吳廣畏 ，高華，王瑩，崔格，李姝漩，呂銳，李德海*

（1. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島266100）

天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物的重要資源，包括農(nóng)業(yè)上的新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑蕓苔素內(nèi)酯和赤霉素、農(nóng)用抗生素井岡霉素和阿維菌素等；畜牧業(yè)上真菌來源抗生素截短側(cè)耳素及其衍生物以及70%的人類抗感染藥物如棘白菌素等均來自天然產(chǎn)物。特別是因青蒿素、阿維菌素、辣椒素等“諾貝爾獎(jiǎng)”分子的貢獻(xiàn)，國內(nèi)外重燃對(duì)天然產(chǎn)物挖掘利用的興趣，說明天然產(chǎn)物及其衍生物在推動(dòng)人類社會(huì)發(fā)展中仍然扮演舉足輕重的角色且具有巨大潛力。

天然產(chǎn)物極大推動(dòng)了藥物發(fā)現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)50%以上的藥物分子與天然產(chǎn)物關(guān)聯(lián)密切，或提供藥效團(tuán)，或提供模板分子，或受此啟發(fā)獲得靈感。不容忽視的是天然產(chǎn)物直接成藥性逐漸下降。導(dǎo)向性應(yīng)用天然產(chǎn)物（中間體）已經(jīng)成為科研工作者以及制藥企業(yè)重要延伸方向，其中創(chuàng)制結(jié)構(gòu)多樣化是充分發(fā)揮天然產(chǎn)物潛力的重要組成，也是獲得藥物實(shí)體先導(dǎo)的基礎(chǔ)。圍繞天然產(chǎn)物（中間體）結(jié)構(gòu)多樣化的策略多有報(bào)道，包括結(jié)構(gòu)多樣性導(dǎo)向的合成（diversity-oriented synthesis，DOS）[1]、復(fù)雜性到多樣性（complexity to diversity，CtD）[2]、生物功能導(dǎo)向的合成（biology-oriented synthesis，BIOS）[3]、功能導(dǎo)向的合成（function-oriented synthesis，F(xiàn)OS）以及最近中科院昆明植物所普諾·白瑪?shù)ぴ鰣F(tuán)隊(duì)提出的藥效團(tuán)導(dǎo)向的半合成（pharmacophore-oriented semisynthesis，POSS）等策略[4]，這些方法從不同角度對(duì)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了化學(xué)演化，發(fā)現(xiàn)包括抗新型冠狀病毒感染的分子等在內(nèi)的多個(gè)先導(dǎo)化合物。

近年Herbert Waldmann 提出了“擬天然產(chǎn)物”（pseudo-natural product，PNP）化學(xué)進(jìn)化策略（見圖1），其核心是利用不同天然產(chǎn)物中存在的片段（fragments）進(jìn)行組合獲得PNP 的結(jié)構(gòu)[5-7]。這些結(jié)構(gòu)可通過化學(xué)合成、非酶催化或酶催化獲得，為創(chuàng)制新藥提供了尚未探索的分子寶藏。更為重要的是PNP 化學(xué)空間與美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的小分子藥物化學(xué)空間重疊性高，可能具有更好的成藥基礎(chǔ)，因此近年來得到了較為廣泛的關(guān)注。PNP 的設(shè)計(jì)原則主要包括[8]：1）盡可能形成新的手性中心。手性是許多藥物發(fā)揮活性的重要基礎(chǔ)，天然片段之間通過復(fù)雜的組合形成新的三維骨架，包括新手性形成等。2）盡可能有雜原子參與。氮原子、氧原子等雜原子在天然產(chǎn)物和藥物分子中的占比非常重要，雜原子的參與有利于獲得成藥性。3）具有不同生物功能的天然產(chǎn)物片段之間的組合有助于獲得新活性的PNP 骨架。4）生物合成上迥異的片段之間組合有助于發(fā)現(xiàn)新穎活性（片段不具有的）。原因在于這些片段通過不同的酶合成，具有不同的結(jié)構(gòu)特征，有利于與不同的蛋白結(jié)合，從而能發(fā)揮新穎生物功能。本文將從化學(xué)合成驅(qū)動(dòng)、非酶催化驅(qū)動(dòng)、酶催化驅(qū)動(dòng)等方法組合天然產(chǎn)物片段，形成PNP 的視角概述其發(fā)展進(jìn)程。

