徐淑玉，區(qū)又君，溫久福，林欣，4，李加兒

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000；4.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116000）

【研究意義】四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）具有肉嫩味美、生長速度快、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)［1］，且其生長周期短，經(jīng)濟(jì)回報(bào)高，因此深受漁民喜愛。四指馬鲅是一種廣鹽性魚類，當(dāng)水體滲透壓變低時(shí)，機(jī)體會產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境變化，當(dāng)鹽度超過其耐受范圍時(shí)就會造成死亡，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下降。魚類的鰓組織不僅是主要的呼吸器官［2］，還參與滲透壓調(diào)節(jié)、離子平衡及體液pH 調(diào)節(jié)等［3］，在鹽度適應(yīng)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。心臟是最重要的能量供應(yīng)器官，與物質(zhì)的運(yùn)輸、內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定和魚類的防御功能密切相關(guān)［4］。脾臟是最大的周圍淋巴器官，有過濾血液和對侵入血內(nèi)的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答等重要功能。肝臟是人體最大的消化腺，除分泌膽汁參與消化機(jī)能外，還有貯藏養(yǎng)分、代謝和解毒等作用。因此，研究四指馬鲅幼魚鰓、心臟、脾臟和肝臟在急性淡水脅迫下的變化，對探討四指馬鲅低鹽度養(yǎng)殖具有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已有鹽度脅迫相關(guān)養(yǎng)殖研究，如鹽度脅迫對斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）應(yīng)答基因的分析［5］、鹽度脅迫對細(xì)鱗鮭幼魚酶活的影響［6］、鹽度驟降對大黃魚的影響［7］等。王雯等［8］研究顯示，斜帶石斑魚幼魚在急性淡水脅迫下不能長期存活。?，撛碌龋?］研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅幼魚在不同鹽度條件下的存活率和鰓組織形態(tài)有較大差異。急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚的影響研究較少，尤其是急性淡水脅迫對魚類心臟影響的研究鮮有報(bào)道，Morgenroth等［10］指出鹽度脅迫對黃尾鰤（Seriola lalandi）的心肺功能和生長性能無實(shí)質(zhì)影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】魚類的滲透壓調(diào)節(jié)通過水和離子的運(yùn)輸來實(shí)現(xiàn)［11］，是鰓、腎臟和腸道等水和離子運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)果［12］。不同海洋生物對鹽度變化的適應(yīng)機(jī)制不相同。本研究以四指馬鲅幼魚為研究對象，分析四指馬鲅幼魚鰓、心臟、脾臟和肝臟在鹽度0 和9 下的反應(yīng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用掃描電子顯微鏡技術(shù)和組織石蠟切片，分析四指馬鲅幼魚鰓、心臟、脾臟和肝臟對急性淡水脅迫的適應(yīng)性，為四指馬鲅的低鹽度養(yǎng)殖及良種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

四指馬鲅為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所中山科技成果轉(zhuǎn)化基地自繁自育，14 日齡，平均全長2.31 cm，平均體質(zhì)量3.81 g。試驗(yàn)所用水族箱長58 cm、寬48 cm、高45 cm，水位28 cm。試驗(yàn)開始日期為2021 年7 月，開始前于室內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)鹽度為9.0±0.5，水溫28（±1）℃，期間每天換水1 次，每次換水1/3 并連續(xù)24 h 充氣增氧。暫養(yǎng)期結(jié)束時(shí)隨機(jī)挑選體色正常、體格均勻且健康的魚進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)淡水脅迫（鹽度為0）2、6、12、24、48、72 h 共6 個(gè)處理，未受淡水脅迫的正常鹽度（鹽度為9）處理為對照，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)平行，每個(gè)平行30 尾魚。將暫養(yǎng)于鹽度9 水體中的四指馬鲅幼魚放入鹽度0 的水體中。試驗(yàn)期間水溫控制在26～28 ℃之間，連續(xù)充氣增氧，每天換水1 次，每次換水1/3，調(diào)節(jié)鹽度，誤差不超過0.5。每天9:00 和17:00 各投喂1 次，喂食1 h 后將殘餌及糞便用虹吸法吸出。

