冉火苗，尹文兵

（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

天然產(chǎn)物是一類由動(dòng)植物和微生物等生物體代謝所產(chǎn)生的小分子化合物。結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性賦予許多天然產(chǎn)物強(qiáng)大的生物活性，使它們成為藥物和藥物先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)的巨大寶庫(kù)[1]。1981—2019 年，共有約1 881 種具有治療效果的小分子藥物被批準(zhǔn)上市，其中46%來(lái)源于未經(jīng)修飾的天然產(chǎn)物或其衍生物[2]。微生物是生命世界的第一大類群，具有豐富多樣的生物資源，一直被認(rèn)為是活性新藥的重要來(lái)源。在已知結(jié)構(gòu)的160 000 種天然產(chǎn)物中，約50%來(lái)自微生物，其中約25%是具有生物活性的小分子，包括抗生素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、酶抑制劑和生物除草劑等，涉及人類生活的方方面面[3]。然而，由于環(huán)境污染、人口增長(zhǎng)和病原微生物耐藥性增強(qiáng)等原因，人們對(duì)藥物產(chǎn)量及數(shù)量的需求越來(lái)越高，傳統(tǒng)的天然藥物獲得方式已不能滿足需求。因此，如何有效地挖掘微生物中新穎的活性分子已成為當(dāng)今全球天然藥物學(xué)家所面臨的巨大機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的微生物基因組信息得到解析，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)微生物中蘊(yùn)含著大量負(fù)責(zé)天然產(chǎn)物（次級(jí)代謝產(chǎn)物）生物合成的基因簇，且該數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目前鑒定的化合物結(jié)構(gòu)類型數(shù)量[4]，表明在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，微生物中的生物合成基因簇大多處于沉默狀態(tài)，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。對(duì)此，研究人員做出了諸多嘗試來(lái)激活沉默基因簇，包括利用遺傳操作調(diào)控基因的表達(dá)、定向改造合成途徑、異源表達(dá)特定基因簇等[5]。例如，通過(guò)敲除植物內(nèi)生菌無(wú)花果擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis fici）中具有組蛋白修飾功能的表觀遺傳因子組蛋白H3 賴氨酸4 甲基轉(zhuǎn)移酶（histone H3 lysine 4 methyltransferase）CclA 和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase）HdaA，激活了一系列聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括15 個(gè)新結(jié)構(gòu)[6]；通過(guò)定向改造抗真菌藥物卡泊芬凈生物合成途徑中的修飾基因，得到多個(gè)卡泊芬凈衍生物，其中pneumocandins F 和G 展現(xiàn)出對(duì)念珠菌屬和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的強(qiáng)抑制活性[7]；利用啟動(dòng)子工程改造，在模式真菌構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中建立高通量基因表達(dá)篩選平臺(tái)，成功激活A(yù). fumigatus中環(huán)四肽合成基因，鑒定出2 個(gè)新穎的潛在毒力因子fumiganins A 和B[8]。然而，以上策略均面臨不同程度的技術(shù)瓶頸，例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略只能針對(duì)特定基因簇；定向改造需要確切的生物合成途徑信息；異源表達(dá)和啟動(dòng)子工程依賴于菌株的可遺傳操作水平。這些短板極大地降低了沉默基因簇的激活效率。因此，科研工作者迫切需要新策略、新技術(shù)來(lái)激活沉默基因簇，誘導(dǎo)新穎的活性小分子的產(chǎn)生，最大限度地挖掘微生物的化學(xué)潛能。

值得注意的是，次級(jí)代謝產(chǎn)物不是微生物生長(zhǎng)所必需的，而是其在生長(zhǎng)發(fā)育后期產(chǎn)生的一系列具有生物活性的小分子化合物，包括抗生素、生物堿、毒素、色素和生長(zhǎng)激素等[9]。它們通常被認(rèn)為是不同微生物之間相互作用的介質(zhì)?；谶@一理論，在過(guò)去的十幾年間，從生態(tài)學(xué)的角度出發(fā)，通過(guò)共培養(yǎng)策略，將2 個(gè)或多個(gè)微生物在同一條件下共同培養(yǎng)，來(lái)誘發(fā)單獨(dú)培養(yǎng)狀態(tài)下沉默的生物合成途徑，成為活性天然產(chǎn)物挖掘的有效手段[10]。本文總結(jié)了近年來(lái)基于不同微生物互作體系挖掘新穎天然產(chǎn)物的最新研究進(jìn)展，綜述了共培養(yǎng)策略下微生物之間的相互作用機(jī)制、沉默基因簇的誘導(dǎo)激活機(jī)制和新興方法技術(shù)，以期為相關(guān)研究提供理論參考，也為更好地應(yīng)用共培養(yǎng)策略挖掘新穎天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 基于不同微生物互作體系的新穎活性天然產(chǎn)物挖掘