1 化學(xué)合成驅(qū)動(dòng)的擬天然產(chǎn)物

目前化學(xué)合成驅(qū)動(dòng)是制備PNP 的主要方法。Herbert Waldmann 在該領(lǐng)域建樹頗豐。PNP 既可通過從頭組合（de novocombination）合成，也可直接通過天然片段組合偶聯(lián)獲得。從頭組合涉及單個(gè)或多個(gè)天然產(chǎn)物片段的化學(xué)構(gòu)建，最終獲得預(yù)設(shè)的PNP 結(jié)構(gòu)。直接組合方法中天然片段不需要構(gòu)建，直接通過化學(xué)反應(yīng)將片段組合成預(yù)設(shè)的PNP。除了純天然片段或天然產(chǎn)物中含有的片段，從合成產(chǎn)物（藥物）提取的片段與天然產(chǎn)物片段化學(xué)偶聯(lián)生成PNP 的策略有力地?cái)U(kuò)充了PNP 化學(xué)進(jìn)化策略適用范圍，從而獲取成藥性更高的PNP 類群[9]。

2019 年，Herbert Waldmann 課題組[9]首次闡述PNP 進(jìn)化策略，并進(jìn)行了初步驗(yàn)證。色烷（chromane）和苯并吡喃（chromene）片段存在于許多天然產(chǎn)物中，并賦予了這些天然產(chǎn)物多樣的生物活性，如結(jié)構(gòu)中有色烷片段的兒茶酸和bitucarpin A 分別具有抗腫瘤和抗細(xì)菌活性。同時(shí)，天然片段四氫嘧啶酮（tetrahydropyrimidinone，THPM）是許多抗生素的母核，如抗生素TAN-1057A/B 等。Herbert Waldmann 課題組基于從頭化學(xué)合成法獲得了45 個(gè)由色烷（苯并吡喃）片段和四氫嘧啶酮片段偶聯(lián)的chromopynones 化合物（見圖2 和3），其代表了一類新的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)類群從生物合成角度很難獲得。這些產(chǎn)物所覆蓋的化學(xué)空間有別于天然產(chǎn)物以及其他合成策略所獲得的產(chǎn)物，接近已批準(zhǔn)的上市藥物，且主要參數(shù)符合里賓斯基五規(guī)則（Lipinski’s“Rule of Five”，Lipinski-Ro5）。

圖2 Chromopynones 擬天然產(chǎn)物的設(shè)計(jì)[9]Figure 2 Design of chromopynone pseudo-natural products[9]

圖3 擬天然產(chǎn)物chromopynones 的合成路線和代表性產(chǎn)物[9]Figure 3 Synthetic route and representative products of chromopynone pseudo-natural products[9]

Schneidewind 等[10]利用吲哚和托品烷（tropane）為起始片段從頭組合，通過非對(duì)映選擇性1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)合成了吲哚托品烷（indotropanes）PNP，其中化合物myokinasib 為尚未報(bào)道過的新化學(xué)類型（見圖4）。它可以損害細(xì)胞質(zhì)分裂、誘導(dǎo)多核細(xì)胞的形成以及選擇性抑制肌球蛋白輕鏈激酶1（myosin light chain kinase1，MLCK1）的活性，從而降低應(yīng)力纖維上磷酸化肌球蛋白Ⅱ輕鏈的豐度，有望成為用于研究MLCK1 介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)程的獨(dú)特分子工具[10]。

