張帆 黃瑤 凌明慧 蘇佳駿 勞日毫 閉金棟

摘要：以番木瓜汁為原料制備番木瓜汁發(fā)酵飲料，研究無酒精發(fā)酵飲料的工藝條件。制備方法：先添加酵母菌，發(fā)酵2d，滅活酵母菌后，再添加醋酸菌和乳酸菌，繼續(xù)發(fā)酵，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌接種體積比為1：1：1。菌種生長曲線測定結(jié)果顯示各菌株的最佳接種菌齡分別為：酵母菌為20 h（2.Oxl07 CFU／mL），醋酸菌為20 h（4.OxlOa CFU/mL），乳酸菌為12 h（I.OX108 CFU/mL）。正交實驗結(jié)果表明：番木瓜汁發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝為：初始SSC（可溶性固形物含量）為30%，接種量為g%，發(fā)酵周期為4d。發(fā)酵液經(jīng)殺菌，置于4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，棄沉淀物，取上清液，所得產(chǎn)品不含酒精，pH值為3.53，SSC為14%，維生素C質(zhì)量濃度為31.98 mg/（100 9），羥基自由基清除率為90.1%；色澤呈橙紅色，具有番木瓜濃郁香氣，口感酸甜協(xié)調(diào)。關(guān)鍵詞：番木瓜；發(fā)酵飲料；接種菌齡；發(fā)酵工藝；感官評價中圖分類號：TS275.4; Q939.99

DOI：10. 1637 5/j .cnki.cn4 5-139 5/t.2023.02.017

0引言

番木瓜（Carica papaya Linn．）又名木瓜，屬番木瓜科、番木瓜屬，多年生肉質(zhì)草本植物，主產(chǎn)地在熱帶和亞熱帶地區(qū)，廣泛栽培于中國福建、臺灣、廣東、廣西、云南等省、自治區(qū)。番木瓜不僅可以作為水果鮮食，還可以用來加工果干、果汁、果醬和酶制劑等產(chǎn)品。番木瓜富含木瓜酵素（木瓜蛋白酶），具有良好的助消化作用，且含有豐富的糖類、多酚、番木瓜堿、有機酸等物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖及抑菌等多種功效[1-3]。

近年來，在實驗室研究階段，利用益生菌發(fā)酵生產(chǎn)果蔬酵素或發(fā)酵飲料的研究成果較多，但市場轉(zhuǎn)化較少，還沒有實現(xiàn)市場大量推廣銷售[4-5]。酵素生產(chǎn)一般周期較長，需要幾個月時間，而發(fā)酵飲料生產(chǎn)周期較短，僅需數(shù)日。此外，發(fā)酵飲料營養(yǎng)豐富、口味獨特、助消化，符合人體對健康、美味的需求，利于市場推廣。在利用果蔬生產(chǎn)發(fā)酵飲料的研究中，絕大多數(shù)利用乳酸菌進行發(fā)酵[4-7]，少數(shù)利用酵母菌混合乳酸菌或醋酸菌進行發(fā)酵[8-10]。在木瓜品種方面，有研究利用光皮木瓜、野木瓜、番木瓜發(fā)酵生產(chǎn)酵素或乳酸菌飲料[11-13]，但利用酵母菌、醋酸菌、乳酸菌混合發(fā)酵生產(chǎn)番木瓜汁發(fā)酵飲料的研究尚未見報道。研究表明，使用多菌種混合發(fā)酵可以增加產(chǎn)品的風(fēng)味和功能【5】，多菌種復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物可能比單菌種發(fā)酵產(chǎn)物能更好地促進健康[10】，但在利用酵母菌發(fā)酵果蔬飲料時，常常因為有酒味而受眾不多。為解決以上問題，本研究以番木瓜汁為原料，用酵母菌、醋酸菌、乳酸菌進行發(fā)酵，采用先加入酵母菌發(fā)酵后滅活，再添加醋酸菌、乳酸菌的接種方法，以感官評分為指標進行最佳發(fā)酵條件的篩選，并進行感官評分和相關(guān)指標檢測，得到的飲品香氣濃郁，酸甜可口，營養(yǎng)豐富，為番木瓜的深加工和果蔬發(fā)酵飲料產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

