白彪慧，黃江，郭頌，金鑫，邵百卉，劉宇，張澤財，周玉龍，朱戰(zhàn)波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，呈直桿狀，兩端鈍圓，有的近似球。大腸桿菌一般不產(chǎn)生芽孢，是一種營養(yǎng)要求不高、有活動性和兼性厭氧細菌，直徑為0.5 μm，長度為1.0～3.0 μm，屬于腸桿菌科。大腸桿菌很容易在HiCrome ECC 營養(yǎng)瓊脂中生長，在半乳糖苷酶裂解作用下產(chǎn)生玫瑰粉色菌落。曙紅亞甲藍培養(yǎng)基適用于分離產(chǎn)生獨特菌落的大腸桿菌，該菌落具有特征性的綠色金屬光澤，可將其與任何其他腸桿菌區(qū)分開來。大腸桿菌是氧化酶陰性的桿菌，發(fā)酵乳糖、葡萄糖和蔗糖等。它在37 ℃的溫度和PH 6.0～7.0 的條件下生長，而一些引起腹瀉的大腸桿菌菌株可以耐受pH 2.0 環(huán)境。uidA 編碼β-d-葡萄糖醛酸酶，這可能是大腸菌群的一個重要特征，因此它通常用于大腸桿菌的特異性鑒定。

大腸桿菌廣泛存在人和動物體內(nèi)，一般大腸桿菌并不會致病，但是如果受到外界某種因素的影響腸道菌群的平衡被打破，大腸桿菌就會大量繁殖導(dǎo)致患病[1]。目前國內(nèi)對大腸桿菌病的研究主要集中在禽源及豬源上，并且對該病源的防治產(chǎn)生了一定的指導(dǎo)意義。但是，近幾年，國內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的集約化和散養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)的快速擴張，養(yǎng)殖規(guī)模已相當龐大，使得動物將更多的接觸病原體和應(yīng)激，增加了大腸桿菌病的發(fā)病率。多種動物對致病性大腸桿菌均易感，且以急性敗血癥較為常見，發(fā)病后死亡率高[2]。羊大腸桿菌病主要是致病性大腸桿菌感染所引起的一種急性烈性傳染疾病，通常表現(xiàn)為腸炎型和敗血型，也可繼腦膜炎、發(fā)肺炎、腎盂腎炎及關(guān)節(jié)炎等炎性疾病。腸炎型臨床上表現(xiàn)為濕熱下痢、劇烈腹瀉等，隨后病羊迅速消瘦、脫水或貧血，發(fā)病之后若不能得到有效的防治措施，很容易因為衰竭而死[3]。而羊群體內(nèi)大腸桿菌對人類感染具有重要意義，因為它們的肉類及肉制品可以通過在整個制備過程中或作為消費者攝入的方式傳播感染疾病。動物糞便中大腸桿菌的存在使其在屠宰過程中通過腸道內(nèi)容物對肉類和奶類污染，從而進入食物鏈。動物與人類的直接和間接接觸，人與人之間的接觸在感染傳播中起著關(guān)鍵作用。目前，主要以使用抗生素來治療和預(yù)防大腸桿菌病，但抗生素的濫用導(dǎo)致了嚴重的耐藥性問題，療效不佳，同時還有嚴重的藥物殘留問題，不僅無法有效控制大腸桿菌病，甚至可能出現(xiàn)超級細菌，嚴重影響了大腸桿菌的防治效果[4-5]。

