段榮清，厲柳岑，湯旗，梅蕾，沈耀

溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（生命科學(xué)學(xué)院），浙江 溫州 325035

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤之一，也是最具侵襲性和最致命的腦腫瘤，分為不同的級(jí)別和組織學(xué)亞型[1]。流行病學(xué)表明膠質(zhì)瘤發(fā)生在各個(gè)年齡段，但以成年人多見，男性比女性更容易患病[2]。 目前，膠質(zhì)瘤的治療主要通過手術(shù)切除和輔助放化療。膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞向周圍正常組織明顯侵襲性和浸潤(rùn)增殖大大降低了治療效果，導(dǎo)致患者預(yù)后惡化，5年病死率超過90%[3-5]。肌肽是一種天然存在的二肽，廣泛分布在肌肉、大腦等可興奮組織中，具有多種有益作用，包括抗氧化、抗糖化、離子螯合劑、傷口愈合促進(jìn)劑和自由基清除劑[6]。研究[7]表明，肌肽具有抑制體內(nèi)惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的潛力，被視為潛在的抗癌藥物。為了明確肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤的抗腫瘤作用，本研究探討了常氧和低氧條件下肌肽對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響及其潛在的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87分別購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心和中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM購自美國(guó)Gibco公司；FBS購自澳洲CLARK公司；L-Glutamine（100×）和青霉素-鏈霉素（100×）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。U251和U87細(xì)胞均在補(bǔ)充有10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。用DMEM溶解肌肽并配置成500 mmol/L的溶液。細(xì)胞樣本分為常氧組、常氧+肌肽組、低氧組、低氧+肌肽組。常氧和低氧組加入適量完全培養(yǎng)基后分別放入常氧培養(yǎng)箱（21% O2、5% CO2、37 ℃）和低氧培養(yǎng)箱（1% O2、5% CO2、 37 ℃）中繼續(xù)培養(yǎng)。常氧+肌肽組和低氧+肌肽組根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需肌肽濃度加入藥物，然后加入適量完全培養(yǎng)基后分別放入常氧培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器肌肽購自中國(guó)生工生物科技公司；MTT粉末購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。一抗試劑包括：c-Myc（1:1000，美國(guó)Abcam公司），L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（L-type amino acid transporter 1, LAT1）（1:1000，美國(guó)Affinity公司），β-actin（1:1000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。儀器主要包括酶標(biāo)儀Varioskan flash（美國(guó)賽默飛公司）、流式細(xì)胞儀CytoFLEX（美國(guó)貝克曼公司）、超高效液相 Acquity UPLC H-Class/Acquity UPLC IClass（美國(guó)Waters公司）、高分辨質(zhì)譜Xevo-G2-XS QTOF（美國(guó)Waters公司）、低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、Milli-Qs超純水儀（德國(guó)Merck Millipore公司）、二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）、Galaxy 170R CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞以2×103的密度接種在96孔板中，然后用不同濃度的肌肽（25 mmol/L和 50 mmol/L）處理細(xì)胞72 h。接下來向每孔加入 100 μL 5 g/L MTT溶液，將板放置在37 ℃下孵育4 h，棄掉上清液后加100 μL DMSO溶液溶解甲臜結(jié)晶。最后使用酶聯(lián)免疫吸附儀在570 nm處測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度。MTT實(shí)驗(yàn)表明，與25 mmol/L相比， 50 mmol/L肌肽處理后細(xì)胞活力變化更顯著，細(xì)胞狀態(tài)還可以，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更明顯，所以確定用50 mmol/L肌肽進(jìn)行研究。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞以每孔300個(gè)的密度接種于6孔板中，待貼壁后用50 mmol/L肌肽處理細(xì)胞。每隔3～4 d換1次液，連續(xù)培養(yǎng)至形成肉眼可見的克隆團(tuán)。用PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫溶液染色樣品后計(jì)數(shù)克隆團(tuán)。