番木瓜：市售；菌種：果酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；醋酸菌（中科1.41號滬釀醋酸菌），購于滬釀曲種淘寶店；乳酸菌（植物乳桿菌），廣西某大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供。

1.2培養(yǎng)基

醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖10/-，酵母提取物1%，檸檬酸0. 1%，Na：HPO。-12H：0 0.5%，瓊脂2%，pH 5.8[14]。

酵母菌PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20%，葡萄糖10/-，瓊脂1 .8%（配制液體培養(yǎng)基時則不加瓊脂），121 0C滅菌20 min。

乳酸菌MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸氫二胺0.2%，吐溫-80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸鎂0.02%，七水硫酸錳0.005%，瓊脂2%（配制液體培養(yǎng)基時則不加瓊脂），pH值為6.2-6.4，121 0C滅菌20 min。

脫脂牛奶培養(yǎng)基‘”1：12g脫脂奶粉溶于100 mL蒸餾水中，115 0C滅菌20 min。

1.3方法

1.3.1 測定菌種生長曲線，確定接種菌齡

培養(yǎng)步驟：利用斜面培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)（溫度為30 0C，乳酸菌培養(yǎng)ld，醋酸菌和酵母菌培養(yǎng)2 d），用1 mL生理鹽水洗脫1支菌種斜面，然后接種至100 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（乳酸菌和酵母菌靜置培養(yǎng)；醋酸菌以240 r/min的轉(zhuǎn)速進行搖床培養(yǎng)）；酵母菌、醋酸菌培養(yǎng)44 h，每隔4h取樣測定吸光度，乳酸菌培養(yǎng)30 h，每隔2h取樣測定吸光度；制作菌種生長曲線，通過傾注培養(yǎng)法測菌數(shù)，確定接種菌齡。

測定方法：1）取1 mL菌液至離心管中，8 000r/min離心2 min。同時取樣進行平板稀釋傾注法測定菌數(shù)；2）棄去上清液，將沉淀在比色管中稀釋至5 mL，以生理鹽水為空白對照，測定OD，。。；3）根據(jù)吸光度制作酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的生長曲線圖，并對照菌數(shù)確定接種菌齡。

1.3.2發(fā)酵工藝流程

木瓜經(jīng)清洗、去皮、去籽、切塊、榨汁、過濾、調(diào)糖、煮沸殺菌、冷卻、接種、發(fā)酵、巴氏消毒、冷藏、澄清、去沉淀后獲得產(chǎn)品。

工藝要點：

1）木瓜汁的制備：稱取定量的成熟、無發(fā)霉、無變質(zhì)的番木瓜，去皮、去籽后榨汁，用專用過濾紗網(wǎng)進行過濾后備用。

2）調(diào)糖：將木瓜汁按照體積比I：I加水，分裝于無菌瓶內(nèi)，再將白砂糖加入木瓜汁中，混勻后通過手持糖度儀對其SSC（可溶性固形物含量）進行測定，將其初始SSC調(diào)整至設(shè)定值。

3）殺菌：隔水煮沸5 min后冷卻。

4）接種發(fā)酵：將酵母菌、醋酸菌、乳酸菌菌種分別轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至相應(yīng)接種菌齡。先接種酵母菌，2d后隔水煮沸5 min來滅活酵母菌，冷卻后再接入醋酸菌和乳酸菌。發(fā)酵溫度為30 0C，3種菌按體積比l：I：I接種。

5）巴氏消毒：將發(fā)酵瓶裝產(chǎn)品放入85。C熱水中保溫10 min。

6）冷藏、澄清去沉淀：將消毒冷卻后的發(fā)酵瓶裝產(chǎn)品放入4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，棄沉淀物，取上清液，即得產(chǎn)品。1.3.3單因素試驗

