王治方，徐引弟，朱文豪，焦文強，張青嫻，李海利，許 峰，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

【研究意義】副豬格拉菌（Glaesserella parasuis，GPS），原名副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS），是一種革蘭氏陰性、長短不一的多形態(tài)細小桿菌，屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，是引起豬革拉澤氏病的病原體［1-2］。GPS 在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，可長期定殖于健康豬的上呼吸道，一般情況下不引起豬只發(fā)病，但當(dāng)斷奶、轉(zhuǎn)群等應(yīng)激因素導(dǎo)致機體抵抗力降低時，可作為原發(fā)病原或繼發(fā)病原感染任何年齡、品種的豬，臨床發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達50%以上。發(fā)病豬群主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、四肢末端發(fā)紺、跛行、呼吸困難、顫抖、共濟失調(diào)等；典型病例的剖檢變化主要在腹膜、心包膜、胸膜，或關(guān)節(jié)面出現(xiàn)漿液-纖維素性或纖維素性化膿性炎癥，胸腔、腹腔和心包積液增多，嚴(yán)重時可形成“絨毛心”，已成為當(dāng)前養(yǎng)豬場最常見的細菌性病原之一［3-5］?！厩叭搜芯窟M展】GPS 血清型較多，不同國家或地區(qū)的流行菌株血清型不同，菌株致病力和臨床表現(xiàn)也不盡相同。菌株毒力與血清型有較大關(guān)聯(lián)，普遍認為血清1、5、10、12、13、14 型為高毒力菌株，血清2、4、15 為中等毒力菌株；血清3、6、7、8、9、11 型為無毒力菌株［6-7］。但近年來也有研究表明，GPS 臨床菌株毒力與血清型并不完全相關(guān)，同一血清型不同菌株的毒力不同甚至存在明顯差異。不同地區(qū)GPS 臨床菌株耐藥表型不同，同一地區(qū)菌株耐藥性也呈現(xiàn)動態(tài)變化，大都表現(xiàn)出耐藥增強趨勢，導(dǎo)致GPS臨床防控更加復(fù)雜［8-9］?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關(guān)GPS 血清2 型的報道較少，在河南地區(qū)的報道更少，而本實驗室近年來不時從臨床病例中分離到GPS 血清2 型，表明血清2型的危害越來越嚴(yán)重。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗對河南省焦作某規(guī)?；i場的疑似GPS 病例進行細菌病原分離培養(yǎng)、純化，獲得1 株可疑病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、PCR 鑒定、分型，證實該菌株為豬GPS 血清2 型；同時對該分離菌株的致病性、耐藥性、毒力基因和耐藥基因攜帶等部分生物學(xué)特性進行研究，旨在為GPS 的臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 病料來源于2022 年7 月河南省焦作某規(guī)?；i場保育豬群臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、消瘦、被毛粗亂、喘氣、部分豬關(guān)節(jié)腫大、跛行等癥狀的疑似病例，剖檢癥狀典型的病豬，采集肺臟、肝臟、氣管、心血和關(guān)節(jié)液等病料。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB），購自美國BD Difco 公司；細菌總DNA 提取試劑盒、新生牛血清，購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ，NAD），購自Hoffmann-La Roche 有限責(zé)任公司；革蘭氏染液試劑盒，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTMMix 等PCR 試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司；相關(guān)引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 試驗動物 10 只體質(zhì)量250 g 左右的健康豚鼠，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離、純化 將無菌采集的發(fā)病豬氣管、肺臟、心血等病料，分別接種于TSA平板（含5%新生牛血清、0.001% NAD）上，37 ℃培養(yǎng)24～36 h；挑選無色透明針尖狀可疑菌落于TSA 平板上劃線培養(yǎng)純化，37 ℃培養(yǎng)24～36 h；挑取單個菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢，通過掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)；分離菌于10 mL TSB（含5%新生牛血清、0.001% NAD）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，6 000 r/min離心5 min，PBS 洗脫3 次，用1.5 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定4 h 以上，送武漢賽維爾生物科技有限公司進行電鏡觀察。

1.2.2 菌株鑒定和分型 參照文獻［10-12］設(shè)計擴 增GPS 16S rRNA 基因和GPS 血清2型wzx基因的特異性引物（表1）。挑取分離菌株于37 ℃培養(yǎng)30 h 的培養(yǎng)物，按照DNA 提取試劑盒說明書提取菌株DNA，用16S rRNA 基因特異性引物和wzx基因引物對分離株DNA 進行PCR 擴增鑒定和分型。PCR 擴增體系25 μL：2×Premix TaqTMMix13 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min、退火（退火溫度見表1）1 min、72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果?；厥誔CR陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 菌株鑒定及分型的引物信息Table 1 Primers information of strain identification and typing

1.2.3 毒力基因檢測 參照文獻［13-14］設(shè)計擴增GPS 部分毒力基因的引物（表2），以分離菌株DNA 為模板進行PCR 擴增，檢測分離菌株毒力基因攜帶情況，PCR 擴增體系和擴增條件參照1.2.2。

