,并在日常生活中得到廣泛應(yīng)用[2]。近年來,梔子導(dǎo)致腎損傷的報道逐漸增多[3-5],但是相關(guān)作用機(jī)制的報道比較少。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,系統(tǒng)分析藥物與疾病和靶點之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),探討梔子導(dǎo)致腎損傷的作用機(jī)制,為藥食兩用中藥梔子的應(yīng)用提供思路和借鑒。

1 資料與方法

1.1 梔子活性成分與靶點的篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選梔子活性成分和潛在靶點,設(shè)定篩選活性成分的條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18;在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將梔子活性成分相關(guān)靶點信息校準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)基因名。另外在中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database,TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)檢索梔子化學(xué)成分,并在Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測基因靶點。把兩次所得靶點合并取交集作為梔子活性成分的靶點。

1.2 腎損傷靶點的篩選以“kidney injury”為關(guān)鍵詞,在NCBI臨床突變數(shù)據(jù)庫(ClinVar,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、人類基因注釋數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)和治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)檢索腎損傷的相關(guān)靶點。若GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得靶點過多,則設(shè)置score≥中位數(shù)進(jìn)行篩選。將得到的疾病靶點匯總并去除重復(fù)值,獲得腎損傷疾病靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過Venny軟件對藥物相關(guān)靶點與疾病靶點取交集,獲得梔子導(dǎo)致腎損傷的潛在靶點。在Cytoscape 3.8.0中構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。以“節(jié)點”(node)代表屬性類型,即藥物、活性成分、靶點和疾病,“邊”(edge)代表交互關(guān)系。采用 Cytoscape的Network Analyzer工具分析所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò),結(jié)果中連接度(degree)越大,涉及的生物功能越多,重要性越高。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)構(gòu)建將梔子導(dǎo)致腎損傷的靶點提交至STRING 11.0平臺,物種選擇“Homo sapiens”,設(shè)定“highest confidence>0.9”并隱藏游離節(jié)點,獲取蛋白質(zhì)互相作用圖,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),根據(jù)結(jié)果對靶點蛋白進(jìn)行分析。

1.5 富集分析通過Metascape平臺(http://metascape.org)對靶點進(jìn)行富集分析,將藥物與疾病交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。GO分析解釋關(guān)鍵靶點導(dǎo)致腎損傷的生物過程,KEGG富集分析研究其相關(guān)信號通路?；贙EGG結(jié)果,選取前10條通路,運用Cytoscape3.8.0構(gòu)建“關(guān)鍵通路-潛在靶點-化學(xué)成分”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步篩選梔子導(dǎo)致腎損傷的關(guān)鍵靶基因及有效活性成分。

1.6 分子對接檢索ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)下載梔子活性成分的PDB格式文件,并選為配體。檢索RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)并下載靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu),選為受體。利用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子處理和對接,用PyMOL軟件進(jìn)行圖像的可視化分析。一般認(rèn)為,結(jié)合能≤-5.5 kcal·mol-1為結(jié)合活性好,結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 梔子靶點基因的獲取從TCMSP獲取梔子活性成分靶點基因,在Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化后獲得靶點基因176個;從TCMID數(shù)據(jù)庫獲取梔子化學(xué)成分,并在Swiss Target Prediction預(yù)測后獲得靶點基因871個。匯總?cè)ブ睾蠊搏@得化學(xué)成分119個,靶點基因920個。

2.2 疾病靶點及潛在靶點的獲取在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得腎損傷潛在靶點為8 233個,根據(jù)經(jīng)驗以score≥中位數(shù)為篩選條件,第1次篩選設(shè)置score≥3.39,獲得4 120個靶點;第2次篩選設(shè)置score≥6.955,獲得2 060個靶點;第3次篩選設(shè)置score≥11.555,獲得1 030個靶點作為腎損傷的潛在靶點。在ClinVar、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索“kidney injury”,分別得到168個、3個、74個靶點,匯總并去重后,共獲得 1 234 個疾病靶點。通過Venny將藥物與疾病靶點取交集,共得到244個梔子導(dǎo)致腎損傷的潛在靶點,見圖1。