自然生態(tài)下，微生物從不單獨(dú)存在，而是以群落的狀態(tài)維持生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定[11]。群落成員長(zhǎng)期的共同進(jìn)化導(dǎo)致了微生物之間存在著共生、互生、協(xié)作、競(jìng)爭(zhēng)、寄生或者捕食等相互作用[12]。共培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)模擬自然生態(tài)環(huán)境，利用微生物之間的相互作用，使越來(lái)越多的活性天然產(chǎn)物得到表征和挖掘[13-14]?；谖⑸锊煌木錁?gòu)成和生態(tài)關(guān)系，當(dāng)前共培養(yǎng)體系主要分為3 種類型：細(xì)菌-細(xì)菌共培養(yǎng)、真菌-細(xì)菌共培養(yǎng)以及真菌-真菌共培養(yǎng)[15]。

1.1 細(xì)菌-細(xì)菌共培養(yǎng)

細(xì)菌作為個(gè)體微小、繁衍速度快的單細(xì)胞生物，是微生物生態(tài)群落中數(shù)量最多的成員。獨(dú)特的生存方式使得細(xì)菌能夠產(chǎn)生大量具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是具有抗菌、抗癌活性的潛在藥物先導(dǎo)分子[16]。細(xì)菌來(lái)源的廣譜抗生素，例如氯霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素和伊維菌素等的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用拯救了數(shù)千萬(wàn)的生命。隨著對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的深入研究，人們逐漸意識(shí)到抗生素可能是微生物為了保衛(wèi)其資源或領(lǐng)地免受潛在入侵者的侵害而產(chǎn)生的“化學(xué)武器”[17]，只有環(huán)境中的生存威脅足夠大時(shí)才能夠刺激細(xì)菌產(chǎn)生抗生素類的活性代謝產(chǎn)物[18]?；谶@一假設(shè)，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始探索細(xì)菌之間的相互作用，以此作為新型化合物發(fā)現(xiàn)的重要手段。

Bugni 課題組基于基因組學(xué)和代謝組學(xué)構(gòu)建了海洋無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)源的細(xì)菌共培養(yǎng)平臺(tái)，通過(guò)培養(yǎng)液粗提物的抑菌測(cè)試，篩選出Micromonosporasp.和Rhodococcussp.共培養(yǎng)體系，并從中分離得到新的雙硝基糖基化蒽環(huán)類化合物keyicin（1）[19-20]。該化合物對(duì)革蘭陽(yáng)性病原菌枯草芽孢桿菌和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制活性[最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為9.9 和2.5 μmol · L-1]。對(duì)keyicin 的藥物作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，該化合物有別于常規(guī)的蒽環(huán)類藥物，其并非通過(guò)損傷DNA 來(lái)發(fā)揮生物活性，從而避免了使用過(guò)程中可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，可作為潛在的低毒高效的抗癌抗菌類藥物，具有巨大的商業(yè)價(jià)值[20-21]。Maglangit 等[22]從土壤中分離鑒定出鏈霉菌Streptomycessp. MA37，基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌中存在大量沉默基因簇，通過(guò)與革蘭陽(yáng)性菌Pseudomonassp.共培養(yǎng)，誘導(dǎo)并分離得到具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的吲哚生物堿類化合物BE-13793C（2）。芽孢桿菌與鏈霉菌共培養(yǎng)時(shí)，能夠激活鏈霉菌中含有聚酮合酶-非核糖體多肽合成酶的雜合基因簇，誘導(dǎo)產(chǎn)生一類具有抗腫瘤和抗增殖活性的大環(huán)肽類化合物dentigerumycin E 及其衍生物（3 ～ 5）[23]。Hifnawy 等[24]將2 株放線菌屬細(xì)菌Micromonosporasp. UR56 和Actinokinesporasp. EG49 共培養(yǎng)，鑒定出一系列吩嗪衍生物（6 ～ 15），其中化合物6 ～ 8和15 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力和抗生物膜活性，以及較弱的細(xì)胞毒性。

值得一提的是，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肺冢村菌（Tsukamurella pulmonis）能夠誘導(dǎo)不同細(xì)菌產(chǎn)生多種類型的抗生素，是一種極具潛力的共培養(yǎng)誘導(dǎo)菌株。例如，將T. pulmonisTP-B059 與肉桂鏈霉菌（Streptomyces cinnamoneus）NBRC 13823 共培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)S. cinnamoneus產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的吲哚生物堿arcyriaflavin E（16）[25]；當(dāng)其與鏈霉菌Streptomycessp. CJ-5 共培養(yǎng)時(shí)，得到具有獨(dú)特γ-丁內(nèi)酯骨架的潛在抗腫瘤活性化合物chojalactones A-C（17 ～ 19）[26]；當(dāng)共培養(yǎng)對(duì)象換成Streptomyces endusS522 之后，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生具有罕見(jiàn)的2H-四氫-4，6-二氧代-1，2-嗪環(huán)系統(tǒng)（2H-tetrahydro-4，6-dioxo-1，2-oxazine ring system，TDOR）的抗細(xì)菌類化合物alchivemycins A（20）[27]和B（21）[28]。通過(guò)細(xì)菌-細(xì)菌共培養(yǎng)產(chǎn)生的新代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)菌-細(xì)菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)的新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物Figure 1 Novel secondary metabolites isolated from bacteria-bacteria co-culture