圖4 吲哚托品烷的設(shè)計(jì)原理和合成[10]Figure 4 Design principle and synthesis of indotropanes[10]

吲哚和嗎吩烷生物堿是重要活性片段來源。Herbert Waldmann 課題組[11]設(shè)計(jì)、合成了由吲哚和嗎吩烷生物堿組合的indomorphan 類PNPs（見圖5A），與常規(guī)合成方法獲得的產(chǎn)物相比，indomorphans PNPs具有更高度的三維立體特征，進(jìn)一步地利用Lipinski-Ro5 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，61%的indomorphans PNPs 位于類藥（drug-like）區(qū)域，提示這些PNPs 是藥物發(fā)現(xiàn)的理想合集。同時(shí)，生物活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)這些PNPs 是一類結(jié)構(gòu)新穎的糖攝入抑制劑（活性達(dá)納摩爾級(jí)），且僅當(dāng)吲哚和嗎吩烷生物堿偶聯(lián)之后才會(huì)發(fā)揮強(qiáng)效的抑制活性，單個(gè)片段并未表現(xiàn)出顯著的生物活性（見圖5B）。其中化合物(±)-glupin 拆分后的單體活性存在顯著差異，(+)-glupin 活性更佳。(+)-Glupin可選擇性靶向抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和3（GLUT3）活性，從而強(qiáng)效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]（見圖5B）。

圖5 Indomorphans 擬天然產(chǎn)物中天然產(chǎn)物片段的來源以及該類擬天然產(chǎn)物的設(shè)計(jì)和代表性結(jié)構(gòu)[11]Figure 5 Source of natural product fragments of indomorphans pseudo-natural products & design and representative structures of such pseudo-natural products[11]

很多天然活性生物堿中含有四氫喹啉（tetrahydroquinoline）和四氫吡咯（pyrrolidine）等含氮片段，如可卡因（cocaine），communesin B和virantmycin。Liu 等[12]基于這兩大類天然片段，設(shè)計(jì)了8 種連接方式（見圖6），共合成了155 個(gè)結(jié)構(gòu)豐富多樣的吡咯喹啉（pyrroquinoline，PQ）PNPs。除了連接方式多樣外，立體化學(xué)重排、不同的飽和度等化學(xué)因素豐富了結(jié)構(gòu)多樣性。在合成這類結(jié)構(gòu)中，作者還發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)氧化環(huán)加成形成喹啉鹽（quinolinium salts）的新方法。研究顯示，四氫喹啉和四氫吡咯片段形成的不同結(jié)構(gòu)骨架類型具有不同的生物活性。

圖6 吡咯喹啉擬天然產(chǎn)物的設(shè)計(jì)[12]Figure 6 Design of pyrroquinoline pseudo-natural products[12]

苯二氮?（benzodiazepine）和異吲哚啉酮（isoindolinone）結(jié)構(gòu)單元存在于許多藥物分子和天然產(chǎn)物中，不僅是重要的活性母核，而且二者參與多樣的天然產(chǎn)物形成，如安曲霉素（anthramycin），sclerotigenin，pestalachloride A，lennoxamine 等（見圖7A）。由于這2 個(gè)片段富含雜原子，獲得的新結(jié)構(gòu)可能具有很好的生物活性，如合成的苯二氮?-異吲哚啉酮類PNP MMV000917 可以干擾瘧疾寄生蟲的離子平衡。Yuan 等[13]利用可回收的介孔二氧化硅納米粒子（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）催化從頭合成了21 個(gè)四環(huán)的苯二氮?-異吲哚啉酮類PNPs（見圖7B），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSNs 能夠催化多組分反應(yīng)，收率在55% ～ 91%，其中部分化合物達(dá)到了克級(jí)制備，且反應(yīng)過程中無需金屬，故能耗低，節(jié)能環(huán)保，與此同時(shí)MSNs 也可以回收再利用。