2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建運用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò),見圖2。綠色圓形表示梔子活性成分,藍(lán)色菱形表示靶點基因,黃色六邊形表示疾病,紫色三角形表示藥物。該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點大小代表相應(yīng)的Degree值,Degree值越大則節(jié)點面積越大。化合物Degree值前四位是槲皮素(quercetin)、urushio iii、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和綠原素(chlorogenin),這可能是梔子導(dǎo)致腎損傷的主要活性成分。靶點基因Degree值排名前5位是PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、KDR。

圖2 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含244個節(jié)點和1 240條邊,并將出現(xiàn)頻率前10位的靶點繪制條形圖,見圖4。蛋白互作頻次較高的有AKT1、APP、HRAS、EGFR、CTNNB1等,說明梔子活性成分與腎損傷有較高結(jié)合活性,可以認(rèn)為是梔子導(dǎo)致腎損傷的關(guān)鍵靶點。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點蛋白互作頻次圖

2.5 富集分析在Metascape平臺上對244個交集靶點進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析共得到3 607個條目,其中分子功能(molecular function,MF)285個,細(xì)胞組分(cellular component,CC)185個,生物學(xué)過程(biological process,BP)3 137個,以P<0.01為篩選條件,共得到497個條目,分別從MF、CC、BP中選擇排名前10位的條目做GO富集分析三合一柱狀圖,見圖5。涉及的主要GO進(jìn)程有對有毒物質(zhì)的反應(yīng)(response to toxic substance)、積極調(diào)控細(xì)胞遷移(positive regulation of cell migration)、細(xì)胞對有機(jī)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to organonitrogen compound)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)(response to extracellular stimulus)、對無機(jī)物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、膜筏(membrane raft)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)和磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)等。

圖5 GO富集分析圖

KEGG分析得到379條信號通路,以P<0.01為篩選條件,則得到276條信號通路。取排名前20位的信號通路繪制KEGG氣泡圖,見圖6。每張圖左側(cè)為排名靠前的通路名稱,橫軸代表該通路基因所占總體輸入基因的比率,氣泡大小表示富集到靶標(biāo)的數(shù)量,氣泡顏色由紅到綠表明P值由大到小,紅色氣泡越大說明該條信號通路的重要性越高。KEGG結(jié)果包括癌癥通路(pathways in cancer)、癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)等。

注:Ratio為某通路基因所占總體輸入基因的比率。圖6 KEGG氣泡圖

運用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“關(guān)鍵通路-潛在靶點-化學(xué)成分”網(wǎng)絡(luò)以進(jìn)一步揭示信號通路與候選靶標(biāo)及活性成分之間的關(guān)系,見圖7。從網(wǎng)絡(luò)中可知,活性成分Degree值前3位為槲皮素(quercetin)、urushio iii和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone),可能是梔子導(dǎo)致腎損傷的主要活性物質(zhì),與“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)中一致。根據(jù)Degree值篩選得到的關(guān)鍵靶基因為PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、EGFR、KDR等。

圖7 “關(guān)鍵通路-潛在靶點-化學(xué)成分”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接分析檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),槲皮素(quercetin)與5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮沒有導(dǎo)致腎損傷的直接證據(jù),urushio iii則暫未有臨床或?qū)嶒炑芯孔C明其有導(dǎo)致腎損傷的作用。而梔子苷是梔子的主要成分,《中華人民共和國藥典》將其作為梔子質(zhì)量評價的目標(biāo)成分[1],且有文獻(xiàn)報道梔子苷具有腎毒性[6-8],故本研究將梔子苷(geniposide)選擇為配體,根據(jù)Degree值選擇“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)排名前5位、PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10位以及“關(guān)鍵通路-潛在靶點-化學(xué)成分”網(wǎng)絡(luò)排名前6位的靶點作為受體進(jìn)行分子對接,結(jié)果見表1,選取對接結(jié)合能較小的4個結(jié)果展示,見圖8。梔子苷與靶點蛋白APP在DG9、DG10、DG15氨基酸位點結(jié)合生成氫鍵;梔子苷與MMP2在ASP622氨基酸位點結(jié)合生成氫鍵;梔子苷與AKR1B1在ARG3、LYS11氨基酸位點結(jié)合生成氫鍵;梔子苷與AKT1在ARG215、ARG320氨基酸位點結(jié)合生成氫鍵。結(jié)果表明,梔子苷與靶點蛋白APP、MMP2、AKR1B1、AKT1之間有良好的結(jié)合活性。