1.2.2 樣品采集與處理 在2、6、12、24、48、72 h 時(shí)，從相應(yīng)處理中隨機(jī)選取3 尾魚，活體取魚鰓、心臟、脾臟和肝臟組織，分別切成小塊，用4%多聚甲醛溶液固定。固定后將樣品在流水中沖洗12 h，在50%～100%的乙醇梯度中脫水（50%乙醇2 h，70%乙醇4 h，80%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇45 min×2 次，100%乙醇45 min×2 次）；用二甲苯進(jìn)行透明處理（1/2 無水乙醇+1/2二甲苯混合物1 h，二甲苯15 min×2次）；浸蠟（石蠟2 h×2 次），石蠟包埋、切片（厚度5～6 μm），蘇木精-曙紅（HE）染色，用中性樹脂密封；在光學(xué)顯微鏡（MZDR0850）下觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

由表1 可知，淡水脅迫2～72 h 對四指馬鲅幼魚鰓小片長度、寬度和間距的影響不同，鰓小片長度出現(xiàn)逐漸增長的趨勢，寬度先縮小后逐漸增大，鰓小片間距則先增大后有回落。由圖1 可見，對照（圖1a）四指馬鲅幼魚未受到脅迫，細(xì)胞具有正常的生理形態(tài)，鰓絲整齊致密，兩側(cè)鰓小片對稱完整，上皮細(xì)胞排列有序，線粒體細(xì)胞呈橢圓形。淡水脅迫2 h 時(shí)（圖1b），線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量增加，血細(xì)胞數(shù)量變多，鰓小片的表皮輕微剝落，鰓細(xì)胞末端輕微腫脹。淡水脅迫6 h 時(shí)（圖1c），線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量明顯增多，血細(xì)胞數(shù)量增多，表皮脫落明顯增多。淡水脅迫12 h 時(shí)（圖1d），線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量與淡水脅迫6 h 相比沒有明顯變化，但體積增大，并出現(xiàn)向上蔓延的趨勢；血細(xì)胞數(shù)量減少，表皮脫落情況與淡水脅迫6 h 沒有明顯差別，鰓小片末端變小。淡水脅迫24 h 時(shí)（圖1e），鰓絲和鰓小片基部線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量變多，體積變大，繼續(xù)呈向上蔓延趨勢；血細(xì)胞數(shù)量增多，表皮脫落情況與淡水脅迫6 h 沒有明顯差別，鰓小片末端明顯變小。淡水脅迫48 h 時(shí)（圖1f），鰓小片上（非基部）的線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量增多，鰓小片末端表皮出現(xiàn)小范圍脫落，紅細(xì)胞吸水漲破。淡水脅迫72 h 時(shí)（圖1g），鰓小片上（非基部）線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量明顯增多，位置進(jìn)一步上升；鰓小片末端的表皮大量脫落，血細(xì)胞數(shù)量比淡水脅迫48 h 時(shí)減少，鰓小片形狀不規(guī)則。

圖1 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of acute freshwater stress on the tissue structure of the gill of juvenile Eleutheronema tetradactylum

表1 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚鰓小片長度、寬度和間距的影響Table 1 Effects of acute freshwater stress on the length,width and spacing of gill lamella of juvenile Eleutheronema tetradactylum

2.2 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖2a 可見，對照四指馬鲅幼魚未受到脅迫，心肌橫紋肌明顯，細(xì)胞核清晰，間質(zhì)血管大小適中，肌細(xì)胞束間界限明顯。淡水脅迫2 h 時(shí)（圖2b），心肌橫紋肌、心肌細(xì)胞間隙略有變大，間質(zhì)血管也稍微變大。淡水脅迫6 h 時(shí)（圖2c），心肌橫紋肌逐漸膨脹，心肌細(xì)胞間隙、間質(zhì)血管逐漸變大。淡水脅迫12 h 時(shí)（圖2d），心肌橫紋肌達(dá)到最大值，心肌細(xì)胞間隙和間質(zhì)血管大小明顯變大。淡水脅迫24 h 時(shí)（圖2e），心肌橫紋肌開始縮小，心肌細(xì)胞間隙和間質(zhì)血管達(dá)到最大值。淡水脅迫48 h 后（圖2f），心肌細(xì)胞間隙逐漸變小，并且心肌間質(zhì)血管也逐漸變小，心肌橫紋肌較為明顯。淡水脅迫72 h 時(shí)（圖2g），心肌橫紋肌略模糊，心肌細(xì)胞間隙、間質(zhì)血管變得更小，肌細(xì)胞束間界限不明顯，細(xì)胞核沒有之前清晰?？傮w來說，心肌橫紋肌大小、心肌細(xì)胞間隙大小和間質(zhì)血管大小均呈現(xiàn)先增后減的趨勢。心肌橫紋肌大小的峰值出現(xiàn)在淡水脅迫12 h 時(shí)，心肌細(xì)胞間隙和間質(zhì)血管大小的峰值則出現(xiàn)在淡水脅迫24 h 時(shí)。