2021 年10 月，大慶地區(qū)某羊場存欄1 000 頭肉羊，集中舍飼為主，且與外界無接觸。舍內(nèi)通風較差，采用羊草作為墊料，平時不更換，空氣中有肉眼可見的灰塵顆粒。發(fā)病當天死亡8 只，后續(xù)陸續(xù)出現(xiàn)死亡，直至數(shù)日死亡數(shù)量達到104 只，死亡的羊中，有成年羊也有羔羊。春季羊群接種過口蹄疫，小反芻獸疫、梭菌病等疫苗，并且進行了驅(qū)蟲。對患病羊，使用抗生素進行注射治療，但治療效果不明顯?；疾⊙虮憩F(xiàn)出采食量下降、反芻次數(shù)減少、眼結(jié)膜潮紅、流鼻汁、呼吸困難，少數(shù)患病羊排帶血的糞便。解剖可見患病羊病死羊的肺臟顯著充血，腫大，肺臟切面有明顯的炎性物質(zhì)；心肌有出血點；氣管，細支氣管內(nèi)有大量的粘液性物質(zhì)。腸擴張，內(nèi)部充滿大量的氣體，腸粘膜膜充血，出血，其他臟器器官沒有表現(xiàn)出顯的病變。為了確定其病因，開展了細菌的分離和鑒定，對大腸桿菌分離株進行了致病性、毒力基因和耐藥性分析，研究為大慶地區(qū)肉羊大腸桿菌病的防控提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

1.2 病料采集

病料來自2021 年黑龍江省大慶市某羊場，在超凈臺內(nèi)無菌采集死亡羊的肺臟、脾臟、肝臟、腸內(nèi)容物等組織。

1.3 試驗動物

選取6～8 周齡雌性的BALB/c 小鼠，其購自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部；在研究當中隨機的將所有的小鼠分為2 組，每組共5 只BALB/c 小鼠。

表1 主要試劑Table 1 Main reagents

1.4 細菌分離純化

無菌采取病料并接種到血平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱需氧培養(yǎng)和蠟缸厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后挑取單菌落進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。將培養(yǎng)好的菌在無菌操作臺上用接種環(huán)取菌后分別接種伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基鑒定。挑取典型的單菌落開始進行純化培養(yǎng)，放在37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，在分裝出菌液保存在-80 ℃冰箱冷藏備用。

1.5 細菌DNA 的提取

將鏡檢確認后的大腸桿菌菌液分裝到EP 管中，每管1 mL 菌液，放在高速冷凍離心機中設(shè)置為12 000 r·min-1，離心5 min，離心后取出EP 管后，用移液器將上清液吸走，小心不要吸取到沉淀物，棄掉含有上清液的槍頭。再用移液槍吸取300 μL 超純水，與沉淀反復(fù)的吹吸混勻，再次放到高速冷凍離心機中設(shè)置為12 000 r·min-1，離心5 min 反復(fù)此步驟3次。將EP 管插到浮漂上放到提前準備好的熱水鍋里水煮20 min。取出后再放進冷凍離心機里，設(shè)置為12 000 r·min-1，離心2 min 后取出上清液放到另一個離心管理，棄掉沉淀。置于-20 ℃的冰柜備用。

1.6 細菌16s rDNA PCR 鑒定

細菌的通用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，將提取出來的DNA 作為模板進行PCR 擴增，基因序列及擴增體系見表3、表4。

表3 PCR 引物Table 3 PCR Primers

表4 PCR 反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

表5 毒力基因引物Table 5 Primers for virulence genes

表6 耐藥基因引物Table 6 Primers for drug resistance genes

PCR 的程序條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)為30，72 ℃終延伸10 min。保存溫度為4℃。

1.7 動物致病性試驗

分離純化的菌液稀釋到1.0×109CFU·mL-1，將小鼠分為兩組，實驗組和對照組；每組各5 只。腹腔注射0.2 mL 菌液，分別于注射后4 h，16 和24 h 觀察小鼠，死亡后將其肝、脾等分別接種到營養(yǎng)瓊脂平板上進行涂片，鑒定。

1.8 藥敏試驗

挑取單個菌落，用無菌水1∶20 稀釋，吹吸混勻。取100 μL 菌液用玻璃棒均勻地涂在培養(yǎng)基上。挑選克拉霉素、氨芐西林等14 種藥物，無菌操作將藥敏片貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后取出。

1.9 部分毒力基因及耐藥基因檢測

根據(jù)Gen Bank 和參考文獻［6-15］進行設(shè)計引物，引物由上海生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為：25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，去離子水8.5 μL，模板2 μL。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

菌株經(jīng)革蘭染色鏡檢為革蘭陰性菌；在瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑的菌落，看起來像灰色的露珠，邊緣整齊。在麥康凱培養(yǎng)基上長出紅色中等大小的菌落，在伊紅美藍培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色金屬光澤的菌落。