表2 毒力基因檢測的引物信息Table 2 Primers information of virulence genes detecting

1.2.4 致病性試驗 將實驗豚鼠隨機分為試驗組和對照組，每組5 只。將分離菌株接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h 后測定菌體濃度，連續(xù)10 倍稀釋，選取合適滴度涂布TSA 固體平板，每個滴度3 個平板，每個平板100 μL，37 ℃培養(yǎng)36 h 后活菌計數(shù)，計算原液菌體濃度，調(diào)整菌體濃度至1×109CFU/mL 備用。試驗組豚鼠腹腔注射菌液1 mL/只；對照組豚鼠腹腔注射生理鹽水1 mL/只。觀察記錄每組發(fā)病情況，連續(xù)觀察5 d，對發(fā)病死亡豚鼠進行病理解剖、細菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 采用瓊脂擴散法（K-B 法）［15］，將分離菌株接種于TSA 培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)30 h 后挑取菌落，用滅菌PBS 液調(diào)整成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海脺缇奘米訉⒕鷳乙壕鶆蛲坑赥SA 平板表面，挑取臨床上常用的抗生素藥敏片均勻貼于涂有菌液的平板上，37 ℃培養(yǎng)36 h 后測量、記錄藥敏片抑菌圈直徑，結(jié)果判斷方法參照藥敏片說明書。

1.2.6 耐藥基因檢測 參照文獻［16-17］設(shè)計引物（表3），擴增β 內(nèi)酰胺類（blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1）、氨基糖甙類〔aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1〕、四環(huán)素類〔tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G)〕、喹諾酮類（gyrA、parC）和磺胺類（sul1、sul2、sul3）的耐藥基因。以分離菌株DNA 為模板進行PCR擴增，檢測分離菌株攜帶耐藥基因情況，PCR 擴增體系和擴增條件參照1.2.2。

表3 耐藥基因檢測的引物信息Table3 Primers information of drug-resistant genes detecting

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)純化結(jié)果

通過細菌分離培養(yǎng)、純化，在豬肺臟組織樣品中分離獲得1 株疑似副豬格拉菌。該株細菌生長較緩慢，培養(yǎng)30 h 后的菌落針尖大小，形態(tài)明顯，呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊，半透明、略帶藍色熒光；接種于不含NAD 的TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)均不能生長。挑取單個菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，該菌株為革蘭氏陰性球桿狀、短桿狀，有少量長絲狀等多形態(tài)菌體（圖1A）；掃描電鏡下，菌體表面粗糙，呈短繩狀（圖1B）。

圖1 副豬格拉菌形態(tài)Fig.1 Morphology of Glaesserella parasuis

2.2 菌株鑒定和血清型檢測結(jié)果

通過PCR 擴增鑒定，分離菌株擴增出大小分別為1 090、295 bp 的產(chǎn)物帶（圖2），條帶和GPS、血清2 型目的條帶大小一致。PCR 擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果利用BLAST 軟件進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，該菌株與GPS 2 型CL120103 菌株（CP020085.1）的同源性為100%，證明分離的菌株為副豬格拉菌，血清型為2 型，暫命名為HN1553。

圖2 菌株血清型PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification and typing of strains by PCR

2.3 毒力基因測定結(jié)果

PCR 擴增檢測HN1553 菌株的毒力基因，結(jié)果（圖3）顯示，vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2 毒力基因為陽性。

圖3 副豬格拉菌毒力基因PCR 檢測結(jié)果Fig.3 PCR results of virulence genes of Glaesserella parasuis

2.4 致病性試驗結(jié)果

注射菌液3 h 后，試驗組的5 只豚鼠先后出現(xiàn)食欲減退、被毛蓬亂、蜷縮扎堆、顫抖等癥狀；攻毒18～36 h，豚鼠先后死亡4 只。對死亡豚鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)胸腔、腹腔少量積液，腹腔粘膜有新鮮出血斑點（圖4A），肝臟、脾臟有少量纖維性滲出物附著（圖4B）。用腹水、心血、肝臟、脾臟觸片，革蘭氏染色鏡檢均發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性細小桿菌（圖5）。無菌采集死亡豚鼠的心血、肝臟、脾臟、腹水、腦分別接種TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)30 h 后，培養(yǎng)基平板均長出均一的針尖大小菌落，經(jīng)鑒定均為GPS 血清2 型。試驗組未死亡的發(fā)病豚鼠攻毒72 h 后，被毛粗亂、扎堆等癥狀減輕，食欲好轉(zhuǎn)；攻毒5 d 后，癥狀消失，剖檢豚鼠發(fā)現(xiàn)腹腔粘膜有少量陳舊性出血，肝臟、脾臟、腹腔有少量纖維素性滲出物，脾臟腫大；采集心血、肝臟、脾臟分別接種TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)48 h 均未見細菌生長。試驗期間，對照組豚鼠生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