圖2 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚心臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of acute freshwater stress on the tissue structure of the heart of juvenile Eleutheronema tetradactylum

2.3 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖3a 可見，對照四指馬鲅幼魚脾臟最外層被膜較厚，表面覆有間皮，被膜結(jié)締組織伸入脾內(nèi)形成許多小梁，小梁和被膜內(nèi)的平滑肌細(xì)胞較為規(guī)整。被膜以下由紅髓、邊緣區(qū)和白髓組成，白髓區(qū)域面積相對紅髓區(qū)域明顯小很多，黑色素巨噬細(xì)胞顏色較淺。與對照相比較，淡水脅迫2 h 時(shí)（圖3b），白髓面積和邊緣區(qū)面積增加，黑色素巨噬細(xì)胞顏色也略有加深。淡水脅迫6 h 時(shí)（圖3c），白髓和邊緣區(qū)面積進(jìn)一步擴(kuò)大，黑色素巨噬細(xì)胞的顏色進(jìn)一步加深。淡水脅迫12 h 時(shí)（圖3d），白髓面積增大，組織中紅細(xì)胞數(shù)量增多，邊緣區(qū)面積增大，黑色素巨噬細(xì)胞顏色變深。淡水脅迫24 h 時(shí)（圖3e），白髓和邊緣區(qū)面積達(dá)到峰值，黑色素巨噬細(xì)胞顏色也達(dá)到峰值。淡水脅迫48 h 時(shí)（圖3f），白髓和邊緣區(qū)面積減小，黑色素巨噬細(xì)胞顏色變淺。淡水脅迫72 h 時(shí)（圖3g），紅髓、邊緣區(qū)、白髓和黑色素巨噬細(xì)胞基本恢復(fù)至對照水平。

圖3 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of acute freshwater stress on the tissue structure of the spleen of juvenile Eleutheronema tetradactylum

2.4 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖4a 可見，未受到脅迫的對照肝細(xì)胞體積較大，呈多面體，細(xì)胞核呈圓球形且位于中央，部分肝細(xì)胞具有2～3 個(gè)核；肝板結(jié)構(gòu)清晰；肝血竇形態(tài)正常，分布于肝細(xì)胞之間。淡水脅迫2 h時(shí)（圖4b），肝板結(jié)構(gòu)變得模糊，肝小葉空泡相對增大，肝血竇間隙增寬，部分細(xì)胞核向肝外側(cè)遷移。淡水脅迫6 h 時(shí)（圖4c），肝板結(jié)構(gòu)更模糊，肝小葉空泡繼續(xù)增大，肝血竇間隙增寬，更多細(xì)胞核向肝外側(cè)遷移。淡水脅迫12 h 時(shí)（圖4d），肝板結(jié)構(gòu)進(jìn)一步模糊，肝小葉空泡繼續(xù)增大，肝血竇間隙增寬，絕大部分細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣，同時(shí)血管形狀變得不規(guī)則。淡水脅迫24 h 時(shí)（圖4e），肝板結(jié)構(gòu)的模糊程度達(dá)到頂峰，肝血竇間隙寬度也達(dá)到頂峰，肝小葉空泡繼續(xù)增大；大部分肝細(xì)胞核失去原有形態(tài)，多數(shù)細(xì)胞核變形呈紡錘形或圓形。淡水脅迫48 h 時(shí)（圖4f），細(xì)胞空泡持續(xù)增大，細(xì)胞著色較淺，肝小板結(jié)構(gòu)變得清晰，肝血竇間隙寬度縮小，一些細(xì)胞核失去固有形態(tài)。淡水脅迫72 h 時(shí)（圖4g），細(xì)胞空泡繼續(xù)增大，肝小板結(jié)構(gòu)清晰，肝血竇間隙寬度繼續(xù)縮小，大部分細(xì)胞核失去固有形態(tài)且位于細(xì)胞邊緣。