2.2 細菌16s rDNA PCR 鑒定結(jié)果

PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖所示：在1 560 bp 處有明亮單一的條帶，與目的基因大小相符合，成功擴增出目的基因（圖1）。送上海生物工程有限公司測序的基因序列與Genbank 上的參考序列比對分析確定為大腸桿菌。

圖1 16S rDNA PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA

2.3 動物致病性試驗結(jié)果

接種羊大腸桿菌后的5 只小鼠在16 h 小鼠表現(xiàn)出精神不振，食欲減少，眼睛出現(xiàn)粘稠的分泌物，呼吸加快。24 h 后5 只小鼠全部死亡，對照組的5 小鼠沒有任何變化，將死亡小鼠進行剖檢，可見腸內(nèi)出現(xiàn)腫脹，有黃色液狀內(nèi)容物，肝臟和脾臟出現(xiàn)腫大和出血點。從肝臟、脾臟及腸內(nèi)容物中分離到了大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

培養(yǎng)取出平板，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。用卡尺量取抑菌圈的直徑，并判定試驗結(jié)果。結(jié)果表明該菌株對克拉霉素、氨芐西林、氧氟沙星、苯唑西林、氨曲南、鏈霉素、甲氧嘧啶、新霉素、紅霉素、氯霉素、大觀霉素、卡那霉素均不敏感，對呋喃妥因（15 mm）和多粘菌素（20 mm）敏感。

2.5 毒力基因PCR 檢測結(jié)果

10 種毒力因子共檢測出4 種毒力因子，分別為fimH（510 bp）、papC（710 bp）、ompA（919 bp）、mat（239 bp）。如圖2 所示與預(yù)期大小一致。

圖2 部分毒力基因PCR 擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of some virulence genes

2.6 耐藥基因PCR 檢測結(jié)果

8 種耐藥基因檢測出5 種，分別為aadA1（280 bp）、gyrA（810 bp）、parC（980 bp）、Sul2（435 bp）、floR（399 bp）。結(jié)果可見，與預(yù)期目的基因大小一致。如圖3 所示。

圖3 部分耐藥基因PCR 擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of some drug-resistance genes

3 討論

長期以來，大腸桿菌一直是家畜發(fā)病率和死亡率高的重要原因。它是胃腸道的常見菌，并且具有至少13 000 個（可能超過100 000 個）基因的廣泛基因組，其中包括許多毒力因子，這使得對疾病病因?qū)W的理解變得復(fù)雜。致病性大腸桿菌診斷需要與作為正常腸道菌群組成成分的非致病性菌株區(qū)分開來。此類致病型由一種或多種可定義的大腸桿菌毒力因子的存在來定義，并且可以通過先進的分子方法和某些常規(guī)方法進行鑒定。與傳統(tǒng)的表型方法相比，分子技術(shù)在細菌鑒定方面更加快速和精確。動物來源的大腸桿菌的致病性與多種毒力因子有關(guān)[16]，例如，粘附素在大腸埃希氏菌的發(fā)病機理中至關(guān)重要，因為細菌與宿主細胞的結(jié)合是建立感染的重要步驟；鐵的吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對細胞很重要因此，許多腸外致病性大腸桿菌菌株已經(jīng)獲得了多種鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，包括鐵載體，以調(diào)節(jié)宿主細胞對鐵的吸收，從而導(dǎo)致致病性[17]。細菌的表面結(jié)構(gòu)，例如脂多糖，包膜蛋白和外膜蛋白，可通過促進補體系統(tǒng)的作用來保護細菌[18]。為探究分離到的大腸桿菌是否具有較強的致病性，通過接種BABL/c 小鼠進行動物攻毒實驗，結(jié)果顯示接種分離到的大腸桿菌24 h 內(nèi)全部死亡，表明該菌株具有較強的致病性。應(yīng)用PCR 方法檢測分離株大腸桿菌的毒力基因，檢測出來的4 種毒力基因分別為Ⅰ型菌毛、外膜蛋白A、P 菌毛、黏附素相關(guān)基因。此菌株共檢測出3 種以上的毒力因子可以看出，結(jié)合小鼠感染試驗結(jié)果，表明該菌株為致病性大腸桿菌。顧曉曉[19]對新疆部分地區(qū)132 分菌株進行對25種毒力因子進行鑒定，其中crl、hlyE、iutA、fimH、ompA、ompF、ompC、papC檢出率相比之下比較高，分別是97.4%、94.69%、92.42%、91.67%、78.03%、78.03%、65.91%、57.58%，其余的都在44%以下，與實驗鑒定出來的毒力因子相符合，周磊等[20]豬源實驗得出ompA檢出率達到96.6%，說明致病性很強。