圖4 死亡豚鼠剖檢癥狀Fig.4 Necropsy symptoms of dead cavy

圖5 肝臟的副豬格拉菌形態(tài)Fig.5 Morphology of Glaesserella parasuis in liver

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表4）顯示，菌株HN1553對頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星敏感；對新霉素、強力霉素、諾氟沙星的敏感性處于敏感和耐藥之間；對青霉素G、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)耐藥。

表4 藥敏試驗結(jié)果Table 4 Drug sensitivity test results

2.6 耐藥基因檢測結(jié)果

PCR 擴增檢測HN1553 菌株的耐藥基因，結(jié)果（圖6）顯示，aadA1、strA、strB、aphA1、tet（B）、sul2 基因擴增出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致，證明HN1553 菌株攜帶氨基糖苷類耐藥基因aadA1、strA、strB、aphA1，四環(huán)素類耐藥基因tet（B）和磺胺類耐藥基因sul2。

圖6 副豬格拉菌耐藥基因PCR 檢測結(jié)果Fig.6 PCR results of drug-resistant genes of Glaesserella parasuis

3 討論

副豬格拉菌是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要細菌性病原之一，可長期定植于健康豬的上呼吸道，一旦機體抗體下降，就可突破機體防御體系，大量繁殖侵入機體不同臟器，引起局部病變或全身癥狀，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成不同程度的危害。本研究在河南焦作某豬場的疑似副豬格拉菌病例中，通過細菌分離、純化、形態(tài)觀察、PCR 鑒定等技術(shù)手段，獲得1 株副豬格拉菌血清2 型菌株HN1553。

細菌感染機體發(fā)病是細菌所有毒力基因共同參與的復(fù)雜動態(tài)過程，包括細菌粘附、侵入宿主、逃避防御、體內(nèi)繁殖、組織損傷等［18］。副豬格拉菌毒力因子多，致病機理復(fù)雜，對HN1553 菌株擴增檢測14 個常見毒力基因，其中10 個毒力基因為陽性，說明該菌株攜帶有較多的毒力基因，多個毒力基因的協(xié)同作用使該菌株表現(xiàn)出較強的致病性。本研究利用豚鼠試驗分析了菌株HN1553 的毒力強弱，1×109CFU/mL 濃度菌懸液能使豚鼠100%發(fā)病，80%死亡，與賀云霞等［8］的試驗結(jié)果一致。試驗過程中，發(fā)病豚鼠均表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，死亡豚鼠有較明顯臟器病變，臟器觸片染色能發(fā)現(xiàn)細菌，且能從肝臟、脾臟、腦等器官中分離出感染菌株，表明HN1553 菌株對豚鼠有較強的致病性，且能夠突破豚鼠的血腦屏障引起腦部感染。

疫苗免疫和抗生素使用是防控副豬格拉菌病的有效途徑，但由于副豬格拉菌血清型之間交叉保護差，流行菌株和疫苗菌株血清型不一致，導(dǎo)致疫苗臨床防疫效果不佳；同時養(yǎng)殖過程中長期不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致細菌耐藥性越來越嚴(yán)重，使得藥物抗菌效果越來越差［19］。本研究利用紙片法篩選了菌株HN1553 的敏感藥物，發(fā)現(xiàn)該菌株對頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢氨芐、阿莫西林頭孢類藥物敏感，與先前大部分研究結(jié)果相同；對左氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星喹諾酮類藥物敏感，與王治方等［20］、萬世平等［21］報道結(jié)果相同，與王同兆等［22］試驗結(jié)果不同。該菌株對青霉素G、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素耐藥；對復(fù)方新諾明完全耐藥，與朱孟玲等［23］、史開志等［24］的研究結(jié)果一致。細菌耐藥表型與其攜帶的耐藥基因有一定關(guān)聯(lián)性，利用PCR 擴增技術(shù)對菌株HN1553 進行耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶有氨基糖苷類耐藥基因aadA1、strA、strB、aphA1，四環(huán)素類耐藥基因tet（B）和磺胺類耐藥基因sul2，菌株耐藥表型和耐藥基因攜帶基本吻合。規(guī)模化豬場發(fā)生副豬格拉菌感染病時，應(yīng)及時分離細菌，篩選敏感藥物，是提高治療效果和降低細菌耐藥性的關(guān)鍵。此外，對細菌進行分型鑒定，有針對性地選擇血清型相同的疫苗進行免疫接種，是防控該病的首選策略。

4 結(jié)論

本試驗對河南某豬場臨床疑似副豬格拉菌病例豬只進行病原菌分離鑒定、敏感藥物篩選及臨床藥物治療預(yù)防效果分析，證實該豬場保育仔豬的臨床癥狀是由副豬格拉菌血清2 型菌株引起的。對該分離菌株HN1553 的部分生物學(xué)特性進行研究，結(jié)果表明該菌株毒力較強，攜帶多個毒力基因和耐藥基因，對頭孢類藥物和喹諾酮類藥物敏感，對氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物耐藥，表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象。本研究為副豬格拉菌血清2 型流行病學(xué)、致病機制研究提供參考，為副豬格拉菌病的臨床綜合防控提供依據(jù)。