圖4 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of acute freshwater stress on the tissue structure of the liver of juvenile Eleutheronema tetradactylum

3 討論

3.1 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

鰓是多數(shù)水生動物的呼吸器官，用來吸收溶解在水中的氧。急性鹽度脅迫可以影響魚類的滲透壓平衡及細(xì)胞膜的通透性［13］。魚類鰓組織的線粒體豐富細(xì)胞主要負(fù)責(zé)離子的攝取和分泌［14-16］。?，撛碌龋?7］研究發(fā)現(xiàn)，與對照鹽度10 處理相比，生活在鹽度5 低鹽度水體中的四指馬鲅幼魚的鰓小片變細(xì)變長，向外延伸。本研究也發(fā)現(xiàn)隨著淡水脅迫時(shí)間的延長，鰓小片長度呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢。鰓小片通過增加長度的方式以增加與水體的接觸面，從而攝取水環(huán)境中的無機(jī)離子以適應(yīng)在低滲環(huán)境中生存。研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類還可以通過改變鰓絲上皮結(jié)構(gòu)來適應(yīng)環(huán)境中的鹽度變化。當(dāng)對幼年鱸魚（Lateolabrax japonicus）［18］施加不同的鹽度壓力時(shí)，淡水處理鱸魚的鰓片排列緊密，只有少量的氯細(xì)胞（即線粒體豐富細(xì)胞）分布，而暴露在鹽度15 的幼年鱸魚，其鰓片上的氯細(xì)胞增加并含有大量的粘液細(xì)胞。本研究滲透壓的突變使得淡水脅迫2 h 時(shí)四指馬鲅幼魚鰓的扁平上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微脫落，并在48 h 時(shí)出現(xiàn)大量脫落，這可能是由于長期淡水脅迫導(dǎo)致鰓的滲透壓紊亂。維持滲透壓和劇烈運(yùn)動都會導(dǎo)致細(xì)胞呼吸增加，從而導(dǎo)致耗氧量增加，這就需要更多的紅細(xì)胞來運(yùn)輸氧氣，從而使鰓片中出現(xiàn)更多紅細(xì)胞，但低水溫導(dǎo)致鰓血管收縮，導(dǎo)致紅細(xì)胞分布不均，局部出現(xiàn)大量血細(xì)胞堆積。這與陳彩芳等［19］對泥蚶（Tegillarca granosa）的研究結(jié)果相似。本研究中，淡水脅迫72 h 時(shí)四指馬鲅幼魚鰓血細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)回落，推測四指馬鲅幼魚已經(jīng)適應(yīng)了淡水環(huán)境。

增加尿液排泄也是維持魚體內(nèi)滲透壓的一種方式，多余的水通過尿液從體內(nèi)排出，從而使?jié)B透壓恢復(fù)穩(wěn)定。鰓小片末端變細(xì)可能與魚體大量排水有關(guān)。郭印等［20］將美洲鰣（Alosa sapidissims）幼魚投入淡水及鹽度5、10、20 的環(huán)境下96 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h 后各處理幼魚的滲透壓隨時(shí)間變化均呈下降趨勢并逐漸穩(wěn)定。本研究中，四指馬鲅幼魚鰓絲的形態(tài)在淡水脅迫24 h內(nèi)仍完整，此時(shí)它們可能處于積極恢復(fù)滲透調(diào)節(jié)的階段；而淡水脅迫24 h后，鰓小片末端明顯變細(xì)，表明四指馬鲅幼魚通過調(diào)節(jié)體內(nèi)含水量來適應(yīng)急性淡水脅迫。

