陳召亮，張 誠，崔 歡，蒲 劼，張 磊，郭振東，劉聚祥

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；4.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621000）

A 型流感病毒又稱為甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV），是威脅人類健康的主要傳染病原之一，因其常導(dǎo)致季節(jié)性流感疫情的發(fā)生而受到廣泛研究［1-2］。自IAV 出現(xiàn)以來，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)傳播，不僅造成了相當大的經(jīng)濟損失，而且還嚴重威脅到了全球公眾健康［3］。

中藥在預(yù)防和治療傳染性疾病上，有著悠久的歷史，許多經(jīng)典方劑，如麻杏石甘湯、銀翹散等，對于治療流感都有著良好的效果［4］。種類繁多的中藥被廣泛應(yīng)用于流感病毒及流感病毒性肺炎的基礎(chǔ)和臨床研究，是抗病毒藥物研發(fā)的重要資源［5］。在眾多研究成果中，許多中藥已顯示出一定的療效，但仍需要更多高質(zhì)量的實驗設(shè)計和臨床對照研究，從而進一步開發(fā)流感的治療藥物［6］。

中藥角茴香為罌粟科（Papaveraceae），角茴香屬（Hypecoum erectumL.）植物細果角茴香（Hypecoum leptocarpumHook.f.et Thoms.，HL）或直立角茴香（H.erectumL.）的干燥全草，是一種地區(qū)性習(xí)用藥材，常在少數(shù)民族地區(qū)作為藏藥和蒙藥使用，作為藏藥時，普遍以細果角茴香入藥，又稱巴爾巴達［7］。角茴香含有多種生物堿，其具備多種生物學(xué)活性，如抗炎作用［8］、鎮(zhèn)痛作用［9］、抗菌作用［10］。角茴香能夠作為流感治療藥物使用，這在我國多部中藥相關(guān)典籍中均有提示，如《西藏常用中草藥》中記載，其可治傷風(fēng)感冒、頭痛，可解食物中毒［11］；《中華本草》稱其能治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛［12］。有研究證實，角茴香水提物對MDCK 細胞中的H3N8 亞型流感病毒具有明顯的抑制作用，可以在體外顯著降低流感病毒的感染性［13］。然而，角茴香及其活性成分在體內(nèi)對流感病毒的影響作用鮮有報道。

因此，本研究使用A/PR/8/33（H1N1）流感病毒接種BALB/c 小鼠，建立流感病毒感染小鼠模型，并使用不同濃度的細果角茴香醇提顆粒劑藥液給藥治療，通過多種指標評價角茴香醇提顆粒劑對小鼠體內(nèi)流感病毒的抑制作用及對流感病毒感染小鼠的治療效果，以期為新型抗流感藥物研發(fā)相關(guān)研究提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與病毒毒株 BALB/c 小鼠，雌性，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；9 日齡無特定病原體（SPF）雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

甲型流感病毒，A/PR/8/33（H1N1），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所保存，并在9 日齡SPF雞胚中進行擴增。擴增之后，測定其在MDCK 細胞中50%組織細胞感染量（TCID50）和在BALB/c 小鼠中的半數(shù)致死量（LD50）。TCID50和LD50通過Reed-Muench 方法計算得到。

1.1.2 試驗藥物與試劑 角茴香醇提顆粒（HL），將細果角茴香原生藥材使用乙醇回流提取、濃縮，并經(jīng)流化床制粒制備得到，由保定厚棋生物科技有限公司制備完成。每1.0 g 顆粒相當于原生藥材1.50 g。奧司他韋，購自阿拉丁生化科技有限公司（中國上海）。

BioFlux Simply P 總RNA 提取試劑盒，購自杭州博日科技股份有限公司；Prime Script? RT 試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；Power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒，購自賽默飛世爾科技公司（美國）；Elisa 試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度角茴香醇提顆粒藥液的制備 分別稱量1.665、0.832 和0.416 g 的醇提顆粒溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）后，加熱，攪拌直至完全溶解。使用0.22 μm 的1 次性過濾器過濾除菌后，分別制備得到質(zhì)量濃度為16.65、8.32 和4.16 mg/mL 的高、中、低濃度角茴香醇提顆粒藥液。

