夏茂甜，趙文植，沈偉祥，董章宏，辛雅萱，李衛(wèi)英，辛培堯

（西南林業(yè)大學 國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心/西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224）

葉綠體是植物細胞中重要的質(zhì)體之一，主要功能是參與光合作用，在植物進化歷史中起著重要作用。葉綠體DNA（cpDNA）通常是1 個大小在107到218 kb 之間變化的環(huán)狀DNA 序列，主要由1 個大的單拷貝（LSC）區(qū)、1 個小的單拷貝（SSC）區(qū)和2 個反向重復（IR）區(qū)組成［1］。20 世紀80 年代，煙草的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)首次被發(fā)現(xiàn)，到現(xiàn)在越來越多的植物葉綠體基因組被深度挖掘。葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量和組成上高度保守，而且分子進化緩慢、重組率低，在植物進化、物種鑒定、群體遺傳多樣性及基因定位等方面有著重要的應用［2-3］。

密碼子作為連接核酸和蛋白質(zhì)的紐帶，是核酸信息輸出的重要環(huán)節(jié)［4］。有些密碼子比其他密碼子更頻繁地用于mRNA 轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)的翻譯過程中，這種同義密碼子的不平等使用被稱為“密碼子使用偏好”［5］。密碼子使用偏好廣泛存在于各種基因組中，其偏好程度在物種和相同基因組不同基因之間會有所差異［6］。同義密碼子使用偏好是基因組中一個重要的進化特征，反映了物種或基因的起源、進化和突變方式，同時也是促進植物進化的重要力量，為生物進化、基因功能、外源基因表達、轉(zhuǎn)基因和引物的設(shè)計等研究提供了重要信息［7-8］。影響密碼子使用偏好的因素有很多，其中最主要的因素是突變壓力和自然選擇，除此之外，還與基因表達水平、同義替換率、GC 含量、tRNA 豐度、翻譯起始位點等因素有關(guān)［6,9］。

銹毛莓（Rubus reflexusKer.）為懸鉤子屬（Rubus）植物，其果實鮮嫩多汁，營養(yǎng)豐富；根莖可入藥，有抗菌消炎、止血鎮(zhèn)痛的作用，特別在治療肝臟損傷方面頗有療效；莖皮、根皮也是提煉栲膠的重要來源［10］。目前對銹毛莓的研究主要集中在化學成分［10］、提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性［11］、藥理機制［12］等方面，而關(guān)于葉綠體基因組方面的研究尚未有報道。本研究對銹毛莓葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征、密碼子使用偏好和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了分析，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對銹毛莓及近緣物種進行葉綠體基因組序列全長比較分析及高變區(qū)的篩選，其研究結(jié)果可為懸鉤子屬物種鑒定以及銹毛莓及懸鉤子屬遺傳學研究打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 DNA 提取、測序、組裝和注釋

以銹毛莓新鮮幼葉為試驗材料，參照徐玉芬［13］的方法，對DNA 進行提取和檢測，將質(zhì)量符合要求的樣品送至北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司進行文庫構(gòu)建，并利用Illumina NovaSeq 平臺測序，使用GetOrganelle 軟件對測序數(shù)據(jù)進行拼接及組裝。銹毛莓葉綠體基因組的注釋工作通過 Geneious 8.1.3.軟件來完成，并將注釋結(jié)果提交至薔薇科葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫 (https://lcgdb.wordpress.com/category/rosaceae/)，登錄號：LAU10052。

1.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征分析

通過在線網(wǎng)站OGDRAW（http://ogdraw.mpimpgolm.pg.de）繪制銹毛莓葉綠體全基因組圖譜。利用Geneious 8.1.3.軟件對注釋好的銹毛莓葉綠體基因組的基本特征進行分析，計算銹毛莓葉綠體基因組的全長、總GC 含量，以及LSC、SSC 和IR 區(qū)的序列長度和GC 含量，統(tǒng)計注釋出的基因數(shù)量、名稱和種類，同時對有拷貝和內(nèi)含子的基因進行標注。

1.3 密碼子相關(guān)參數(shù)計算

根據(jù)注釋結(jié)果，手工篩選出53 條CDS 序列，通過Codon W1.4.2 軟件和在線CUSP（http://emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）計算各CDS 中有效密碼子數(shù)（ENC），密碼子第1/ 第2/第3 位GC 含量(GC1/GC2/GC3)和總的GC（GCall）含量，各參數(shù)之間的相關(guān)性分析通過SPSS 完成。