鰓至少負(fù)責(zé)兩個(gè)重要功能，攝取氧氣和離子-水平衡［20］。維持溫帶海洋魚類的離子平衡，主要取決于鰓上皮的線粒體豐富細(xì)胞水平［21］。大量的線粒體分布在線粒體豐富細(xì)胞內(nèi)、核上和基底層［22-23］。線粒體豐富細(xì)胞適應(yīng)外部水環(huán)境鹽度的變化，主要通過細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能變化，以及結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致亞型之間發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)變來維持其生存。線粒體豐富細(xì)胞通過主動運(yùn)輸來加強(qiáng)水氧的交換量，使其能更好地適應(yīng)低鹽環(huán)境［24］。線粒體豐富細(xì)胞主要分布在鰓小葉的基部，其頂端小窩開口于鰓的表面，與外界環(huán)境直接接觸。線粒體豐富細(xì)胞在鰓上皮中所占比例雖然不高，僅約為8%，但在物質(zhì)交換的過程中發(fā)揮主動運(yùn)輸功能［25］。

線粒體豐富細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分布和數(shù)量適應(yīng)環(huán)境中滲透條件的變化，但物種之間存在一些差異。一般來說，線粒體豐富細(xì)胞在廣鹽性硬骨魚鰓上皮的分布有3 種適應(yīng)高滲或低滲環(huán)境的特點(diǎn)：（1）無論淡水或海水馴化時(shí)，線粒體豐富細(xì)胞僅分布在鰓絲上皮內(nèi)；（2）海水高滲環(huán)境時(shí)，線粒體豐富細(xì)胞分布在鰓絲上皮內(nèi)，但經(jīng)淡水低滲環(huán)境馴化，線粒體豐富細(xì)胞在鰓小片上皮內(nèi)也會有分布；（3）無論淡水或海水馴化，鰓絲和鰓小片上皮內(nèi)均有線粒體豐富細(xì)胞分布［26］。本研究結(jié)果顯示，低鹽環(huán)境下四指馬鲅幼魚需要大量的能量來維持滲透壓平衡，因此線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量逐漸增加；而線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量也隨著應(yīng)激時(shí)間的延遲而增加。當(dāng)線粒體豐富細(xì)胞布滿基部后，該細(xì)胞呈向鰓小片末端蔓延的趨勢，表明線粒體豐富細(xì)胞在滲透壓調(diào)節(jié)上發(fā)揮非常重要的作用。區(qū)又君等［27］也提出相似觀點(diǎn)，線粒體豐富細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性變化規(guī)律，是大多數(shù)廣鹽性魚類能適應(yīng)復(fù)雜多變水體鹽度的主要原因之一。扁平上皮細(xì)胞是鰓組織結(jié)構(gòu)的主要組成部分，主要以被動運(yùn)輸方式參與鰓的生理功能，其表面的微脊能進(jìn)一步增加鰓組織與水體的接觸面，起到增強(qiáng)氣體交換的作用。莊青青等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在低滲環(huán)境中，由于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）體內(nèi)的離子濃度比環(huán)境高，魚傾向于滲透性地吸收水，盡管多余的水會被腎臟排出體外，但尿液中損失的一些鹽分通過鰓的主動吸收得到補(bǔ)償。此時(shí)，活性離子吸收的壓力增加，需要更多的線粒體豐富細(xì)胞參與鹽離子的吸收，導(dǎo)致鹽度為0 時(shí)的線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量比鹽度為10 時(shí)增加。

3.2 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

心臟是魚類最重要的能量供應(yīng)器官，與物質(zhì)的運(yùn)輸、內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定和魚類的防御功能密切相關(guān)［29］。環(huán)境脅迫會使得魚類心臟受到損傷［30-31］。劉垚等［32］研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食會導(dǎo)致人的心室肥大，心腔擴(kuò)大；隨著時(shí)間推移，心室失代償，心室肌肉肥大，心臟逐漸喪失代償能力。本研究中，四指馬鲅幼魚心肌橫紋肌隨著淡水脅迫時(shí)間的延長逐漸變大，淡水脅迫12 h 時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸縮小趨于脅迫前水平。這表明與高鹽對人類心臟的影響相似，低鹽脅迫對四指馬鲅幼魚心臟的損傷主要體現(xiàn)在心肌橫紋肌增厚。但四指馬鲅幼魚與斑馬魚（Danio rerio）類似，心臟的修復(fù)能力較好［31］，故隨著時(shí)間的推移損傷逐漸消失。郭曉麗等［33］在熱應(yīng)激對大菱鲆（Scophthalmus maximus）心肌損傷及細(xì)胞凋亡的影響研究中指出，在24 ℃下熱應(yīng)激12 h 內(nèi)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)增厚、腫脹、透明質(zhì)變和染色質(zhì)固縮，說明在熱應(yīng)激下心肌細(xì)胞的收縮能力增強(qiáng)，增加了機(jī)體的散熱以維持生理活動。本研究中四指馬鲅幼魚心肌細(xì)胞在受到急性淡水脅迫后出現(xiàn)變粗的現(xiàn)象，這與前述研究相似，表明心肌細(xì)胞在急性淡水脅迫下擴(kuò)張能力增強(qiáng)，以維持其正常生理活動。

