范文強 郭占非 張超 邊彩月 高曉 許振丹

［摘要］ 目的 探討雷公藤甲素（TP）對類風濕關節(jié)炎（RA）破骨細胞（OC）分化的影響及其機制。

方法 選取2019年9月—2020年8月到我院進行治療的RA病人20例，分離RA病人外周血單個核細胞（PBMC），通過核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（M－CSF）誘導培養(yǎng)為OC，分別用不同濃度的TP（濃度為10、20、40 nmol/L）干預OC，記為TP各劑量組，未經過TP干預的OC作為對照組。使用細胞計數試劑盒（CCK－8）法測定細胞增殖，流式細胞術測定細胞凋亡，ELISA法檢測相關炎癥因子表達，實時熒光定量PCR（qRT－PCR）測定標志性基因和分化相關轉錄因子表達，蛋白質印跡（Western blot）測定p－IκB蛋白以及分化相關轉錄因子蛋白表達。

結果 與對照組比較，TP各組RA－OC存活率及炎癥因子表達呈劑量效應關系降低（F=95.702～185.246，P<0.01），RA－OC凋亡率升高（F=306.798，P<0.01）；而Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達下調（F=141.455～266.411，P<0.01），NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達均降低，p－IκB蛋白表達也相應降低（F=130.683～351.640，P<0.01）。

結論 TP可能通過抑制NF－κB信號通路減輕RA病人OC分化，并抑制細胞增殖和炎癥反應，以及誘導OC凋亡。

［關鍵詞］ 關節(jié)炎，類風濕；雷公藤甲素；破骨細胞；細胞分化；NF－κB；信號通路

［中圖分類號］ R593.22;R284

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0232－05

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種病因未明的慢性、以滑膜炎為主要表現的系統性疾病，其特征是手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥反應。破骨細胞（OC）是骨吸收的主要功能細胞，在骨發(fā)育、生長、修復、重建中具有重要的作用，它起源于血系單核－巨噬細胞系統，是一種特殊的終末分化細胞，它可由其單核前體細胞通過多種方式融合形成巨大的多核細胞。有研究表明，RA病人OC增殖活性增加，OC還能介導骨破壞，是RA關節(jié)破壞的主要原因。雷公藤甲素（TP）是雷公藤的主要活性成分之一，它具有抗氧化、抗老年性癡呆癥、抗癌等功效。TP還能減緩RA大鼠關節(jié)損傷。但是關于TP對類風濕關節(jié)炎－破骨細胞（RA－OC）的影響及其機制還不清楚，本實驗主要研究TP對RA－OC分化的影響及其潛在的調控通路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人體外周血標本 2019年9月—2020年8月，選取到我院進行治療的RA病人20例，其中男10例，女10例，平均年齡（55.64±8.31）歲。采集外周靜脈血8 mL。 病人到我院之前均未接受過治療（病情無活動）。RA診斷均符合2010年的ACR/EULAR分類標準，排除了患有嚴重心血管疾病、肝腎功能障礙、惡性腫瘤及系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等其他免疫疾病的病人。本研究已經獲得本院倫理委員會批準（批號：2020－142），所有病人均知情同意。

1.1.2 試劑和藥物 DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國BD公司；核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（M－CSF）購自美國Pepro Tech公司；CCK－8試劑盒購自日本Dojindo公司；膜聯蛋白V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）和碘化丙啶（PI）試劑盒均購自美國Bio－Rad公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量（qRT－PCR）試劑盒購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、PVDF膜購自瑞士Roche公司。TP購自美國Sigma公司（批號：MKBQ7748V）。

1.2 研究方法

1.2.1 TP試劑的配制 取TP藥物1 mg溶解于277.8 μL的DMSO溶液中，配制成10 mmol/L溶液，取其中1 μL配制成10 μmol/L溶液。最終將TP稀釋成10、20、40 nmol/L的溶液。

1.2.2 RA－OC培養(yǎng) 采用密度梯度離心法分離RA病人外周血單個核細胞（PBMC），將PBMC接種于培養(yǎng)皿中，密度為2×106 /cm2，孵育3 h。用胰蛋白酶將消化后的貼壁細胞接種于24孔板中，密度為2×105/cm2。用含體積分數0.10胎牛血清及RANKL（100 μg/L）、M－CSF（50 μg/L）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PBMC，每2～3 d換液1次，最終形成RA－OC。采用細胞形態(tài)學觀察、TRAP染色及骨吸收試驗對RA－OC進行鑒定。