1.2 真菌-細(xì)菌共培養(yǎng)

自然生態(tài)環(huán)境中，真菌與細(xì)菌之間的“跨界”互作也是微生物群落的常見(jiàn)組成形式。由于真菌和細(xì)菌不同的生殖方式和菌落形態(tài)，它們具有各自獨(dú)特的養(yǎng)分獲取途徑和防御機(jī)制，并隨著自身需求的變化，分泌活性分子，改變?nèi)郝洵h(huán)境。例如黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）通過(guò)釋放揮發(fā)性有機(jī)物萜烯混合物來(lái)影響土壤棲息細(xì)菌Collimonas pratensisTer291 和Serraria plymuthicaPRI-2C 的集群運(yùn)動(dòng)能力，推測(cè)萜烯混合物在低濃度時(shí)能將互利細(xì)菌吸引到真菌周?chē)?，高濃度時(shí)則將有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的細(xì)菌驅(qū)除出生態(tài)群落[29]。大量研究表明，實(shí)驗(yàn)室條件下真菌與不同細(xì)菌之間的相互組合，能夠引發(fā)多種沉默基因簇的表達(dá)以及新型次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生（見(jiàn)圖2）。

圖2 真菌-細(xì)菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)的新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物Figure 2 Novel secondary metabolites isolated from fungus-bacteria co-culture

以A. fumigatus為例，A. fumigatus與鏈霉菌Streptomyces bullii共培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)出10 種沉默次級(jí)代謝產(chǎn)物的表征，包括甾醇類化合物ergosterol（22）；二酮哌嗪類化合物brevianamide F（23），spirotryprostatin A（24），spirotryprostatin B 及其衍生物（25 ～ 27），fumitremorgin B（28），verruculogen（29）；螺環(huán)類化合物11-O-methylpseurotin A（30）及其異構(gòu)體11-O-methylpseurotin A2（31）?；钚院Y選結(jié)果表明，除了化合物22，23 和30，其他化合物對(duì)原生動(dòng)物均具有抑制活性。其中化合物28和29 在0.2 μmol · L-1的濃度下表現(xiàn)出對(duì)布氏錐蟲(chóng)的抑制活性，并且分別在3.1 和3.9 μmol · L-1的濃度下表現(xiàn)出對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)的抑制活性，具有良好的應(yīng)用前景[30]。Wakefield 等[31]利用2 株列文虎克鏈霉菌（Streptomyces leeuwenhoekii）C34 和C58 分別與A.fumigatus共培養(yǎng)，次級(jí)代謝圖譜出現(xiàn)顯著差異。相比于純培養(yǎng)，S. leeuwenhoekiiC34 能夠誘導(dǎo)A. fumigatus產(chǎn)生2 個(gè)新穎的非核糖體多肽類化合物luteoride D（32）和pseurotin G（33）以及已知化合物terezine D 和11-O-methylpseurotin A，菌株C58 則激活倍半萜類抗生素pentalenic acid（34）的產(chǎn)生。而雷帕菌素鏈霉菌（Streptomyces rapamycinicus）能夠激活A(yù).fumigatus的萜合酶合成基因簇（fccA），指導(dǎo)雜萜類化合物35 和36 的合成[32]。

1.3 真菌-真菌共培養(yǎng)

真菌幾乎分布在地球上的每個(gè)生態(tài)環(huán)境中，有著非常豐富的物種多樣性。真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，已成為除放線菌之外，微生物天然產(chǎn)物多樣性挖掘的重要來(lái)源。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在過(guò)去的20 年中，新型真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)比例持續(xù)增加，迄今為止，約47%的微生物活性代謝產(chǎn)物為真菌來(lái)源[33]，包括真菌毒素、抗生素和色素等各種類別。近年來(lái)，通過(guò)真菌-真菌之間的共培養(yǎng)，迫使微生物競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境資源，誘導(dǎo)獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成，產(chǎn)生了許多具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤功能的活性天然產(chǎn)物（見(jiàn)圖3）。

圖3 真菌-真菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)的新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物Figure 3 Novel secondary metabolites isolated from fungus-fungus co-culture