圖7 苯二氮?-異吲哚啉酮類擬天然產(chǎn)物中天然產(chǎn)物片段的來源以及該類擬天然產(chǎn)物的設(shè)計(jì)和代表性結(jié)構(gòu)[13]Figure 7 Source of natural product fragments of benzodizepine-fused isoindolinone pseudo-natural products& design and representative structure of such pseudo-natural products[13]

Brosowsky 等[14]以天然產(chǎn)物thailandepsin B 為母核并引入不同的活性彈頭，設(shè)計(jì)合成出一系列thailandepsin B PNPs。其中一些產(chǎn)物表現(xiàn)出強(qiáng)效、選擇性的組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制活性。

Burhop 等[15]提出天然產(chǎn)物片段可以通過非生物合成過程中的轉(zhuǎn)化組合形成新穎的PNP。皮克特-施彭格勒（Pictet-Spengler，PS）反應(yīng)在多環(huán)生物堿合成中是重要的轉(zhuǎn)化步驟。類似的oxa-PS 反應(yīng)被使用在復(fù)雜吲哚生物堿合成過程中。作者創(chuàng)新性地使用isomeric-oxa-Pictet-Spengler (iso-oxa-PS)反應(yīng)，將2-羥乙基吲哚（2-hydroxyethyl indoles）和來源于灰黃霉素（griseofulvin）等天然產(chǎn)物中含有羰基的片段產(chǎn)物組裝起來，得到indofulvins PNP 庫（見圖8）。化學(xué)信息學(xué)分析表明，indofulvins 結(jié)合了已上市藥物、類藥和天然產(chǎn)物的優(yōu)良特性。生物活性評(píng)價(jià)顯示，indofulvins 能夠調(diào)控線粒體功能而抑制自噬現(xiàn)象，提示indofulvins 是一類尚未報(bào)道過的、具有新化學(xué)類型的自噬抑制劑。

圖8 吲哚衍生片段與含有羰基的天然產(chǎn)物片段融合的擬天然產(chǎn)物[15]Figure 8 Pseudo-natural products combining both indole-containing fragments and carbonyl groupscontaining natural product fragments[15]

Davies 等[16]利用吲哚和四氫吡啶片段以單鍵的形式偶聯(lián)，產(chǎn)生了一類自然界中不存在的apoxidoles PNPs（見圖9）。生物活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)apoxidoles 是一類新的吲哚胺2，3-雙加氧酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1） Ⅳ型抑制劑， 該類抑制劑是目前的研究熱點(diǎn)。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，apoxidoles 能選擇性靶向載脂蛋白-IDO1，阻止血紅素結(jié)合，引起獨(dú)特的氨基酸定位。

圖9 Apoxidoles 擬天然產(chǎn)物的設(shè)計(jì)[16]Figure 9 Design of pseudo-natural product apoxidoles[16]

天然產(chǎn)物二聚化能夠有效地?cái)U(kuò)展化學(xué)空間，且很多研究發(fā)現(xiàn)二聚化產(chǎn)物活性比單體活性更強(qiáng)，因此天然產(chǎn)物的聚合是化學(xué)進(jìn)化的重要手段。Niggemeyer 等[17]利用天然產(chǎn)物金雞納生物堿，先通過反應(yīng)將其奎寧環(huán)上的雙鍵轉(zhuǎn)化為醛，后通過高效、立體選擇性一鍋法合成對(duì)稱和非對(duì)稱的含有20元環(huán)金雞納生物堿片段的擬天然生物堿二聚體（見圖10）。這些合成的20 元環(huán)二聚化產(chǎn)物包括18 個(gè)手性中心和1 個(gè)額外的天然產(chǎn)物片段。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的官能化后，衍生獲得了163 個(gè)大環(huán)PNPs。其中化合物tantalosin-I 顯著誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）蛋白的脂化過程，該化合物用于研究LC3 輔助的過程非常有價(jià)值。