1.2.3 實驗分組 將RA－OC接種于96孔培養(yǎng)板中，分為對照組（A組）和3個不同濃度TP干預組（B組、C組、D組），每組3例。A組加入相應濃度的DMSO，TP濃度為0 nmol/L；B組、C組、D組分別用不同濃度TP（10、20、40 nmol/L）干預。每組做3個復孔，每個實驗重復3次。

1.2.4 CCK8法測定RA－OC存活率 RA－OC細胞以1×107/L密度接種至96孔板，細胞培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK－8試劑，孵育2 h，終止培養(yǎng)，在490 nm波長下檢測細胞吸光度（A）值。細胞存活率（%）=待測樣品A490/對照A490×100%。

1.2.5 流式細胞術測定RA－OC凋亡率 RA－OC細胞用預冷的PBS洗滌，重懸于結合緩沖液中，調整密度為1×109/L。取100 μL細胞懸液添加到5 mL的流式管中，分別加入5 μL的Annexin V/FITC和PI，孵育15 min，取400 μL的1×結合緩沖液添加到試管中，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法檢測腫瘤壞死因子α（TNF－α）和白細胞介素6（IL－6）表達 RA－OC離心后收集細胞上清液，然后按照TNF－α試劑盒和IL－6試劑盒說明書操作步驟檢測其表達水平。

1.2.7 qPT－PCR方法測定RA－OC中Trap、Ctsk、CTR、MMP－9、NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA表達? 用Trizol提取各組RA－OC總RNA，再將其合成cDNA，最后，按照qRT－PCR試劑盒要求進行擴增反應。以GAPDH為內參照，使用2－△△Ct法計算相對表達量。循環(huán)條件：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40個循環(huán)。所用引物名稱及其序列見表1。

1.2.8 Western blot測定p－IκB蛋白及分化相關轉錄因子蛋白表達 用RIPA裂解液裂解RA－OC并提取細胞中的總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。SDS－PAGE試劑盒分離細胞蛋白，并轉移到PVDF膜上。以質量濃度50 g/L脫脂牛奶封閉膜后，在4 ℃條件下與適當的一抗孵育過夜。然后，用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育膜，滴加ECL化學顯色、定影。以β－actin為內參照，利用增強型化學發(fā)光檢測試劑盒檢測目的蛋白灰度值。

1.3 統計學分析

利用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料以±s形式表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK－q檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP對RA－OC增殖影響

與A組比較，B組、C組和D組RA－OC的存活率顯著降低（F=159.408，P<0.01），并呈濃度依賴性。見表2。

2.2 TP對RA－OC凋亡影響

與A組比較，B組、C組和D組 RA－OC的凋亡率顯著升高（F=306.798，P<0.001），并呈濃度依賴性。見表2和圖1。

2.3 TP對RA－OC炎癥反應相關指標影響

與A組相比較，B組、C組和D組 RA－OC的TNF－α和IL－6表達水平顯著降低（F=185.246、95.702， P<0.01），且呈濃度依賴性。見表3。

A：對照組（TP為0 nmol/L）；B：10 nmol/L的TP干預組；C：20 nmol/L的TP干預組；D：40 nmol/L的TP干預組。

與A組細胞比較，B組、C組和D組RA－OC的Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達明顯降低（F=141.455～266.411，P<0.01），并呈濃度依賴性。見表4。

2.5 TP對RA－OC中分化相關轉錄因子表達影響

與A組細胞比較，B組、C組和D組RA－OC的NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達明顯降低（F=173.559～351.640，P<0.01），呈濃度依賴性。見表5和圖2。