1.4 密碼子使用偏好分析

參照Sueoka［14］提供的方法，在GC12（GC1和GC2的平均值)和GC3之間繪制中性圖。

ENC-plot 分析能反映各基因密碼子使用偏好與堿基成分之間的關(guān)系。以GC3（密碼子第3 位的G和C 含量占基因堿基總數(shù)的比例）為橫坐標，ENC為縱坐標作圖，并添加ENC 值的標準曲線［5］。

PR2-plot 分析是為了研究密碼子第3 位置4 個堿基的組成，以判斷第3 位堿基間的突變是否會對密碼子使用偏好造成影響。分別以G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)為橫縱坐標進行作圖。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以2 個路邊青屬（Geum）物種（Geum rupestre和Geum macrophyllum）作為外類群，選擇銹毛莓（R.reflexus）和從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的懸鉤子屬45 條葉綠體基因組序列，首先用MAFFT 軟件對其進行序列比對并手工校正矩陣，再用IQ-Tree軟件進行計算，通過最大似然法（ML）進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.6 序列全長比較分析及高變區(qū)篩選

基于系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，選取與銹毛莓親緣關(guān)系相近的15 個懸鉤子屬物種，以銹毛莓葉綠體基因組注釋信息為參考序列，通過mVISTA 在線網(wǎng)站（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml），選 擇Shuffle-LAGAN 模式，進行葉綠體基因組差異分析。

為進一步了解懸鉤子屬葉綠體基因組之間的變異情況，以用于建樹46 條的葉綠體基因組序列為數(shù)據(jù)，構(gòu)建多序列矩陣，通過DnaSP6 軟件對矩陣進行核苷酸多態(tài)性（Nucleotide diversity, Pi）分析，并篩選出Pi 最高的片段作為變異區(qū)。

2 結(jié)果分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

銹毛莓葉綠體基因組具有高度保守的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)（圖1），大小為156 247 bp，包括85 856 bp 的LSC 區(qū)、18 849 bp 的SSC 區(qū) 和25 771 bp 的（IR）區(qū)。GC 總含量為30.72%（LSC，35.1%；SSC，31.2%；IR，42.8%），共注釋出129 個基因，包括85 個蛋白質(zhì)編碼基因、36 個tRNA 基因，8 個rRNA 基因，其中16 個基因有兩個拷貝，9 個基因有內(nèi)含子，其中rps12和ycf3基因有2 個內(nèi)含子，ndhA、ndhB、petB、rpl2、rpl16、rps16、rpoC1基因有1 個內(nèi)含子（表1）。

表1 銹毛莓葉綠體全基因組基因信息Table 1 Information of the annotated genes in the chloroplast genome of R. reflexus

圖1 銹毛莓葉綠體基因組圖譜Fig.1 The gene map of R. reflexus

2.2 銹毛莓葉綠體基因組密碼子組成及相關(guān)指標分析

各蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第1、第2 和第3 位GC 含量分別為46.49%、39.47%、29.09%，其大小順序為GC1＞GC2＞GC3，大部分基因的GC1含量高于GC2和GC3含量，基因GCall含量為38.58%，說明密碼子中A、U(T)含量相對較高（表2）。

對影響密碼子使用偏好相關(guān)參數(shù)之間進行相關(guān)性分析（表3），密碼子GC1和GC2之間有極顯著相關(guān)性（P＜0.01），ENC 與密碼子GC2與 GC3之間極顯著相關(guān)（P＜0.01），密碼子數(shù)（N）與密碼子與GC1、GC2、GC3之間無相關(guān)性，說明序列長度對密碼子使用偏好無影響。

表3 影響銹毛莓葉綠體基因組密碼子使用偏好指標之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between indicators affecting the preference of chloroplast codon use in the chloroplast genome of R. reflexus

2.3 密碼子使用偏好分析

2.3.1 中性繪圖分析 銹毛莓葉綠體基因組中GC3含量介于0.214～0.367 之間，GC12含量介于0.322～0.536 之間，GC 含量分布范圍狹窄，相關(guān)性系數(shù)r為0.223，相關(guān)性較弱，線性回歸系數(shù)（趨勢線斜率）代表了突變壓力，為 0.323 9＜0.5，說明突變壓力在銹毛莓葉綠體基因組中所占百分比不足50%，密碼子使用偏好受自然選擇的影響更大（圖2）。

圖2 中性繪圖分析Fig.2 Neutrality plot analysis

2.3.2 ENC-plot 分析 少數(shù)基因沿著標準曲線分布或分布在曲線上，多數(shù)基因分布在曲線下方，說明大部分基因密碼子具有很強的使用偏性（圖3）。僅有突變壓力決定密碼子使用偏好時，基因才會全部位于曲線上。表明銹毛莓葉綠體基因組密碼子使用偏好受到突變壓力和自然選擇的雙重控制，但自然選擇對其影響更大。