筆者課題組以A. nidulans為“誘餌”，尋找環(huán)境中潛在的互作真菌，通過(guò)顯著的孢子顏色變化，篩選出1 株附球?qū)僬婢角蚓‥picoccum dendrobii）。通過(guò)比較分析共培養(yǎng)前后A. nidulans的代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)E. dendrobii促使A.nidulans發(fā)生初級(jí)代謝以及次級(jí)代謝的全局性變化。通過(guò)分離純化顯著差異的化合物，共鑒定出2 個(gè)法尼基焦磷酸衍生物和12 個(gè)aspernidine 類衍生物，其中8 個(gè)聚酮合酶的產(chǎn)物（37 ～ 44）為新骨架。此外，將E. dendrobii與來(lái)自曲霉屬、青霉屬、木霉屬和鐮孢屬的多株真菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)E. dendrobii能夠引起Aspergillus oryzae，Aspergillus terreus，Penicillium chrysogenum，F(xiàn)usarium proliferatum和Trichoderma hypoxylon次級(jí)代謝產(chǎn)物的顯著變化，表明E. dendrobii具有作為供體菌構(gòu)建真菌-真菌共培養(yǎng)體系的巨大潛力[34]。

除了基于導(dǎo)向篩選的共培養(yǎng)體系，將來(lái)自同一/相似生態(tài)位（海洋、土壤、內(nèi)生或附生環(huán)境）的多株真菌配對(duì)，也是有效的真菌-真菌共培養(yǎng)方法[14]。例如，Afiyatullov 等[35]從海洋真菌Aspergillus sulphureusKMM 4640 和Isaria felinaKMM 4639 的共培養(yǎng)物中分離出5 種新的異戊二烯化吲哚生物堿（45 ～ 49），其中化合物46 在10 μmol · L-1的濃度下表現(xiàn)出對(duì)人前列腺癌細(xì)胞22Rv1 的抑制活性。將從腐木上獲得的2 株附生真菌Pleurotus ostreatus和Trametes robiniophilaMurr 共培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生3 個(gè)新的倍半萜類化合物postredienes A-C（50 ～ 52），均表現(xiàn)出抗真菌活性，其中postrediene A（50）對(duì)病原真菌新生隱球菌和白念珠菌表現(xiàn)出強(qiáng)抑制活性（MIC80分別為1 和2 mg · L-1），與臨床藥物氟康唑作用相當(dāng)[36]。此外，Shang 等[37]將來(lái)自同一軟體動(dòng)物的2 株附生真菌Chaunopycnissp.和Trichoderma hamatum共培養(yǎng)，分離得到1 個(gè)罕見(jiàn)的2-烯基-四氫呋喃類化合物chaunopyran A（53），以及具有抗真菌活性的化合物pyridoxatin（54）及其甲基化衍生物methyl-pyridoxatin（55）。非常有趣的是，研究人員在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板上培養(yǎng)這2 株真菌時(shí)，觀察到了明顯的生長(zhǎng)抑制界面，通過(guò)對(duì)共培養(yǎng)后差異化合物產(chǎn)生菌的分析，作者推測(cè)Chaunopycnissp.為贏得生存優(yōu)勢(shì)激活了抗真菌化合物54 的生物合成，而作為響應(yīng)，T. hamatum將化合物54 活性官能團(tuán)甲基化，使其抗菌活性喪失，由此造成了化合物55的積累，這項(xiàng)研究揭示了真菌-真菌互作過(guò)程中分泌的活性小分子潛在的生物學(xué)功能。

2 微生物之間的相互作用機(jī)制

自然環(huán)境中微生物之間的生態(tài)關(guān)系非常復(fù)雜，存在著協(xié)同代謝、誘導(dǎo)代謝、競(jìng)爭(zhēng)抑制、寄生捕食等多種類型，種內(nèi)/種間的相互作用是推動(dòng)微生物進(jìn)化和維持群落生態(tài)穩(wěn)定性的重要因素[38]。在共培養(yǎng)體系中，共享生存環(huán)境迫使微生物之間發(fā)生相互作用，并分泌具有生物活性的代謝產(chǎn)物，來(lái)識(shí)別其他物種并維持自身生存。這個(gè)過(guò)程涉及不同的作用機(jī)制，大致可以概括為3 類，包括：營(yíng)養(yǎng)獲取（provision of nutrients）、競(jìng)爭(zhēng)和信號(hào)傳遞（competition and signaling）以及物理接觸（physical contact）（見(jiàn)圖4）[39]。對(duì)于微生物之間互作模式和機(jī)制的了解及研究，有助于高效建立共培養(yǎng)體系，有的放矢挖掘活性天然產(chǎn)物。

圖4 微生物之間的相互作用機(jī)制[39]Figure 4 Mechanisms of interaction between microorganisms[39]