幾十年來，抗生素耐藥性一直被認為是一個全球性的健康問題。食用動物被認為是抗生素耐藥性細菌的關(guān)鍵宿主，因為在動物食品細菌中發(fā)現(xiàn)的某些抗生素抗性基因也已在人類中發(fā)現(xiàn)。許多研究發(fā)現(xiàn)從屠宰的反芻動物糞便中分離出的多重耐藥大腸桿菌菌株。目前針對大腸桿菌的控制策略主要依賴于反復(fù)的抗生素治療。然而，抗生素的廣泛使用，包括濫用和過度使用，幫助細菌自然進化并產(chǎn)生抗藥性。因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，長期不合理使用抗生素導(dǎo)致各個地區(qū)的大腸桿菌對許多的不同種類的抗生素具有高度的耐藥性。應(yīng)對大腸桿菌感染的最有效的方法是選擇敏感藥物治療，合理使用抗生素及疫苗免疫預(yù)防。試驗分離獲得的大腸桿菌對克拉霉素、氨芐西林、氧氟沙星等藥物不敏感，14 種受試藥物中僅有呋喃妥因和多粘菌素為敏感藥物，表明該羊場分離的大腸桿菌已出現(xiàn)較為嚴重的耐藥現(xiàn)象。同時分離菌株檢測出5 種耐藥基因，可以看出，菌株對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類藥物均已產(chǎn)生了耐藥性。岳山[21]對黑龍江地區(qū)牛源大腸桿菌71 分菌株進行對15 種耐藥因子進行鑒定，其中β-內(nèi)酰胺類（blaTEM98.6%）、氨基糖苷類（aadA188.7%）、氯霉素類（floR73.2%、tetA97.2%）、四環(huán)素類（tetB85.9%）、喹諾酮類（GyrB98.6%、parC97.2%、GyrA98.6%）、磺胺類（sul284.5%）幾種檢出率最高，說明不同動物源大腸桿菌由于頻繁使用這幾種藥物產(chǎn)生了很高的耐藥性。顧曉曉[19]新疆地區(qū)實驗中也表明出對喹諾酮類藥物的耐藥性同樣很高。

此病的發(fā)生和飼養(yǎng)管理因素有直接關(guān)系，該場墊料常年不更換，空氣中有肉眼可見的灰塵顆粒，反復(fù)刺激呼吸道，以及天氣變化的影響，可能是引起羊群肺炎及大腸桿菌病發(fā)生的重要因素。為減少此類病的發(fā)生，首先，要加強羊群的飼養(yǎng)管理，及時清掃羊舍并定期消毒，確保羊舍通風良好，適當降低畜群飼養(yǎng)密度，羊群禁止飼喂發(fā)生霉敗的飼料；在飼喂青綠飼料時，要供給足夠的營養(yǎng)，同時添加適量的碘鹽、維生素A、維生素D，提高羊群機體免疫力。其次，滅活疫苗是預(yù)防大腸桿菌性疾病的主要方法。制備類毒素疫苗，也可用多價大腸桿菌苗對種羊進行接種。最后，雖然大腸桿菌所引起的疾病發(fā)病急，死亡快，但發(fā)病初期尚未能大量產(chǎn)生毒素階段，采用敏感藥物治療，可取得一定療效。研究表明該羊場的病因是致病性大腸桿菌，藥敏結(jié)果為對多粘菌素高度敏感，呋喃妥因其次，但是這兩種藥物已經(jīng)被禁用，因此加強飼養(yǎng)管理、疫苗免疫是預(yù)防本病的主要措施。