初始SSC梯度分別設(shè)定為18%、22%、26%、30%、34%；發(fā)酵時間梯度分別設(shè)定為3d、4d、Sd、6d、7 d；接種量（3種菌總的接入量）梯度分別設(shè)定為2%、4%、6%、g%、12%。發(fā)酵結(jié)束測定pH值和SSC值，進行感官評分。1.3.4正交試驗

根據(jù)單因素結(jié)果，以發(fā)酵時間（A）、初始SSC（B）、接種量（C）為考察因素，以感官評分為評價指標，設(shè)計L。（33）正交試驗，確定最佳發(fā)酵工藝條件。因素水平表見表1。1.3.5驗證試驗

根據(jù)正交試驗所得的最佳發(fā)酵條件結(jié)果進行驗證試驗。進行感官評分，測定產(chǎn)品的SSC、pH、維生素C含量、抗氧化活性，驗證最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)的可靠性。1.3.6檢測方法

維生素C含量的測定采用二氯靛酚法‘“1。pH值的測定采用酸度計法。酒精度參照國標測定，SSC的測定采用手持糖度儀法?？寡趸钚缘臏y定采用鄰二氮菲_Fe2+氧化法，測定羥基自由基清除率。

1.3.7感官評定

評分方法如表2所示。感官評定標準如表3所示。

2結(jié)果和討論

2.1 生長曲線的測定及確定接種菌齡

從圖1可見，酵母菌生長曲線的延滯期不明顯，6-24 h是指數(shù)期，生長速度較快，繁殖速率增加，酶系活躍，代謝旺盛，適合用來接種，培養(yǎng)到20 h對應(yīng)的吸光度值為0.907，菌數(shù)達到2.Ox107 CFU/mL，符合接種所需菌數(shù)要求，因此選擇20h作為接種菌齡。培養(yǎng)24 h后進入穩(wěn)定期。

乳酸菌在2-4 h為延滯期，時間較短，4-16 h則為指數(shù)期，培養(yǎng)到12 h所對應(yīng)的吸光度值為0.824，菌數(shù)測定結(jié)果為I.OxlOs CFU/mL，達到接種所需菌數(shù)要求，因此選擇12 h作為接種菌齡。16 h后菌種則進入穩(wěn)定期。

醋酸菌的生長曲線延滯期不明顯，0-36 h為指數(shù)期，取指數(shù)期菌液進行平板菌數(shù)測定，20h對應(yīng)的吸光度值為0.408，菌數(shù)為4.OxlOs CFU/mL，達到接種所需菌數(shù)要求，因此選擇20 h作為接種菌齡，36h以后進入穩(wěn)定期。

2.2發(fā)酵條件的篩選結(jié)果

2.2.1初始SSC

設(shè)置不同初始SSC梯度，接種量10%，發(fā)酵6d，每2d測定產(chǎn)品pH值、殘余SSC，6d后進行感官評分，pH值和SSC變化曲線圖如圖2和圖3所示，6d后感官評分結(jié)果如圖4所示，

由圖2可見，添加酵母菌發(fā)酵2d時，各梯度發(fā)酵液pH值相差不大，處于4.62-4.78之間。添加乳酸菌和醋酸菌發(fā)酵4d和6d后，糖分被菌種利用，進而發(fā)酵產(chǎn)酸，初始SSC越大的產(chǎn)品pH值越低，可見菌種可利用的糖分越多，產(chǎn)酸越多。6d后各梯度發(fā)酵液pH值降至4.24-4.40。乳酸菌、醋酸菌發(fā)酵時產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸，還產(chǎn)生少量甲酸、丙酸等其他酸性末端產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可使pH值下降，起到抑制有害微生物的作用。發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物如酸類、醇類和酯類及殘余的糖分共同影響了產(chǎn)品的口感和風(fēng)味。