圖3 ENC-plot 繪圖分析Fig.3 ENC-plot analysis

2.3.3 PR2-plot 分析 各基因散布在4 個象限，大部分落在下方（圖4）。說明銹毛莓葉綠體基因組中A/T 和G/C 的密碼子使用偏好是不平衡的，且頻率大小為G＞C，T＞A，表明突變壓力和自然選擇對密碼子使用偏好都有影響，只是自然選擇所占比重更大。

圖4 PR2-plot 分析Fig.4 Analysis of PR2-plot

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

懸鉤子屬系統(tǒng)發(fā)育樹被分為4 大分支，每個分支具有較高的自展值（Bootstrap, BS），較好區(qū)分了懸鉤子屬的組間關(guān)系（圖5）。

圖5 基于46 條懸鉤子屬葉綠體基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship based on the 46 sequences in the chloroplast genome of Rubus

其 中（R.hybride）單 獨 為 一 支，也 是 最先分化的一支，其次分化的是以燪葉懸鉤子（R.parviaraliifolius）為代表的空心莓組（自展值100），共10 個種，緊接分化的是以蛇泡筋（R.cochinchinensis）為代表的木莓組（自展值100），共16 種，最后分化一支是以空心泡（R.glandulosopunctaus）為代表的空心莓組（自展值100），共18 種。其中蛇泡筋（R.cochinchinensisTratt）、粗葉懸鉤子（R.alceifolius）、棕紅懸鉤子（R.rufus）、厚葉懸鉤子（R.crassifolius）、高粱泡（R.lambertianus）和光滑高粱泡（R.lambertianusvar.glaber）聚為一支，與銹毛莓（R.reflexus）具有共同的祖先，兩者互為姐妹群。銹毛莓（R.reflexus）與黃脈莓（R.xanthoneurus）、高粱泡（R.lambertianus）親緣關(guān)系較近。

2.5 葉綠體基因組全長比較分析及高變區(qū)篩選

16 條懸鉤子屬植物葉綠體基因組序列相似度很高，盡管發(fā)現(xiàn)了幾個不同的區(qū)域，但懸鉤子屬植物的葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)和進化是保守的，序列變異主要集中在保守非編碼序列（CNS，conserved noncoding sequences），即基因間隔區(qū)，如accD-psal、atpE-trnV-UAC-ndhC、rpl32-trnL-UAG等（圖6）。

圖6 以銹毛莓葉綠體基因組為參照的16 條懸鉤子屬植物葉綠體基因組序列可視化對比Fig.6 Visualization and comparison of 16 sequences in the chloroplast genome of Rubus with R. reflexus chloroplast genome

46 條懸鉤子屬葉綠體基因組序列的核苷酸多態(tài)性（Pi）值范圍在0～0.042 86 之間，平均Pi 值為0.009 1，以Pi 值0.03 為界，共篩選出6 個高變異區(qū)域，包括rps16-trnQ-UUG、petN-psbM、trnTUGU-trnL-UAA、petA-psbJ、rpl32-trnL-UAG、ycf1基因及基因間隔區(qū)，其中4 個位于LSC 區(qū)，2 個位于SSC 區(qū)（圖7）。

圖7 46 條懸鉤子屬葉綠體基因組序列核苷酸多態(tài)性（Pi）分析Fig.7 Nucleotide polymorphism analysis of 46 sequences in the chloroplast genome of Rubus

3 討論

銹毛莓葉綠體基因組全長為156 247 bp，結(jié)構(gòu)由LSC 區(qū)、SSC 區(qū)和一對IR 區(qū)組成，其基因組結(jié)構(gòu)與已報道同為懸鉤子屬的高粱泡（R.lamberti-anus）［15］（156 266 bp）和 菰 帽 懸 鉤 子（R.pileatus）［13］（156 464 bp）相似，均為四分體結(jié)構(gòu)，大小相差在1 kb 之內(nèi)，符合絕大多數(shù)植物葉綠體基因組大小為107 到218 kb 的結(jié)果［1］。GC 總含量為30.72%，其中IR 區(qū)GC 含量最高，作為分子進化的重要標志，IR 區(qū)具有高GC 含量，使得序列穩(wěn)定且高度保守［16］。