Wang等［34］指出，高鹽暴露會增加胚胎發(fā)育過程中雛雞心血管異常循環(huán)和心腔內(nèi)充血的風(fēng)險(xiǎn)，但心室細(xì)胞增殖和凋亡都增加。心室心肌細(xì)胞中高鹽誘導(dǎo)的高滲透壓導(dǎo)致的不完全分化與之類似。本研究中淡水脅迫的四指馬鲅幼魚心肌細(xì)胞和間質(zhì)血管粗細(xì)的先增后減變化，表明急性淡水脅迫會對四指馬鲅幼魚的心臟組織產(chǎn)生損害，并導(dǎo)致流向心臟的血液減少，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和吸收。經(jīng)過48 h 的恢復(fù)，間隙減小到壓力前的水平，充血減少，表明心臟組織能夠更好地修復(fù)淡水脅迫造成的損害。與之類似，許多脊椎動物可以使失去的組織和器官再生。如斑馬魚的心臟在受到嚴(yán)重傷害或組織損傷后可以再生，在斑馬魚心臟再生過程中，心肌細(xì)胞在7 dpa 時(shí)開始進(jìn)行DNA 合成和細(xì)胞增殖；增殖活動在14 dpa 達(dá)到高峰；新的心肌細(xì)胞取代了大部分失去的心室組織，心臟結(jié)構(gòu)在30 dpa 時(shí)完全恢復(fù)［31］。Morgenroth等［10］指出，廣鹽性魚類在低鹽度養(yǎng)殖條件下，體液與周圍水體的滲透梯度降低，從而降低調(diào)節(jié)滲透壓的能量成本，而能量可能被引導(dǎo)到生長等其他過程，其對黃尾鰤［10］的研究驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。

3.3 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

脾臟是魚體內(nèi)最大的周圍淋巴器官，位于血液循環(huán)的通路上，有過濾血液以及對侵入血內(nèi)的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答等重要功能。脾分為白髓、邊緣區(qū)和紅髓3個(gè)部分，脾內(nèi)有大量血竇。本研究中，淡水脅迫0～24 h 的白髓面積逐漸增大，后逐漸回落，這與運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟的影響研究結(jié)論［35］相似。脾臟免疫功能的強(qiáng)弱與脾臟白髓的面積密切相關(guān)，伍智等［36］研究發(fā)現(xiàn)，馬來穿山甲（Manis javaniaca）脾臟白髓的面積遠(yuǎn)比其他哺乳動物小，也就是脾小體和動脈周圍淋巴鞘的數(shù)量少，使得馬來穿山甲的免疫能力較差。胡玲玲等［37］也提到，脾臟對條石鯛（Oplegnathus fasciatus）的免疫能力有重大影響。本研究中，白髓面積增大體現(xiàn)了四指馬鲅幼魚為了適應(yīng)淡水脅迫，增加了脾小體和動脈周圍淋巴鞘的數(shù)量，從而增強(qiáng)對環(huán)境突變的適應(yīng)能力；淡水脅迫24～72 h白髓和紅髓區(qū)域趨于正常，淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常，表明四指馬鲅幼魚體內(nèi)的有害物質(zhì)減少，脾臟應(yīng)答能力恢復(fù)正常。黑色素巨噬細(xì)胞在集中處理體內(nèi)各種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)降解和再循環(huán)中發(fā)揮重要作用。衰老、饑餓、感染疾病、毒物作用等均有可能導(dǎo)致黑色素巨噬細(xì)胞增多［38］。本研究中黑色素巨噬細(xì)胞在受到淡水脅迫24 h 內(nèi)逐漸增大、顏色加深、數(shù)量增多，可能與血液中可溶或顆粒物質(zhì)先變多后變少有關(guān)，之后四指馬鲅幼魚適應(yīng)了淡水環(huán)境，黑色素巨噬細(xì)胞的顏色逐漸恢復(fù)至脅迫前水平。