由圖3可見，SSC中的糖類等可發(fā)酵物質(zhì)被菌種利用，經(jīng)2d、4d、6d后均逐漸減少。發(fā)酵6d后的感官評分圖見圖4，初始SSC為18%-22%時，氣味較酸，稍刺鼻，口感較酸，稍苦澀，色澤稍暗淡，有沉淀，感官評分60分以下；初始SSC為26%時，有番木瓜氣味，口感較甜，稍酸，色澤均勻，有沉淀，感官評分為70分；初始SSC為30%～34%時，氣味香甜，有番木瓜典型氣味，口感甜，稍酸，色澤均勻，有沉淀，感官評分為85分以上?？紤]到添加糖分過多會造成口感過甜，從人體健康和成本方面考慮，選擇評分較高的初始SSC為26%、30%，34%進行正交試驗。

2.2.2發(fā)酵時間

設(shè)置初始SSC為30%，接種量為10%，發(fā)酵不同天數(shù)后，測定產(chǎn)品pH值、SSC，并進行感官評分，結(jié)果見圖5和圖6。

番木瓜汁接種酵母發(fā)酵2d后，經(jīng)85 0C燙煮殺菌，接入醋酸菌和乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵。如圖5所示，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)品pH值逐漸下降。發(fā)酵3d后的pH值為4.43，發(fā)酵4d后為4.25，在發(fā)酵7d后降至4.15。如圖6所示，發(fā)酵時間越長，糖分被轉(zhuǎn)化，殘余SSC呈下降趨勢，發(fā)酵4d時為21%，7d后降至12%。酵母菌含有麥芽糖酶、蔗糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖分解酶及脂肪酶等，在這一系列酶的作用下，將原料中的糖分轉(zhuǎn)化。將酵母菌殺滅后，接種乳酸菌和醋酸菌，醋酸菌有很強的醇脫氫酶、醛脫氫酶等氧化酶系活力，除能氧化酒精生成醋酸外，還有氧化其他醇類和糖類的能力，生成相應(yīng)的酸、酮等物質(zhì)，與乳酸菌共同作用形成產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)。感官評定結(jié)果為，發(fā)酵3d的產(chǎn)品色澤均一，香氣較濃郁，口感過甜，微酸，有沉淀；發(fā)酵4d的產(chǎn)品色澤均一，香氣純正濃郁，口感酸甜協(xié)調(diào)，有沉淀，得分為87分；發(fā)酵5d、6d的產(chǎn)品色澤均一，氣味較為協(xié)調(diào)，口感微甜，較酸，有沉淀，得分為80分、76分；發(fā)酵7d的產(chǎn)品色澤均一，氣味稍刺鼻，口感不甜，較酸，有沉淀，質(zhì)量欠佳的原因可能是發(fā)酵時間過長，糖度過低，菌種后期產(chǎn)生的代謝物質(zhì)和死亡自溶產(chǎn)生的物質(zhì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此選擇發(fā)酵時間為4d、Sd、6d進行正交試驗。

2.2.3接種量

番木瓜汁初始SSC為30%，測得初始pH值為4.07。設(shè)置不同的接種量，每2d測定產(chǎn)品pH值、殘余SSC，發(fā)酵4d后進行感官評分，結(jié)果見圖7-圖9。

不同接種量的pH值變化情況如圖7所示，隨著發(fā)酵時間延長，pH值下降。不同接種量對pH值影響不明顯，接種量增加，pH值稍有上升。發(fā)酵4d各梯度發(fā)酵液pH值為3.83-3.94。說明菌種在一定時間內(nèi)完成增殖后，均能夠發(fā)酵產(chǎn)酸使產(chǎn)品pH值降低，接種量小，增殖達到相應(yīng)的數(shù)量雖然慢一些，但不影響最終產(chǎn)酸量，可能在酸性物質(zhì)的種類上有差別。

不同接種量的SSC變化情況如圖8所示，接種量對殘余SSC影響較大，隨著接種量增加，殘余SSC呈下降趨勢，發(fā)酵4d時，接種量為2%的產(chǎn)品，其SSC為26%，接種量為12%的產(chǎn)品，其SSC為21%。

圖9所示為感官評分結(jié)果，隨著接種量的增加，感官評分分值逐漸上升。接種量為9%～12%的產(chǎn)品的感官評分都達到了87分，色澤呈橙黃色，氣味較為濃郁，口感酸甜適中，有沉淀。因此選擇接種量為6%、g%、12%進行正交試驗。