1.2.2 小鼠的感染與治療 參考BALB/c 小鼠的流感病毒感染模型［14-15］。建模前，將小鼠隨機進行分組，分為空白對照組（NC）、病毒對照組（NC）、奧司他韋對照組（OS）、低劑量治療組（HL-L）、中劑量治療組（HL-M）和高劑量治療組（HL-H），共6 組。除空白對照組外，其余各組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，滴鼻接種H1N1 亞型流感病毒，50 μL/只（2 LD50/50 μL），由此建立得到流感病毒感染小鼠模型。

除空白對照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當天開始給藥治療。其中，HL-L、HL-M、HL-H 治療組小鼠分別使用低、中、高濃度的角茴香醇提顆粒藥液給藥治療，100 μL/只；奧司他韋對照組小鼠使用奧司他韋治療，治療劑量參考先前的報道，以5 mg/mL 的濃度在PBS 中進行稀釋，以20 mg/kg 的劑量給藥治療［16］；病毒對照組小鼠使用PBS 作為對照，100 μL/只。給藥方式均為灌胃給藥，1 天1 次，并在每天的同一時間進行給藥。

1.3 檢測指標與樣品采集

1.3.1 體重變化率、發(fā)病率和小鼠存活率 將60 只雌性BALB/c 小鼠隨機分為6 組，分組方式如前所述，每組10 只。除空白對照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當天開始給藥治療，連續(xù)治療5 d。并于給藥治療后，每天對各組小鼠進行稱重，記錄小鼠的發(fā)病率、體重、存活數(shù)，連續(xù)記錄14 d。

1.3.2 肺指數(shù)及肺臟中的病毒滴度變化 將120 只

BALB/c 小鼠隨機分為6 組，分組方式如前所述，每組20 只。除空白對照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當天開始給藥治療，連續(xù)治療5 d。各組分別于感染后第3、5、7 天隨機取5 只小鼠，記錄體重。采集小鼠肺臟，稱重，計算肺指數(shù)（肺指數(shù)=肺臟重量/小鼠體重）。之后，將采集得到的小鼠肺臟組織分成3 部分，第一部分用于研磨、勻漿后測定其病毒滴度（TCID50），病毒滴度（TCID50）采用Reed-Muench 法計算；第二部分用于觀察病理組織學(xué)變化；第三部分用于提取RNA，并進行細胞因子相關(guān)mRNA 表達水平的測定。

1.3.3 肺組織病理變化 將上述所采集到的小鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中進行固定，至少24 h。之后，使用石蠟包埋組織樣品，并將樣品切成4 mm厚的切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織樣品的病理變化。

1.3.4 血液指標的變化 各組分別于感染后第3、5、7 天隨機取5 只小鼠，在采集肺臟之前，于全麻狀態(tài)下采集小鼠EDTA 抗凝血液。EDTA 抗凝血液用于血常規(guī)檢測，按照全自動血細胞分析儀的說明書，對采集的小鼠血液進行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果分析不同組小鼠的血細胞差異。

1.3.5 肺臟中細胞因子相關(guān)mRNA 表達水平變化

對于細胞因子的檢測，同樣使用上述所采集得到的小鼠肺組織。根據(jù)Simply P 總RNA 提取試劑盒提供的方法提取小鼠肺組織的總RNA，之后使用Prime ScriptTMRT試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。然后使用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix 試劑盒，利用染料法qPCR 測定小鼠肺組織中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的mRNA表達水平，所有操作均嚴格按照試劑盒的說明書進行。目標基因所需的引物均由吉林省庫美生物科技有限公司合成，各特異性引物的序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

qPCR 在ABI 7500 快速實時PCR 系統(tǒng)上進行。擴增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。肺組織中各細胞因子的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算得到。

1.3.6 血清中細胞因子表達水平變化 各組分別于感染后第3、5、7 天隨機取5 只小鼠，在采集肺臟之前，全麻狀態(tài)下采集小鼠普通非抗凝血液。普通非抗凝血液用于收集血清。根據(jù)試劑盒的操作要求，測定各血清樣本中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗所得數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行分析統(tǒng)計。組間比較通過單因素方差分析（ANOVA）評估統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05 時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料表示為平均值±標準差（±SD）。差異顯著性標志按照如下方式表示。

與空白對照組相比：###P＜0.001，##P＜0.01；與病毒對照組相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 角茴香對流感病毒感染小鼠的保護作用

連續(xù)14 d 觀察和記錄6 組小鼠（NC 組、VC 組、OS 組、HL-L 組、HL-M 組和HL-H 組）的發(fā)病率、存活率和體重變化情況，以確定HL 對IAV 感染小鼠的保護作用（圖1）。