圖10 金雞納生物堿衍生片段和吡咯烷片段組成的大環(huán)擬天然產(chǎn)物的合成[17]Figure 10 Synthesis of macrocyclic pseudo-natural products composed of cinchona alkaloid-derived fragments and pyrrolidine fragments[17]

Herbert Waldmann 課題組[18]對(duì)灰黃霉素（griseofulvin）和苯并二氫吡喃酮（chromanone）中的片段進(jìn)行組合偶聯(lián)，獲得一系列擬天然聚酮化合物（見圖11）。生物活性以及化學(xué)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)化合物grismonone 具有最強(qiáng)的生物活性，其可以顯著抑制Hedgehog 信號(hào)通路，其作用靶標(biāo)為Smoothened（SMO）蛋白。Grismonone 代表了新的抑制SMO 化學(xué)類型，構(gòu)效研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的2 個(gè)片段并不能抑制Hedgehog 信號(hào)通路，提示片段融合產(chǎn)生了片段所不具備的新生物功能。

圖11 灰黃霉素-苯并二氫吡喃酮擬天然產(chǎn)物中天然產(chǎn)物片段的來源以及該類擬天然產(chǎn)物的骨架和代表性結(jié)構(gòu)[18]Figure 11 Source of natural product fragments of griseofulvin-chromanone pseudo-natural products &skeleton and representative structure of such pseudo-natural products[18]

Zhu 等[19]基于斷馬錢子苷（secologanin）通過一系列溫和的化學(xué)反應(yīng)，包括一步對(duì)映選擇轉(zhuǎn)化環(huán)外的C8 位、C8/C11 位、C8/C9/C10 位，以及化學(xué)酶法參與的環(huán)內(nèi)C2/C6 的親核修飾，合成了一系列PNPs。合成過程中涉及和利用了斷馬錢子苷中所有可能的反應(yīng)位點(diǎn)。活性篩選發(fā)現(xiàn)，合成所得的化合物vb 具有抗瘧疾活性，而化合物IIf 具有高效的神經(jīng)保護(hù)功能（見圖12）。

圖12 基于斷馬錢子苷的擬天然生物堿的多樣性合成[19]Figure 12 Diversity-oriented synthesis of seclolganin-based pseudo-natural alkaloids[19]

Alonso 等[20]在PNP 合成片段方面進(jìn)行了拓展。作者依次通過分子內(nèi)的烏吉（Ugi）反應(yīng)和皮克特-施彭格勒反應(yīng)，將合成藥物片段和天然甾體偶聯(lián)成多環(huán)的骨架產(chǎn)物（見圖13），產(chǎn)物分布在不同的化學(xué)空間。

圖13 整合天然和非天然片段合成立體化學(xué)豐富的多環(huán)擬天然產(chǎn)物[20]Figure 13 Synthesis of polycyclic pseudo-natural products with rich stereochemistry by combination of natural and unnatural fragments[20]

2 非酶催化驅(qū)動(dòng)的擬天然產(chǎn)物

隨著對(duì)天然產(chǎn)物生物合成的不斷深入認(rèn)識(shí)，越來越多的證據(jù)顯示許多復(fù)雜天然產(chǎn)物形成過程經(jīng)常涉及非酶催化反應(yīng)[21-22]。有趣的是，一些復(fù)雜天然產(chǎn)物是由若干天然片段經(jīng)非酶催化偶聯(lián)組合形成，這些產(chǎn)物及其非酶催化反應(yīng)利用生物信息學(xué)技術(shù)手段難以預(yù)測(cè)，因此挖掘并利用這些片段和非酶催化反應(yīng)具有潛在的藥源價(jià)值，也能揭示天然產(chǎn)物化學(xué)進(jìn)化的過程和生態(tài)功能，為PNP 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了寶貴資源。