密碼子是蛋白質(zhì)編碼基因重要組成成分，在中心法則翻譯過程中扮演著至關(guān)重要的角色，而對編碼同一氨基酸的密碼子（同義密碼子）的使用特征研究也是近年來的研究熱門。葉綠體基因組中GC含量是判斷密碼子使用偏好的重要特征［5］。銹毛莓葉綠體基因組中GC 總含量不高，密碼子偏好使用以A/U 結(jié)尾的密碼子，這與懸鉤子屬的高粱泡（R.lambertianusr）［15］、插 田 泡（R.coreanusi）和 光滑高粱泡（R.lambertianusvar.glaber）［17］密碼子偏好模式一致，同時也符合雙子葉植物基因組密碼子偏好A/T(U)結(jié)尾的結(jié)果［18］。造成這種結(jié)果的原因可能是G/C 堿基氮原子數(shù)高于A/T 堿基，而富含A/T 的堿基在突變時會消耗的能量更多，所以產(chǎn)生了堿基的偏好性［19］。

解釋密碼子使用偏好最具代表性的理論之一是選擇-突變-漂移［20］。本研究綜合分析發(fā)現(xiàn)，突變壓力和自然選擇共同決定了銹毛莓葉綠體基因組密碼子使用偏好，但自然選擇占主導作用，這與杧 果（Mangifera indica）［21］、蒜 頭 果（Malania oleifera）［22］、高粱泡（R.lambertianus）［15］等結(jié)果一致，表明不同物種決定密碼子使用偏好模式的因素可能相同。密碼子第3 位堿基使用頻率大小為T＞A，G＞C，而澳洲堅果（Macadamia integrifolia）［5］和香花枇杷（Eriobotrya fragrans）［23］堿基的使用頻率為G ＜C，與本研究結(jié)果不同，表明物種或不同的編碼蛋白基因間密碼子第3 位堿基使用頻率會有所差別，進而造成密碼子使用偏好也會有差異。

基于完整的葉綠體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各支的支持率比基于葉綠體基因組片段rpl20-rps12［24］和ndhF［25］序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹高，更能準確、全面評估懸鉤子屬的系統(tǒng)進化關(guān)系，空心莓組位于系統(tǒng)發(fā)育樹基部，說明原始程度高。從整個系統(tǒng)進化樹來看，空心莓組的分支最多，其次是木莓組，空心莓組進化方向多，表現(xiàn)為多系進化，這與Alice［26］、張麗［25］、趙文植［15］等結(jié)果一致。在基于ndhF［25］序列的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，棕紅懸鉤子（R.rufus）、光滑高粱泡（R.lambertianus var.glaber）與銹毛莓（R.reflexus）聚為一支且互為平行關(guān)系，由于ndhF序列信息位點有限，它們之間的系統(tǒng)關(guān)系并沒有得到很好的解決，而本研究結(jié)果顯示，棕紅懸鉤子（R.rufus）和光滑高粱泡（R.lambertianusvar.glaber）各自聚為一支，兩者的共同祖先與銹毛莓親緣關(guān)系密切，由此可見，質(zhì)體基因組系統(tǒng)學能提高懸鉤子屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育分辨率。另外空心莓組的掌葉懸鉤子（R.pentagonus）和矮生莓組的梳齒懸鉤子（R.pectinaris）鑲嵌在木莓組中，這與徐玉芬［13］、趙文植［15］等結(jié)果一致，其原因可能是木莓組和矮生莓組由空心莓組進化而來。

對16 條懸鉤子屬葉綠體基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn)，LSC 區(qū)、SSC 區(qū)的變異程度明顯高于IR 區(qū)，表明IR 區(qū)保守性更好，而對46 條懸鉤子屬葉綠體基因組序列核苷酸多態(tài)性分析也進一步驗證了這個結(jié)果，并篩選出6 個高變異區(qū)域，包括rps16-trnQUUG、petN-psbM、trnT-UGU-trnL-UAA、petApsbJ、rpl32-trnL-UAG及ycf1，這與徐玉芬［13］定位到的部分高變異區(qū)域一致。經(jīng)矩陣檢查后發(fā)現(xiàn)，rps16-trnQ-UUG、petN-psbM和trnT-UGU-trnLUAA高變異區(qū)域中存在較多的插入和倒位，這可能是導致其核苷酸多態(tài)性值偏高的主要原因，而petApsbJ、rpl32-trnL-UAG和ycf1高變異區(qū)域則并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，且這三個區(qū)域變異位點較多，因此可考慮將其作為鑒別懸鉤子屬內(nèi)物種的DNA 條形碼候選片段。此次篩選出的高變異區(qū)域可為快速、準確的鑒別懸鉤子屬物種提供更多的數(shù)據(jù)支撐。