圖1 角茴香對流感病毒感染小鼠的保護作用Fig.1 Protective effect of HL on influenza virus-infected mice

在整個研究觀察期間，HL-H 組小鼠的表現(xiàn)反映出了良好的保護作用。在感染后第1 天，病毒對照組開始出現(xiàn)臨床癥狀，如活動量減少，皮毛豎起，呼吸急促。而奧司他韋對照組和HL-H 組分別在病毒對照組開始出現(xiàn)臨床癥狀的2 d 和3 d 后才出現(xiàn)臨床癥狀。相比于病毒對照組，HL-L 組和HL-M 組也延遲了臨床癥狀的出現(xiàn)時間。

病毒對照組小鼠在感染后第4天開始出現(xiàn)死亡，到第10 天全部死亡。而奧司他韋對照組和HL-H 組分別在感染后第5 天和第6 天開始出現(xiàn)死亡，直到觀察期結(jié)束，小鼠仍有存活，保護率為60%。HL-M組和HL-L 組也減少了流感病毒感染小鼠的死亡數(shù)量，保護率分別為50%和30%。

空白對照組小鼠在整個試驗期間，體重呈上升趨勢。病毒對照組小鼠在存活期間，體重持續(xù)下降，下降幅度約為20%。奧司他韋對照組和3 個治療組（HL-L 組、HL-M 組和HL-H 組）的小鼠體重呈現(xiàn)先降后升的趨勢，體重損失均小于病毒對照組。

2.2 小鼠肺臟中的病毒滴度及肺指數(shù)的變化

測定不同時間點小鼠肺部的病毒滴度和肺指數(shù)，以研究HL 對IAV 感染小鼠肺部的保護作用，結(jié)果如下（圖2 和圖3）。在感染后第5 天，病毒對照組的病毒滴度和肺指數(shù)均顯著高于空白對照組。與病毒對照組相比，奧司他韋對照組和3 個治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的肺指數(shù)和病毒滴度均有不同程度的降低，其中，奧司他韋對照組和HL-H組的降低程度最為明顯。這說明HL-H 和奧司他韋對IAV 感染小鼠肺部的保護作用較為突出。

圖2 感染后不同時間的小鼠肺部病毒滴度Fig.2 Lung virus titers in mice at different times after infection

圖3 感染后不同時間的小鼠肺指數(shù)Fig.3 Lung indiex of mice at different times after infection

在感染后的第3 天和第7 天，各組變化趨勢與感染后第5 天大致相同，但變化程度均沒有感染后第5 天明顯。

2.3 HL 對IAV 感染小鼠肺部炎癥的抑制作用

由小鼠感染后不同時間點的肺臟中病毒滴度及肺指數(shù)變化可知，在小鼠感染后第5 天，HL 各治療組有著最佳的治療效果。對感染后第5 天的各組小鼠肺部進行HE 染色，其組織學(xué)變化如下（圖4）。

圖4 對小鼠肺部的病理觀察（200×）Fig.4 Pathological observation of the lung in mice

空白對照組小鼠肺部無明顯病理變化，而病毒對照組小鼠肺部出現(xiàn)明顯的肺泡壁增厚（綠色箭頭）、炎性細胞浸潤（紅色箭頭）、上皮細胞壞死（黑色箭頭）等病理損傷現(xiàn)象。而奧司他韋和HL 可以顯著改善這些組織損傷。HL-H 組和奧司他韋對照組的肺部損傷減少最為明顯，對肺部炎癥反應(yīng)的抑制作用最強。

2.4 HL 對IAV 感染小鼠血液指標的改善

對感染后第5 天的各組小鼠進行血常規(guī)檢測，結(jié)果如下（圖5）。與空白對照組相比，病毒對照組的4 種血細胞水平均顯著下降。相較于病毒對照組，奧司他韋對照組和3 個治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的4 種血細胞均有所上升，其中，奧司他韋對照組和HL-H 組的上升最為顯著。

圖5 血常規(guī)檢測結(jié)果Fig.5 Routine blood results of mice

2.5 細胞因子的表達水平

2.5.1 肺組織中細胞因子相關(guān)mRNA 表達水平 本研究對感染后第5 天的小鼠肺組織中細胞因子相關(guān)mRNA 的表達水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和血清中細胞因子的表達水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）進行了檢測。