2.1 營(yíng)養(yǎng)獲取

在共培養(yǎng)體系中，面對(duì)有限的生存資源，菌落間有時(shí)會(huì)選擇通力協(xié)作，相互提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Bryant 等[40]首先提出了“Methanobacillus omelianskii”共生體的概念，他們發(fā)現(xiàn)早期分離鑒定的M. omelianskii其實(shí)是產(chǎn)乙酸菌與產(chǎn)甲烷菌的共培養(yǎng)物，在這一共培養(yǎng)體系中，產(chǎn)乙酸菌能夠?qū)⒁掖嫁D(zhuǎn)化為乙酸鹽和氫氣，產(chǎn)甲烷菌則能夠利用氫氣將二氧化碳還原為甲烷，為二者的生存提供基本的碳源。隨后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這種互惠共生的關(guān)系在微生物群落中普遍存在。例如，在厭氧條件下，沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）會(huì)選擇與大腸埃希菌（Escherichia coli）相互合作維持生存。E. coli在厭氧環(huán)境中會(huì)分解葡萄糖并產(chǎn)生有機(jī)酸，這種葡萄糖代謝產(chǎn)物為R. palustris提供了碳源；作為交換，R. palustris 產(chǎn)生NH4+，為E. coli提供必要的氮源[41]。在工業(yè)上混合發(fā)酵黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）和卡氏德巴利酵母（Debaryomyces castellii）時(shí)檢測(cè)到多種類胡蘿卜素的積累，僅R. glutinis存在時(shí)則產(chǎn)量極低。通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中的糖含量，推測(cè)其原因是D. castellii將培養(yǎng)基中的低聚糖水解為麥芽糖和葡萄糖，為R. glutinis合成類胡蘿卜素提供能源；而當(dāng)缺少共培養(yǎng)菌株時(shí)，R. glutinis由于缺乏基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)法合成活性代謝產(chǎn)物[42]。除了以上提到的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)代謝物的交換，鐵和銅等作為機(jī)體生存所必備的金屬輔因子，也是菌株間相互作用的基礎(chǔ)之一[43]。D'Onofrio 等[44]發(fā)現(xiàn)，藤黃微球菌（Micrococcus luteus）KLE1011 能夠產(chǎn)生?；?去鐵胺鐵載體，該鐵載體能夠作為輔助生長(zhǎng)因子，使得多株無(wú)法培養(yǎng)的海洋來(lái)源的細(xì)菌生長(zhǎng)，為不可培養(yǎng)微生物的挖掘和研究提供了新的思路。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)與信號(hào)傳遞

然而多數(shù)情況下，微生物是“自私”的，為了最大限度地獲取有限的生存資源，往往會(huì)產(chǎn)生相互競(jìng)爭(zhēng)。Lee 等[45]發(fā)現(xiàn)在鐵源限制的共培養(yǎng)體系中，黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）和天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）分別能夠產(chǎn)生大量的鐵載體myxochelin 和抗生素actinorhodin，表明M.xanthus為了搶占培養(yǎng)基中的鐵元素，生產(chǎn)過(guò)量的鐵載體myxochelin 來(lái)螯合鐵離子以供自身生長(zhǎng)發(fā)育，S. coelicolor則分泌抗生素actinorhodin 來(lái)減少體系中M. xanthus的生物量以維持自身的生態(tài)優(yōu)勢(shì)。真菌體系中也發(fā)現(xiàn)了類似的互作模式，A. fumigatus能夠分泌異腈類化合物xanthocillin，具有銅結(jié)合活性，當(dāng)環(huán)境中的銅元素含量過(guò)低時(shí)，A. fumigatus能夠上調(diào)表達(dá)xanthocillin 生物合成基因簇，奪取環(huán)境中的銅元素，抑制其他微生物的生長(zhǎng)[46]。

除了營(yíng)養(yǎng)元素的爭(zhēng)奪之外，微生物也進(jìn)化出獨(dú)特的交流方式，以胞外信號(hào)小分子（small extracellular signalling molecules，SSMs）實(shí)現(xiàn)種內(nèi)、種間以及跨界的信號(hào)通訊，在微生物競(jìng)爭(zhēng)或合作中發(fā)揮著重要作用[47]。例如，菌根促生鏈霉菌（Streptomyces）strain AcH 505 在與菌根促生真菌共培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生促真菌生長(zhǎng)因子auxofuran，輔助根系共生真菌的生長(zhǎng)；當(dāng)其與植物病原菌共培養(yǎng)時(shí)，則產(chǎn)生抗真菌類抗生素WS-5995 B 和C，抑制植物致病真菌的生長(zhǎng)[48]。為了使這些小分子充當(dāng)信號(hào)工具，它們必須能夠從生產(chǎn)菌中擴(kuò)散出來(lái)，與受體菌相互作用，從而引起響應(yīng)，并且能以濃度依賴型的方式影響生產(chǎn)菌和受體菌[49]。基于不同的生存環(huán)境，微生物配備了不同類型的信號(hào)小分子，包括具有抑制活性的抗生素[50]、親脂性的揮發(fā)性有機(jī)化合物[51]和自動(dòng)誘導(dǎo)劑群體感應(yīng)分子[52]。為了實(shí)現(xiàn)防御或交流的目標(biāo)，微生物互作過(guò)程中產(chǎn)生的這些SSMs 往往是具有顯著生物活性的代謝產(chǎn)物?？股睾腿后w感應(yīng)因子可作為潛在的藥物先導(dǎo)化合物，揮發(fā)性有機(jī)物是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的親脂性分子且大多具有生物防治活性[47]。競(jìng)爭(zhēng)與信號(hào)傳遞是微生物之間最為通用和常見(jiàn)的相互作用機(jī)制，由此產(chǎn)生的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物是新型天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。