表1 梔子活性成分與靶點蛋白對接結(jié)果

3 討論

梔子作為藥食兩用中藥材,具有保肝利膽、抗炎、降血脂、促進(jìn)胰腺分泌、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化、抗血栓等作用[9],但是目前有研究報道,梔子有腎毒性,明確其毒理機(jī)制具有重要意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以作為橋梁來聯(lián)系中藥與現(xiàn)代藥理學(xué),從系統(tǒng)上揭示中藥對機(jī)體網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用,更加全面地認(rèn)識中藥的作用機(jī)制。因此,本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討梔子導(dǎo)致腎損傷的毒理機(jī)制,以期為梔子的臨床和食品應(yīng)用安全提供參考。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及既往研究發(fā)現(xiàn),梔子苷(geniposide)、槲皮素(quercetin)、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和urushio iii可能是梔子導(dǎo)致腎損傷的主要活性成分。馮筱懿等[6-7]研究發(fā)現(xiàn),在梔子苷相同劑量(100 mg·kg-1)的條件下,短期(3 d)給藥對大鼠腎功能影響較小,長期(90 d)給藥則會對部分大鼠腎臟造成損傷,但是短期(3 d)給予大鼠大劑量(300 mg·kg-1)的梔子苷則會明顯導(dǎo)致大鼠腎臟損傷,這說明梔子苷小劑量長期應(yīng)用或者短期內(nèi)大劑量應(yīng)用均會導(dǎo)致腎損傷。程生輝等[8]經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn),用不同劑量的梔子苷喂養(yǎng)大鼠后,大鼠出現(xiàn)了不同程度的腎損傷,并且梔子苷應(yīng)用的劑量越大,大鼠腎損傷越嚴(yán)重,說明梔子苷具有腎毒性。槲皮素具有抗氧化和清除氧自由基、抗炎等作用[10],但能否導(dǎo)致腎損傷尚需要進(jìn)一步的研究。而對5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的已有研究中也尚未發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致腎損傷的直接證據(jù)[11]。對于urushio iii,目前暫無關(guān)于其毒理作用的臨床或?qū)嶒炑芯?可能是梔子導(dǎo)致腎損傷的又一發(fā)現(xiàn),值得進(jìn)一步探索。