小鼠肺組織中的細胞因子相關(guān)mRNA 表達水平如圖6 所示，病毒對照組的TNF-α、IL-1β 和IL-6均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。而奧司他韋對照組和3 個治療組（HL-L、HL-M、HL-H）能有效抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 的升高，其中奧司他韋對照組和HL-H 組的效果最為明顯。

圖6 角茴香醇提顆粒對小鼠肺部細胞因子相關(guān)mRNA 表達的影響Fig.6 Effect of HL on cytokine-related mRNA expression in mouse lung

2.5.2 血清中細胞因子表達水平 血清中細胞因子的表達水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）如圖7所示。病毒對照組小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達水平明顯高于空白對照組。而與病毒對照組相比，奧司他韋對照組和3 個治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達都受到了不同程度的抑制，其中奧司他韋對照組和HL-H 組對血清中細胞因子的抑制作用最為明顯。

圖7 角茴香對小鼠血清細胞因子表達的影響Fig.7 Effect of HL on cytokine expression in mouse serum

3 結(jié)論與討論

甲型流感病毒（IAV）可在人和動物中引起季節(jié)性或大流行性流感，始終威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全［2］。IAV 可以通過抗原漂移、基因重組等方式不斷進化和變異，進而形成新的耐藥毒株［17］。目前針對IAV 的藥物治療，主要包括美國食品和藥物管理局（FDA）批準的兩類抗流感藥物：神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAIs）如奧司他韋和M2 通道阻斷劑，但后者卻已經(jīng)因普遍耐藥而停止使用［18-19］。同時，病毒表面抗原的不斷變化也常常是造成大流行的主要原因［20］。因此，新型抗流感藥物的研發(fā)及抗病毒相關(guān)機制的研究是十分必要的。

角茴香作為一種傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等多種功能，可用于治療多種疾病如感冒、肺炎、肝炎、膽囊炎等［21］。本研究中，角茴香醇提顆粒表現(xiàn)出了對小鼠體內(nèi)IAV 的明顯抑制作用，并對流感病毒感染小鼠有著顯著的保護作用。流感病毒感染小鼠在經(jīng)過角茴香醇提顆粒劑的治療后，發(fā)病時間推遲，存活率升高，體重損失減少。同時，角茴香醇提顆粒對小鼠的保護作用與濃度有關(guān)。分析結(jié)果可知，隨著角茴香醇提顆粒治療劑量的增加，小鼠的保護率隨之增加。高濃度角茴香醇提顆粒劑對流感病毒感染小鼠的治療效果與陽性對照藥物奧司他韋相當。角茴香醇提顆粒劑在降低小鼠肺部病毒滴度的同時，也減輕了IAV 對小鼠肺臟的病理損害和IAV導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，在急性肺損傷的治療中發(fā)揮了作用。

動物機體在受到IAV 感染后，體內(nèi)的細胞因子水平會產(chǎn)生一定的變化，當細胞因子過度表達時，過多的促炎細胞因子則會導(dǎo)致形成不受機體控制的細胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致肺臟及其他器官的損傷、全身炎癥，甚至死亡［22］。調(diào)節(jié)細胞因子的表達水平是治療流感病毒感染的重要手段［5］。細胞因子的過度釋放——細胞因子風(fēng)暴與病毒性肺炎常常是引起重癥流感患者呼吸系統(tǒng)損傷與死亡的重要原因［23］。盡管細胞因子在抑制病毒復(fù)制方面是必不可少的，但某些促炎細胞因子不受控制的表達，會加劇疾病的發(fā)展和機體的損傷［5,24］。機體感染IAV后，TNF-α、IL-1β 和IL-6 是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度的關(guān)鍵細胞因子［1］。TNF-α 的過度表達常常是流感病毒導(dǎo)致肺部病理損害的原因之一［25］。在本研究中，通過RT-qPCR 及ELISA 試驗檢測了各組小鼠體內(nèi)多種細胞因子的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過角茴香醇提顆粒劑的治療后，流感病毒感染小鼠肺臟及血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達水平明顯下降。角茴香醇提顆?？梢灶A(yù)防IAV 感染引起的細胞因子風(fēng)暴。

綜上所述，角茴香醇提顆粒能明顯抑制小鼠體內(nèi)H1N1 亞型IAV 的活性，減輕IAV 引起的肺部病理損傷，緩解肺部的炎癥反應(yīng)。中藥角茴香是一種潛在的新型抗流感病毒藥物。