2.3 物理接觸

另外一種常見(jiàn)的微生物互作模式被歸納為直接的物理接觸。在某些微生物共培養(yǎng)體系中，相互作用的微生物必須通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸，才能夠激活沉默的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇。例如，在海洋真菌Libertellasp.與海洋變形桿菌α-proteobacterium CNJ-328 共培養(yǎng)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗癌活性的二萜類化合物libertellenones A-D。研究人員將α-proteobacterium 的培養(yǎng)上清液或乙酸乙酯提取物加入Libertellasp.中，均無(wú)法誘導(dǎo)libertellenones 的產(chǎn)生，由此推測(cè)在這一共培養(yǎng)體系中，菌株間的物理接觸是必要的[53]。Abe 教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，病原細(xì)菌T. pulmonisTP-B0596 能夠誘導(dǎo)變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）TK-23產(chǎn)生色素類抗生素，掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)時(shí)S. lividansTK-23 將菌絲體纏繞在T. pulmonisTP-B0596 菌體表面，且只有T. pulmonisTP-B0596活細(xì)胞具有誘導(dǎo)效應(yīng)，證明了共培養(yǎng)時(shí)S. lividansTK-23 通過(guò)物理接觸識(shí)別T. pulmonisTP-B0596，并分泌抗生素作為響應(yīng)[54]。

無(wú)距離的直接接觸能夠使微生物之間近距離地交換信息，是非常高效的交流方式。細(xì)菌能夠通過(guò)細(xì)胞間的物理接觸，將自身嵌入到胞外基質(zhì)中，形成結(jié)構(gòu)化群落，即生物膜，來(lái)抵抗環(huán)境中的不利因素[55]。真菌的菌絲或細(xì)胞同樣也會(huì)發(fā)生相互纏繞或嵌入菌體內(nèi)部，進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、代謝物交換和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)[56]。在真菌-細(xì)菌相互作用中，真菌往往充當(dāng)細(xì)菌的生物支架，細(xì)菌附著在真菌表面或深入菌絲內(nèi)部，來(lái)實(shí)現(xiàn)菌落間的信號(hào)傳遞和代謝響應(yīng)[13]。這些動(dòng)態(tài)相互作用與微生物擴(kuò)散、養(yǎng)分獲取和抗生素抗性有關(guān)，且影響微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物形成。

3 微生物共培養(yǎng)激活沉默基因簇的分子機(jī)制

盡管大量實(shí)驗(yàn)證明微生物之間的營(yíng)養(yǎng)交換、信號(hào)通訊以及物理接觸能夠誘發(fā)沉默基因的激活，但互作之后引發(fā)調(diào)控激活的分子機(jī)制仍然缺乏理論基礎(chǔ)研究。微生物，尤其是真菌中，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成受到非常嚴(yán)格的監(jiān)管，以確保僅在需要時(shí)產(chǎn)生有效的活性分子。即使激活單個(gè)沉默基因簇也需要精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及多個(gè)層面的調(diào)控，包括全局性調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控和途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[57-58]。微生物相互作用的模式多種多樣，其激活沉默基因簇的機(jī)制也十分復(fù)雜。以下列舉了目前具有代表性的幾種誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制，以期能為后續(xù)的研究提供思路。

3.1 全局性調(diào)控

真菌對(duì)于相互作用后的響應(yīng)通常依賴于全局性調(diào)控因子，它們能夠促使真菌改變自身的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)或次級(jí)代謝基因的表達(dá)，從而對(duì)外界刺激給予應(yīng)答[59]。筆者課題組在對(duì)A. nidulans和植物內(nèi)生真菌E. dendrobii互作的研究中發(fā)現(xiàn)，A. nidulans中部分功能缺失的VeA1 蛋白（缺失了VeA 的前36 個(gè)氨基酸）是誘發(fā)共培養(yǎng)后沉默基因簇激活的關(guān)鍵調(diào)控因子[34]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，共培養(yǎng)后A. nidulans中有15.4%的基因被顯著上調(diào)，19%被顯著下調(diào)，22 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量顯著提高，包括一系列新穎的聚酮類aspernidines 衍生物，呈現(xiàn)全局性次級(jí)代謝變化。分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并結(jié)合基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A. nidulans中部分功能缺失的VeA1 蛋白并非無(wú)功能的偶發(fā)突變產(chǎn)物，而是作為響應(yīng)微生物互作的關(guān)鍵元件，與全局性調(diào)控因子Velvet 復(fù)合體中的LaeA 和VelB 協(xié)同參與次級(jí)代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游可能涉及的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因顯著差異表達(dá)分析，結(jié)合遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明了Zn(II)2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子SclB的調(diào)控功能，影響aspernidines 等多個(gè)生物合成基因簇的表達(dá)。研究揭示了真菌中由VeA1 介導(dǎo)，通過(guò)LaeA-VeA1-VelB 復(fù)合體，再經(jīng)由下游轉(zhuǎn)錄因子SclB 的復(fù)雜響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖5）。同時(shí)，這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也在A. fumigatus中得到了驗(yàn)證[34]。目前，筆者課題組對(duì)E. dendrobii在互作后產(chǎn)生的SSMs 以及其到達(dá)A. nidulans后的響應(yīng)受體和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究工作正在進(jìn)行中，期待能夠?qū)φ婢?真菌互作后誘導(dǎo)激活機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性解析。