例如，顧謙群、李德海課題組從1 株南極深海來源真菌Penicillium crustosumPRB-2 中分離到新骨架化合物penilactones A 和B，推測(cè)其可能是由clavatol 等天然片段經(jīng)非酶催化的邁克爾加成反應(yīng)偶聯(lián)生成[23]。德國馬爾堡大學(xué)Li Shuming 課題組驗(yàn)證penilactone A 是由3 個(gè)片段經(jīng)過非酶催化的1，4-邁克爾加成反應(yīng)（1，4-Michael addition）產(chǎn)生，其中clavatol 片段存在ortho-quinone methide（o-QM）等價(jià)物[24]。QMs 廣泛存在于自然界中，參與了許多天然活性物質(zhì)的生物合成，是重要的藥效基團(tuán)，也是設(shè)計(jì)PNP 的理想天然片段。

受penilactones 啟發(fā)，筆者課題組利用clavatol的o-QM 過渡中間體及其非酶催化性質(zhì)，在培養(yǎng)P. crustosumPRB-2 過程中添加適當(dāng)濃度的吲哚等含氮分子，分離鑒定了4 個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的含clavatol單元的PNPs（見圖14），酶失活等實(shí)驗(yàn)證實(shí)該類結(jié)構(gòu)是通過非酶催化驅(qū)動(dòng)形成的[25]。擬生物堿penindolone 表現(xiàn)出顯著的抗禽流感病毒活性，且無明顯細(xì)胞毒活性。Penindolone 不易產(chǎn)生耐藥性。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明，噴霧或滴鼻給藥都能顯著提高小鼠的成活率。作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，penindolone 靶向血凝素（hemagglutinin），能夠同時(shí)阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞以及病毒和細(xì)胞之間的膜融合過程，是一類新型的抗病毒先導(dǎo)化合物[25]。

圖14 微生物發(fā)酵中非酶催化驅(qū)動(dòng)形成的擬天然產(chǎn)物[25]Figure 14 Nonenyzmatic-driven pseudo-natural products formed through microbial fermentation[25]

后續(xù)工作中，課題組引入非酶自組裝策略，以拓展PNP 結(jié)構(gòu)豐富度。在深入調(diào)查P. crustosumPRB-2 產(chǎn)PNP 潛能時(shí)，又發(fā)現(xiàn)5 種新結(jié)構(gòu)類型的14個(gè)PNPs（15-1 ～ 15-14），包括一類高度氧化修飾的氧雜角四環(huán)骨架（如化合物15-1 和15-2），該擬天然新骨架分子表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抗腫瘤活性[26]。鑒于該菌產(chǎn)生的活潑中間體及其創(chuàng)造PNP 的潛力，筆者課題組通過將P. crustosumPRB-2 與Xylariasp.共培養(yǎng)，分離鑒定由clavatol 和1，3-dihydroxy-5-(12-hydroxyheptadecyl) benzene 偶聯(lián)獲得的penixylarins A 和B（15-15 和15-16），驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)PNPs中的clavatol 片段（見圖15 紅色部分）是通過非酶催化的邁克爾加成偶聯(lián)形成[27]。

圖15 非酶催化驅(qū)動(dòng)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性含clavatol 擬天然產(chǎn)物[26-27]Figure 15 Endogenous clavatol-containing pseudo-natural products discovered by nonenyzmatic-driven approach[26-27]

2022 年，Purdy 等[28]系統(tǒng)總結(jié)了o-QM 參與天然產(chǎn)物生物合成、形成機(jī)制和潛在的利用價(jià)值。綜述中描述了合成o-QM 所需的酶，包括黃素依賴的氧化酶（flavin-dependent oxidases），hetero-Diels-Alderases，S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴性周環(huán)酶（S-adenosyl-Lmethionine-dependent pericyclases）和α-酮戊二酸依賴的非血紅素鐵酶（α-ketoglutarate-dependent nonheme iron enzymes）等[28]，這些研究為充分利用QM 設(shè)計(jì)PNP 奠定了酶學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)利用合成生物學(xué)制備QM產(chǎn)物以及挖掘新的QM 具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