3.4 急性淡水脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟位于魚腹腔前部，由許多角形肝細(xì)胞所形成的肝小葉集合而成，肝小葉中央靜脈分布不整齊，肝細(xì)胞往往不規(guī)則地排列在中央靜脈周圍。肝細(xì)胞的大小隨脂肪和糖原的貯藏量而變。在對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的急性氨氮脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，隨脅迫時(shí)間延長，肝細(xì)胞空泡逐漸增大，細(xì)胞核形狀異常，內(nèi)容物大量外泄［39］。本試驗(yàn)結(jié)果與其相類似，隨著淡水脅迫時(shí)間的延長，細(xì)胞空泡逐漸增大，72 h 時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于在鹽度脅迫下，肝糖原被大量消耗以調(diào)節(jié)滲透壓，也有可能是因?yàn)槊{迫導(dǎo)致肝糖原代謝和合成平衡被打亂。劉恩光等［40］研究表明，急性熱脅迫下的白梭吻鱸（Sander lucioperca）肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化，主要原因是高溫脅迫增加了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，降低了細(xì)胞抗氧化能力。陳世喜等［41］也觀察到，隨著急性低氧脅迫時(shí)間延長，卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）肝組織空泡體積變大（肝糖原分解所致）；肝血竇間隙先逐漸擴(kuò)大，24 h 時(shí)達(dá)到頂峰，后逐漸縮?。幻{迫前24 h，由于魚體調(diào)節(jié)滲透壓，耗氧量增大，血竇間隙隨之增大；脅迫24～48 h 后，魚體適應(yīng)了淡水環(huán)境，耗氧量減小，血竇間隙隨之減小。這與本研究四指馬鲅幼魚在急性淡水脅迫下肝臟組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)速度類似［42］。當(dāng)時(shí)脅迫12 h 后，四指馬鲅幼魚血管形狀開始變得不規(guī)則，說明滲透壓的變化導(dǎo)致肝臟收縮，進(jìn)而導(dǎo)致血管收縮。也有可能是因脅迫時(shí)魚體快速游動、撞擊導(dǎo)致的機(jī)械損傷。細(xì)胞核形態(tài)在淡水脅迫24 h 內(nèi)較為正常，淡水脅迫48～72 h 卻出現(xiàn)了內(nèi)容物流出的現(xiàn)象，說明魚體會在淡水脅迫24 h 后大致適應(yīng)急性淡水脅迫，但脅迫并非完全不會對肝臟造成損傷，脅迫對細(xì)胞核的影響較大。區(qū)又君等［27］在急性低溫脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響研究中也發(fā)現(xiàn)，長期暴露在低溫環(huán)境下，魚的肝臟逐漸失去自我調(diào)節(jié)能力，部分肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷直至細(xì)胞核萎縮或消失。

4 結(jié)論

本研究對急性淡水脅迫下四指馬鲅幼魚的鰓、心臟、脾臟和肝臟組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線粒體豐富細(xì)胞隨著脅迫時(shí)間延長而逐漸增加，部分肝細(xì)胞核逐漸萎縮甚至消失。四指馬鲅幼魚的鰓小片，心肌細(xì)胞，脾臟紅髓、白髓、邊緣區(qū)、黑色素巨噬細(xì)胞，肝板和肝血竇等大部分結(jié)構(gòu)在淡水脅迫24 h 內(nèi)有一定的應(yīng)激反應(yīng)，如鰓小片長度出現(xiàn)逐漸增長的趨勢，寬度先縮小后又逐漸增大，鰓小片間距先增大后有回落；隨著脅迫時(shí)間的延長，這些應(yīng)激反應(yīng)又逐漸恢復(fù)至脅迫前水平，表明四指馬鲅幼魚對短時(shí)間的急性淡水脅迫有一定的適應(yīng)能力。