圖5 構(gòu)巢曲霉和石斛附球菌互作調(diào)控模式圖[34]Figure 5 Regulatory network during interaction between Aspergillus nidulans and Epicoccum dendrobii[34]

3.2 表觀遺傳調(diào)控

與全局性調(diào)控類似，表觀遺傳調(diào)控也是真菌響應(yīng)環(huán)境變化的有效手段，通過(guò)影響次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝產(chǎn)物的調(diào)控，包括染色質(zhì)重塑、DNA 甲基化和組蛋白翻譯后修飾等[60]。Brakhage 和Hertweck 課題組關(guān)注真菌-細(xì)菌物理接觸后所引發(fā)的調(diào)控機(jī)制，揭示了S. rapamycinicus和A. nidulans之間通過(guò)細(xì)胞接觸導(dǎo)致組蛋白翻譯后修飾，從而激活沉默基因簇的分子機(jī)制（見(jiàn)圖6）。最初，Schroeckh 等[61]將A.nidulans與58 種土壤放線菌共培養(yǎng)，篩選出1 株鏈霉菌S. rapamycinicus，該菌能夠激活A(yù). nidulans中負(fù)責(zé)聚酮類化合物orsellinic acid 合成的ors基因簇的表達(dá)。掃描電鏡結(jié)果顯示，ors簇的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于鏈霉菌和真菌菌絲之間緊密的物理相互作用。通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序技術(shù)（chromatin immunoprecipitation sequencing，Chipseq）結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)，證明鏈霉菌能夠使Saga/Ada 復(fù)合體對(duì)染色質(zhì)的組蛋白進(jìn)行乙酰化修飾，從而引發(fā)表觀遺傳調(diào)控[62-63]。利用Chip-seq 分析和基因敲除驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Myb-like類型轉(zhuǎn)錄因子BasR 是連接組蛋白修飾和次級(jí)代謝產(chǎn)物激活的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，不僅參與調(diào)控ors基因簇的激活，也參與到dba，cic，mic和eas等多個(gè)基因簇的調(diào)控[64]。這項(xiàng)研究表明，物理接觸能夠引發(fā)A. nidulans的表觀遺傳調(diào)控，通過(guò)組蛋白乙酰化，激活或抑制真菌次級(jí)代謝生物合成基因簇的表達(dá)。

圖6 構(gòu)巢曲霉和雷帕菌素鏈霉菌互作調(diào)控模式圖[62-63]Figure 6 Regulatory network during interaction between Aspergillus nidulans and Streptomyces rapamycinicus[62-63]

3.3 基因水平轉(zhuǎn)移

細(xì)菌能夠通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得新的DNA，使其在與宿主的相互作用中獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[65]。這樣的現(xiàn)象也同樣會(huì)發(fā)生在細(xì)菌與微生物的相互作用中。Sinskey 課題組在對(duì)纏繞紅球菌（Rhodococcus fascians）307 和稠李鏈霉菌（Streptomyces padanus）共培養(yǎng)體系研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，基因水平轉(zhuǎn)移在共培養(yǎng)激活沉默基因簇機(jī)制中也起著重要作用（見(jiàn)圖7）[66-67]。共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)R. fascians307 產(chǎn)生新型氨基糖苷類抗生素rhodostreptomycins A 和B，對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌具有廣譜抗菌活性[66]。然而R. fascians307 本身并非抗生素產(chǎn)生菌，通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳和免疫共沉淀分析，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后R. fascians307 中含有來(lái)自其互作菌株S. padanus的巨型質(zhì)粒DNA，這個(gè)異源的DNA 片段與新型抗生素的產(chǎn)生有著直接的關(guān)聯(lián)[67]。盡管基因水平轉(zhuǎn)移和抗生素產(chǎn)生的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明，但通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移，將原本沉默的基因簇異源轉(zhuǎn)移到可表達(dá)宿主中，獲得新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物，可能是微生物互作產(chǎn)生新穎天然產(chǎn)物的重要手段。

圖7 纏繞紅球菌和稠李鏈霉菌互作調(diào)控模式圖Figure 7 Regulatory network during interaction between Rhodococcus fascians and Streptomyces padanus

4 新興的微生物共培養(yǎng)技術(shù)