1.5 Annexin/PI凋亡實(shí)驗(yàn)將約6×105個(gè)細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，用50 mmol/L肌肽處理72 h，然后按照試劑盒手冊(cè)方案KGA-108（南京凱基生物科技公司）通過流式細(xì)胞術(shù)觀察和檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 非靶向代謝組學(xué)用肌肽處理U251細(xì)胞72 h后，0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞3次后，離心去除上清液。樣品液氮急劇冷凍后迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，收集常氧組、常氧+肌肽組共12個(gè)樣本送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行分析。

1.7 LC-MS法檢測(cè)蛋氨酸水平變化用有機(jī)試劑提取代謝樣品，然后從每個(gè)樣品中吸取20 μL混合制成QC樣品。使用孔徑為0.22 μm PTFE膜過濾上清液，然后裝入2 mL琥珀色色譜瓶中（帶250 μL內(nèi)套管），擰緊蓋子，排出內(nèi)套管中的氣泡。Acquity UPLC H級(jí)/Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀配備了QSM四元系統(tǒng)和BSM二元系統(tǒng)，F(xiàn)TN自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣器。設(shè)置以下所有參數(shù)，T3柱溫為40 ℃，酰胺柱溫為45 ℃，進(jìn)樣盤溫度為10 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL。

1.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法將肌肽處理細(xì)胞72 h（課題組前期研究選擇了24、48、72 h 3個(gè)處理時(shí)間，發(fā)現(xiàn)作用72 h既能顯著抑制細(xì)胞增殖，也不會(huì)過度損傷而影響后續(xù)各項(xiàng)檢測(cè)）后提取總蛋白，通過BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Western blot。使用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在5%脫脂牛奶中緩慢搖動(dòng)2 h，一抗中4 ℃孵育過夜，在二抗山羊抗兔抗體（1:1000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）孵育1 h。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑BeyoECL Plus（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）和凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）曝光條帶。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR將2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔板中，用肌肽處理72 h后提取總RNA。接下來采用Nanodrop儀器（Nanodrop 2000 Technologies） 檢測(cè)RNA濃度。使用合成cDNA HiScript II Q RT SuperMix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR在CFX96熒光定量PCR儀器（美國(guó)Bio-Rad公司）中進(jìn)行。所用引物的序列如下：c-Myc上游引物5’-GTCAAGAGGCGAAC ACACAAC-3’，下游引物5’-TTGGACGGACAGGATAT-3’；LAT1上游引物5’-ATATCACGCTGCTCAACGGTG-3’，下游引物5’-CTCCAGCATGTAGGCGTAGTC-3’；GAPDH上游引物5’-CACCATGAAGATCAAGATCATTGC-3’，下游引物5’-GG CCGGACTCATCGTACTCCTGC-3’。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用Graphpad prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間的比較用t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法；多元統(tǒng)計(jì)分析采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響在常氧和低氧條件下，用不同濃度的肌肽（25 mmol/L、 50 mmol/L）處理U251和U87細(xì)胞72 h后，U251、U87細(xì)胞常氧+肌肽組與常氧組比細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；低氧+肌肽組與低氧組比，細(xì)胞活力也顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；并且肌肽濃度越高，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

2.2 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響在常氧和低氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251和U87細(xì)胞后，U251、U87細(xì)胞常氧+肌肽組與常氧組比克隆團(tuán)數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；低氧+肌肽組與低氧組比克隆團(tuán)數(shù)也顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。50 mmol/L 肌肽處理后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力明顯受到抑制，見圖2。

2.3 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響在常氧和低氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251細(xì)胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比，凋亡細(xì)胞比例上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低氧+肌肽組與低氧組比，凋亡細(xì)胞比例也上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。這表明肌肽促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