2.6 TP對NF－κB信號通路相關蛋白p－IκB表達影響結果表明，A組、B組、C組與D組RA－OC的p－IκB蛋白的相對表達量分別為0.95±0.09、0.76±0.07、0.53±0.05和0.40±0.03。與A組相比較，B組、C組和D組RA－OC的p－IκB蛋白表達明顯降低（F=130.683，P<0.01），且呈濃度依賴性。見圖3。

3 討論

RA是一種嚴重的慢性自身免疫性炎癥性疾病，關節(jié)炎的病理改變主要有滑膜襯里細胞增生、間質內大量炎性細胞浸潤，以及微血管新生及軟骨和骨組織破壞等。OC的形成、分化及活化會加重RA對骨破壞的程度，如果出現OC將會出現骨破壞的病變。

雷公藤，又名黃藤，首次記載于《神農本草經》，具有祛風通絡、消腫止痛、清熱解毒等功效，對炎癥和自身性免疫疾病具有顯著療效。RA在中醫(yī)學中屬于“痹癥”范疇，在《滇南本草》中已經有雷公藤治療RA的記載，TP可有效抑制RA發(fā)病過程中促炎因子的異常升高及炎癥遞質的上調。研究結果顯示，TP能改善RA大鼠關節(jié)腫脹，并減輕大鼠關節(jié)組織的炎癥反應。TP還能抑制RA炎癥反應和骨破壞。本實驗研究結果表明，TP處理RA－OC后，細胞存活率及炎癥因子TNF－α、IL－6表達水平降低，細胞凋亡率增加，提示TP可明顯抑制RA－OC增殖和炎癥反應，并促進其凋亡。

OC是體內唯一具有骨吸收功能的細胞，若其功能改變可導致骨質吸收異常。已經有研究結果發(fā)現，TP不僅對單獨培養(yǎng)的OC分化及骨吸收功能具有抑制作用，并且對Tregs－OC共培養(yǎng)體系中OC的分化及骨吸收功能也有明顯的抑制作用。標志性因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、組織蛋白酶K（Ctsk）、CTR、MMP－9等是一系列與OC吸收有關的酶。TRAP參與了OC介導的骨轉換過程，而Ctsk可以影響OC中TRAP的運輸。MMP－9是降解OC外基質、參與骨重建的重要蛋白酶，在增強OC的骨吸收中起重要作用。已經有研究表明，高遷移率族蛋白1誘導的OC中TRAP活性顯著升高，而TP可以降低其活性。本實驗研究結果也顯示，TP處理RA－OC后可以降低Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達?；罨疶細胞核因子（NFATc1）在OC中發(fā)揮著重要的轉錄調節(jié)作用，c－Fos和c－Jun與NFATc1結合可組成一個轉錄調節(jié)復合體。本實驗研究顯示，TP可顯著降低RA－OC的NFATc1、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達，提示TP可抑制RA－OC分化。

NF－κB具有介導免疫應答的生理功能，炎癥反應的發(fā)生與NF－κB信號通路激活有關，NF－κB在炎性因子的誘導等多種細胞生物學過程中發(fā)揮重要功能。NF－κB信號通路參與了機體RA的調節(jié)機制，藥物干預可以抑制該通路的活性，從而達到治愈疾病的目的。有研究表明，TP能通過NF－κB信號通路抑制血管內皮細胞的炎性損傷。NF－κB信號通路激活能抑制RA－OC分化及骨吸收。本實驗研究結果顯示，TP可降低RA－OC中p－IκB蛋白表達，提示TP可能通過NF－κB信號通路影響RA的發(fā)展。

綜上所述，TP通過抑制NF－κB信號通路減輕RA－OC分化，抑制細胞增殖和炎癥反應，并誘導細胞凋亡，這為治療RA提供了理論基礎。但是，本研究也存在一些局限性，比如沒有采用NF－κB的激動劑進行TP作用的復驗證，沒有建立小鼠模型進行體內實驗驗證。今后，我們將進行這些研究進一步驗證本文的結論。

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（本文編輯 于國藝）