戴好富課題組和唐嘯宇課題組合作研究了血竭（龍血樹受傷后產(chǎn)生的分泌物）中查爾酮二聚體形成機(jī)制[29]，經(jīng)證實(shí)這些二聚化產(chǎn)物是查爾酮的p-quinone methide（p-QM）活潑中間體經(jīng)非酶促邁克爾加成獲得，這些化合物很可能屬于PNP 范疇。

除QM 借助非酶促產(chǎn)生PNP，苯胺及其類似物與微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物偶聯(lián)也是產(chǎn)生PNP 的理想策略。Zhang 等[30]通過在培養(yǎng)基中添加苯胺類似物，從1 株黃河沼澤來源真菌Penicillim malacosphaerulumHPU-J01 中分離到7 個(gè)含苯胺或苯胺類似物的PNPs（見圖16），其中6 個(gè)為新化合物，化合物talaroenamine F 表現(xiàn)出對(duì)蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的抗菌活性，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.85 mg · L-1。為了進(jìn)一步獲得結(jié)構(gòu)多樣的talaroenamines，該課題組在制備talaroenamine F 的基礎(chǔ)上，通過苯胺衍生物的替換，獲得利用前體直接添加策略難以制備的19 個(gè)新衍生物（見圖17），活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明talaroenamine F14（17-14）對(duì)K562 具有細(xì)胞毒活性，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為2.2 μmol · L-1[31]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些新衍生物均為苯胺和環(huán)己二酮衍生物通過非酶催化形成，且這2 個(gè)片段在生物合成上差別迥異，符合PNP 設(shè)計(jì)邏輯。

圖16 前體直接添加策略合成的含苯胺及其類似物擬天然產(chǎn)物[30]Figure 16 Pseudo-natural products containing aniline and aniline derivatives synthesized by precursor-directed biosynthesis[30]

圖17 Talaroenamine F 輔助產(chǎn)生的擬天然產(chǎn)物[31]Figure 17 Pseudo-natural products produced by talaroenamine F-mediated approach[31]

3 酶催化驅(qū)動(dòng)的擬天然產(chǎn)物

利用工程化思路改造核糖體肽生物合成途徑是創(chuàng)制擬天然核糖體肽產(chǎn)物的重要手段。目前現(xiàn)有技術(shù)編輯核糖體合成和翻譯后修飾肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides，RiPPs）的生物合成途徑存在巨大的挑戰(zhàn)。Vinogradov 等[32]基于工程化改造的lactazole A 生物合成途徑構(gòu)建了硫肽（thiopeptides）從頭發(fā)現(xiàn)的功能平臺(tái)，通過更換氨基酸類型以及排列組合，可以獲得大量的擬天然硫肽產(chǎn)物。結(jié)合mRNA 展示技術(shù)，可以制備和大規(guī)模篩選該平臺(tái)產(chǎn)生的lactazolelike thiopeptides 擬核糖體肽，結(jié)果顯示11 個(gè)酶促合成的PNPs 中，有9 個(gè)對(duì)Traf2-和Nck-相互作用激酶（Traf2- and Nck-interacting kinase，TNIK）表現(xiàn)出高親和力；有10 個(gè)抑制了TNIK 活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些擬天然硫肽能夠像多肽Tat 一樣有效地進(jìn)入到細(xì)胞的胞液中。隨著對(duì)天然產(chǎn)物生物合成的不斷認(rèn)知，該策略將會(huì)成為發(fā)現(xiàn)PNP 的重要方向。