2.2.4正交試驗

正交試驗結(jié)果和極差分析結(jié)果分別如表4、表5所示。

從表4、表5可知，以感官評分為指標，3個因素影響的主次是A>C>B，即發(fā)酵時間>接種量>初始SSC；試驗最優(yōu)組合為AIB2C2，即初始SSC為30%、發(fā)酵時間為4d、接種量為g%，此時其感官評分得分最高。

2.2.5驗證試驗

根據(jù)正交試驗所得的最佳發(fā)酵條件進行驗證試驗，分別在發(fā)酵0、2d、4d時測定各項指標，見表6。

番木瓜汁發(fā)酵4d所得酵素產(chǎn)品色澤呈橙紅色，純正均一，具有番木瓜的典型濃郁香氣和發(fā)酵飲料酸甜可口的特征，感官評分為88分。經(jīng)測定產(chǎn)品酒精度為0、pH值為3.53、SSC為14%、維生素C質(zhì)量濃度為31.98 mg/（100 9），羥基自由基清除率為90.1%。羥基自由基是一種極具攻擊性的活性氧，與機體多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。本研究所得番木瓜汁發(fā)酵飲料的羥基自由基清除率數(shù)值和文獻[8]所得酵素相近，具有一定的抗氧化能力，原因是產(chǎn)品保留了原料的維生素C成分，富含酚類物質(zhì)，且酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生抗氧化性物質(zhì)[10]。

3結(jié)論

本研究以番木瓜汁為原材料，先將酵母菌接種，發(fā)酵2d，燙殺后添加乳酸菌和醋酸菌，再發(fā)酵2d，發(fā)酵液經(jīng)殺菌，放置于4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，棄沉淀物，取上清液，得到一種不含酒精、酸甜可口的番木瓜汁發(fā)酵飲料。番木瓜汁發(fā)酵飲料為橙紅色，顏色明艷，富含維生素C，具有一定的抗氧化能力，符合時尚健康飲品的需求趨勢，其富含酶類，香氣濃郁，可以助消化，清新口氣，值得進一步研發(fā)和推廣。

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Preparation technology of non-alcoholic fermented beverage of

papaya juice

ZHANG Fan"2， HUANG Yao*"2， LING Minghui"2， SU Jiajun"2， LAO Rihao"2， BI Jindong"2

（ I . ?School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou? ?545006， China; 2. Guangxi Liuzhou River Snail Rice Noodles Engineering Technology Research Center

（ Guangxi University of Science and Technology） ?， Liuzhou 545006， China）

Abstract： The C.arica papaya Linn. used as the raw material， the technological conditions of non-? ?alcoholic fermented beverage were studied. The non-alcoholic fermented beverage was produced by? ?adding yeast for 2 d fermentation and inactivating yeast， adding acetic acid bacteria and lactic acid? bacteria. And the inoculation volume ratio of yeast， acetic acid bacteria and lactic acid bacteria was? ?I ： I ： 1?The growth curves of three strains were studied， the optimum inoculation age were yeast 20 h? ?（2.Ox107 CFU/mL）， acetic acid bacteria 20 h （4.Ox108 CFU/mL） and lactic acid bacteria 12 h （ l.Ox

108 CFU/mL） . The best fermentation process of papaya juice fermented beverage by orthogonal test

is as follows： The initial SSC（soluble solid content ）was 30%， the inoculation amount was g%， and the? fermentation period was 4 d. The fermentation broth was sterilized and refrigerated at 4 0C for 3 d? ?clarification. then the precipitation was discarded and the supernatant was taken. The product contained? ?no alcohol， pH 3.53， SSC 14%， vitamin C content 31.98 mg/（100 g）， hydroxyl radical clearance rate? ?90. 1%. It is orange red in color， with a strong aroma of C. arica papaya Linn. and a sweet and sour taste.

Key words： C.arica papaya Linn.; fermented beverage; inoculation age; fermentation process; sensory? ?evaluation