在基因?qū)用?PTGS2、AKR1B1、MMP2、EGFR、KDR等被認(rèn)為是梔子導(dǎo)致腎損傷的關(guān)鍵靶點。PTGS2基因表達(dá)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),COX-2是在炎癥細(xì)胞因子和應(yīng)激條件下誘導(dǎo)表達(dá)的一種酶,在腎缺血再灌注損傷發(fā)生后表達(dá)先增加到最大再減少,在其表達(dá)數(shù)小時后可以使腎損傷最嚴(yán)重,這說明COX-2對腎損傷的發(fā)展起到了促進(jìn)作用[12]。譚峰[13]研究發(fā)現(xiàn),通過藥物抑制COX-2可以起到緩解腎損傷的作用,這說明COX-2可能有促進(jìn)腎損傷進(jìn)一步發(fā)展的作用。對AKR1B1的研究發(fā)現(xiàn),AKR1B1在腎臟中高表達(dá),將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨糖醇,但這個過程不活躍,只有在血糖水平相對較高的情況下才被激活,進(jìn)而導(dǎo)致山梨糖醇的水平升高,因為山梨糖醇很難擴(kuò)散到細(xì)胞外,導(dǎo)致高滲透壓,雖然AKR1B1可以提供對高滲環(huán)境的保護(hù),但高滲透不斷地累積會破壞腎細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié),最終導(dǎo)致腎臟損傷[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),血清MMP2可能是導(dǎo)致糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者腎損害的原因之一[16]。研究發(fā)現(xiàn),MMP2在腎組織中有表達(dá),并且在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)相對較高,說明MMP2參與了腎損傷的發(fā)展[17]。此外MMP2有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用,杜文孝等[18]認(rèn)為MMP2通過降解細(xì)胞外基質(zhì)來參與腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)展;而鄭學(xué)雙等[19]研究發(fā)現(xiàn)腎臟缺血再灌注可通過激活p38MAPK誘導(dǎo)MMP2蛋白表達(dá)來降解細(xì)胞外基質(zhì),進(jìn)而促進(jìn)腎缺血再灌注的發(fā)展。MMP2降解細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)制也可以加快腎癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[17]。慢性腎病期間脂質(zhì)運載蛋白2(lipocalin 2,Lcn2)的表達(dá)可誘導(dǎo)EGFR定位到腎小管細(xì)胞表面,從而使受體持續(xù)激活,導(dǎo)致腎損傷[20]。阻斷EGFR與TGF-α結(jié)合來阻止足細(xì)胞的損傷可能會延緩DN發(fā)展,這表明EGFR也有促進(jìn)DN發(fā)展的作用[21]。EGFR可以作為治療腎臟疾病的潛在靶點,EGFR配體EGF主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖參與急性腎損傷[22]。KDR即為血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2),廣泛存在于人的主要內(nèi)臟系統(tǒng)中,是III型受體酪氨酸激酶基因。周琪等[23]研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素可能通過抑制KDR分泌來改善腎損傷大鼠的情況,說明KDR會使腎損傷進(jìn)一步加重。

GO結(jié)果表明梔子是通過調(diào)控蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合和對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)來導(dǎo)致腎損傷的。蛋白酶中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)對腎有損傷作用,MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)各種成分、促炎效應(yīng)、破壞腎小管周圍毛細(xì)血管等機(jī)制影響腎臟缺血再灌注的進(jìn)一步發(fā)展。磷酸酶中血清堿性磷酸酶可造成腎損傷,顏春魯?shù)萚24]認(rèn)為在鎘導(dǎo)致的腎損傷中,鎘能和血清堿性磷酸酶緊密結(jié)合,從而使血清堿性磷酸酶含量增加,進(jìn)而對腎臟造成不同程度的損傷。在對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)研究中,黃小抗等[25]研究發(fā)現(xiàn),通過高糖環(huán)境的刺激,小鼠的腎組織會發(fā)生炎癥,并且系膜細(xì)胞和基質(zhì)也會有所增加。

通路富集分析結(jié)果顯示,梔子導(dǎo)致腎損傷可能主要通過AGEs-RAGE信號通路、cAMP信號通路、NF-κB信號通路等實現(xiàn)。AGEs-RAGE信號通路對DN發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用[26]。汪容等[27]研究發(fā)現(xiàn),DN的發(fā)生是通過AGEs-RAGE介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路活化實現(xiàn)的。黃倩等[28]在實驗中發(fā)現(xiàn),DN小鼠腎皮質(zhì)中cAMP含量升高,表明cAMP信號通路參與了DN狀態(tài)下腎纖維化。連曉英等[29]研究發(fā)現(xiàn),cAMP可以刺激多囊腎病細(xì)胞的增殖以及生長,進(jìn)一步加重腎損傷。在沒有受到刺激時,NF-κB和IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中,在受到刺激后 NF-κB 與IκB結(jié)合物被降解,NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)。萬笑笑[30]在研究中發(fā)現(xiàn),NF-κB 引起的炎癥反應(yīng)可以加重腎損傷。NF-κB被激活后誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥因子也可以促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展[31-32]。朱曉婷等[33]研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展。

本研究表明,梔子導(dǎo)致腎損傷的主要成分可能是梔子苷,與調(diào)控蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合以及對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)密切相關(guān),涉及AGEs-RAGE信號通路、cAMP信號通路、NF-κB信號通路。為進(jìn)一步開發(fā)利用藥食兩用中藥材梔子,尚需相應(yīng)的體內(nèi)外實驗來驗證本研究的結(jié)果。