微生物共培養(yǎng)的目標(biāo)之一就是排除與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相重疊的化合物，篩選新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物。獲益于近代色譜技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多高通量、高靈敏度以及高分辨率的培養(yǎng)和分析方法被應(yīng)用到共培養(yǎng)策略中，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜培養(yǎng)條件或者混合樣品中代謝產(chǎn)物成分的精準(zhǔn)檢測(cè)[68-69]。

4.1 微流體共培養(yǎng)平臺(tái)

微流體（microfluidic）共培養(yǎng)平臺(tái)是新興的共培養(yǎng)方法，其可采用微小體積液體培養(yǎng)的方法，在有限的空間內(nèi)隔離出大量腔室，允許相鄰的腔室對(duì)不同的微生物進(jìn)行空間分離，通過(guò)連接納米通道促進(jìn)代謝產(chǎn)物的充分交流，并可利用電子顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)[70]。該系統(tǒng)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)裝置最小化來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量的共培養(yǎng)條件篩選，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物共培養(yǎng)研究中。

4.2 微流體液滴培養(yǎng)平臺(tái)

微流體液滴（microfluidic droplet）培養(yǎng)平臺(tái)以微流體液滴作為納米級(jí)的生物反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)微生物，能夠?qū)崿F(xiàn)“不可培養(yǎng)微生物”群落的構(gòu)建[71]。該系統(tǒng)結(jié)合了微流體和膜擴(kuò)散技術(shù)，被培養(yǎng)的群落之間可以通過(guò)可滲透的腔室實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子的轉(zhuǎn)移，具有極大的應(yīng)用潛力。

4.3 高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)

最新的高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)在微量樣品或無(wú)需樣品制備的情況下直接進(jìn)行成分檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)次級(jí)代謝檢測(cè)中特定微生物區(qū)域的總質(zhì)譜分析[72]。例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）和激光解吸后電離質(zhì)譜成像（laser desorption postionization mass spectrometry imaging，LDPI-MSI）允許直接電離分析固體培養(yǎng)基上的真菌或細(xì)菌菌株的代謝物，實(shí)現(xiàn)指定區(qū)域的質(zhì)譜成像，定位共培養(yǎng)體系中被激活的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生菌以及產(chǎn)生位置[73-74]。納米噴霧解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（nanospray desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，nano-DESI-MSI）同樣無(wú)需樣品制備，且能夠更加精確地對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較小的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析[75]，結(jié)合代謝分子網(wǎng)絡(luò)繪制，能夠直觀反映出樣本的不同來(lái)源，評(píng)估代謝產(chǎn)物之間的結(jié)構(gòu)相似性[76]。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生得益于其群落為主的生存方式，不斷變換的生存環(huán)境和物種間的相互作用促使微生物不斷分泌功能性分子來(lái)確保自身的生存優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，隨著科學(xué)家對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成機(jī)制的積極研究和深入了解，微生物共培養(yǎng)策略逐漸被人們所重視。通過(guò)2 種或2 種以上微生物的混合培養(yǎng)，聚酮類、非核糖體多肽類、萜烯類和生物堿等多種類型的化合物得到分離鑒定，為創(chuàng)新藥物的開(kāi)發(fā)和利用提供了巨大的資源庫(kù)。

然而這一極具前景的研究領(lǐng)域仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，對(duì)于微生物共培養(yǎng)體系中互作菌株的篩選和組合仍是傾向隨機(jī)的過(guò)程，需要大量的前期篩選工作，造成沉默基因激活的不確定性；其次，微生物之間的相互作用復(fù)雜多變，容易受到培養(yǎng)條件的影響，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物變化的不穩(wěn)定性；最后，相互作用時(shí)微生物用來(lái)響應(yīng)的活性分子往往是微量的，造成了識(shí)別和檢測(cè)上的困難。這些因素極大地限制了新型天然產(chǎn)物的挖掘和利用。究其根本，微生物互作所引發(fā)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生機(jī)制研究缺乏理論基礎(chǔ)，導(dǎo)致共培養(yǎng)微生物的隨機(jī)組合，降低了沉默基因簇的激活效率。因此，未來(lái)研究亟需從分子機(jī)制入手，了解微生物互作后的作用模式，鑒定涉及的信號(hào)分子、關(guān)鍵響應(yīng)受體以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；闡明共培養(yǎng)后激活沉默基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；解析隱秘次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑。除此之外，還需要結(jié)合微生物組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)以及高通量、高精度的分析方法，實(shí)現(xiàn)差異化合物的精準(zhǔn)快速檢測(cè)。綜上所述，加強(qiáng)生物、遺傳、化學(xué)等多學(xué)科交叉融合，深入探索微生物相互作用的分子機(jī)制，將有利于深入了解和應(yīng)用共培養(yǎng)挖掘新穎天然產(chǎn)物策略。相信隨著科學(xué)技術(shù)的迭代更新，更多高效便捷的新方法、新技術(shù)將被應(yīng)用于微生物共培養(yǎng)的研究，推動(dòng)這一領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。