4 化學(xué)和生物合成聯(lián)合驅(qū)動(dòng)的擬天然產(chǎn)物

生物合成中的化學(xué)活潑中間體、不穩(wěn)定產(chǎn)物（亦或等價(jià)替代物）已經(jīng)展示了其在拓展結(jié)構(gòu)空間方面的優(yōu)勢(shì)。尤其是具有可再生性的微生物源化學(xué)活潑物質(zhì)（中間體），其在很大程度上解決了原料供給的瓶頸?；瘜W(xué)活潑中間體具有多向性的化學(xué)反應(yīng)屬性，是制備PNP 的理想起始原料。受真菌Chaetomiumsp.產(chǎn)生的chaetophenols 啟發(fā)，Asai 等[33]推測(cè)該類結(jié)構(gòu)可能存在共同聚酮來源的片段，將該聚酮片段的生物合成基因簇pksCH-2構(gòu)建到米曲霉（Aspergillus oryzae）表達(dá)系統(tǒng)中，使轉(zhuǎn)化株大量產(chǎn)生該片段，在Aspergillus oryzae中內(nèi)源酶的作用下產(chǎn)生o-QMs 活潑等價(jià)物。作者基于該活潑的聚酮片段，通過微生物發(fā)酵過程中的自身聚合以及與外源片段進(jìn)行化學(xué)合成偶聯(lián)，制備獲得了41 個(gè)PNPs，包括聚酮低聚物（polyketide oligomers），azaphilone-type 分子和indole-polyketide 雜合化合物等20 個(gè)不同的骨架類型（見圖18）。其中1 個(gè)化合物表現(xiàn)出顯著的抗腺病毒活性，最大效應(yīng)半數(shù)濃度（half-maximum effective concentration，EC50）為4.6μmol · L-1。這種聯(lián)合策略驅(qū)動(dòng)制備PNP 方式為高效利用微生物中高活性的化學(xué)活潑片段（產(chǎn)物）提供了范例。

圖18 基于真菌非還原型聚酮合酶途徑的擬天然聚酮化合物的結(jié)構(gòu)多樣性[33]Figure 18 Structural diversity of pseudo-natural polyketides based on fungal non-reducing polyketide synthase pathways[33]

李德海課題組利用穩(wěn)定的o-QM 等價(jià)物與6 個(gè)不同的底物一步合成了15 個(gè)PNPs（見圖19），其中4 個(gè)PNPs 同樣可以由非酶催化體獲得（見圖14），其余11 個(gè)PNPs 則難以利用微生物發(fā)酵過程中非酶催化獲得[25]。

圖19 基于clavatol 擬天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)合成[25]Figure 19 Structures and chemical synthesis of clavatol-based pseudo-natural products[25]

5 展望

PNP 化學(xué)進(jìn)化策略為高效發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新性藥物小分子提供了重要思路，方興未艾，充分展示了天然產(chǎn)物藥效團(tuán)在成藥性中的優(yōu)勢(shì)，并提供了重要的技術(shù)手段。天然產(chǎn)物片段的合理選擇及設(shè)計(jì)組合是構(gòu)建PNP 的關(guān)鍵。事實(shí)上，多數(shù)天然產(chǎn)物片段供給量難以滿足PNP 合集構(gòu)建，這些片段往往無法直接從天然產(chǎn)物中大量制備獲得，這在很大程度上阻礙了PNP 的創(chuàng)制。從頭合成是解決其原料來源瓶頸問題的思路之一。重要天然活性物質(zhì)（植物、微生物來源）生物合成途徑的深入研究及其形成機(jī)制的闡明，為今后利用合成生物學(xué)手段高效制備天然活性物質(zhì)提供重要信息。微生物來源的化學(xué)活潑中間體（產(chǎn)物）參與的PNP 在藥物先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)方面?zhèn)涫荜P(guān)注，雖然這些化學(xué)活潑的產(chǎn)物所參與構(gòu)建的結(jié)構(gòu)、化學(xué)反應(yīng)難以預(yù)測(cè)，但是其為設(shè)計(jì)合成PNP 結(jié)構(gòu)多樣性提供了難得的、可再生的天然片段材料。深入研究這些片段也對(duì)挖掘微生物的代謝潛能及其生態(tài)功能具有重要意義。