圖3 肌肽對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

2.4 肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝的影響PCA圖顯示常氧+肌肽組與常氧對(duì)照組分離趨勢(shì)明顯，見圖4A；PLS-DA提示模型穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)差異物的尋找與分析，見圖4B。用火山圖和熱圖表示差異分析結(jié)果，火山圖和熱圖提示肌肽作用后代謝物存在顯著性差異，見圖4C、圖4D。50 mmoL/L肌肽處理U251細(xì)胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比，部分代謝物含量發(fā)生變化，賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、鞘氨醇、煙酰胺單核苷酸的含量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4E。

圖4 肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝的影響

2.5 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋氨酸水平的影響在常氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251細(xì)胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比蛋氨酸含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 肌肽對(duì)U251細(xì)胞蛋氨酸水平的影響

2.6 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞c-Myc表達(dá)的影響與常氧組或低氧組比，常氧+肌肽組和低氧+肌肽組的c-Myc蛋白和mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明肌肽從轉(zhuǎn)錄水平上影響c-Myc的表達(dá)，見圖6。

圖6 肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞c-Myc表達(dá)的影響

2.7 肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞LAT1表達(dá)的影響與常氧組或低氧組比，肌肽處理組下調(diào)了U251細(xì)胞LAT1蛋白和mRNA的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但肌肽對(duì)U87細(xì)胞LAT1蛋白的表達(dá)無影響（P＞0.05），見圖7。

圖7 肌肽對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LAT1表達(dá)的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦腫瘤疾病，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病變，其主要特征是廣泛的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和新生血管形成[8]。目前膠質(zhì)瘤的治療成功率和總生存率仍較低，臨床上治療膠質(zhì)瘤具有一定的挑戰(zhàn)性[9]，因此積極尋求新的治療策略和藥物對(duì)改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后變得尤為重要。

近年來，肌肽的廣譜抗癌作用引起了研究人員的關(guān)注[10]。越來越多的研究表明，肌肽具有抑制體內(nèi)惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的潛力。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，肌肽能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解[7，11]。因此，肌肽被認(rèn)為可能是治療惡性膠質(zhì)瘤或其他腫瘤的潛在藥物[12]。

本研究探索了常氧和低氧條件下肌肽對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響及潛在分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度肌肽作用后，不論是常氧還是低氧狀態(tài)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力受到明顯抑制，具有一定的濃度依賴性。這提示肌肽可能同時(shí)作用于線粒體氧化代謝途徑和糖酵解途徑從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的潛能。肌肽還抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力。細(xì)胞凋亡指的是為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的程序性死亡。凋亡進(jìn)程的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要變化之一[13]，研究表明肌肽促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而起到抗腫瘤作用。

過去十年中，在癌細(xì)胞代謝領(lǐng)域的研究揭示了代謝改變與癌癥進(jìn)展之間的聯(lián)系[14]。為了探索肌肽作用后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的代謝變化情況，進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)肌肽導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的氨基酸水平發(fā)生變化，部分必需氨基酸包括蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸的含量下調(diào)。WANDERS等[15]研究證明限制蛋氨酸可以選擇性地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，LC-MS實(shí)驗(yàn)也表明肌肽使膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋氨酸含量下調(diào)，這與代謝組學(xué)結(jié)果一致。豐富的氨基酸供應(yīng)對(duì)于癌癥維持其增殖驅(qū)動(dòng)力很重要[16]。這些結(jié)果均提示肌肽可能通過影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的氨基酸代謝從而抑制細(xì)胞增殖來發(fā)揮抗癌作用。

c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在大多數(shù)人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可調(diào)控全局基因表達(dá)并協(xié)調(diào)多種生理過程，包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞周期，代謝和凋亡等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)肌肽能夠下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞c-Myc蛋白的表達(dá)，進(jìn)而起到抗癌作用。高度增殖的癌細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求增加，需要選擇性上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其受轉(zhuǎn)錄途徑的調(diào)節(jié)[18]。LAT1運(yùn)輸包含部分必需氨基酸在內(nèi)的大的中性氨基酸，在介導(dǎo)氨基酸攝取中起重要作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及其他細(xì)胞功能[19]。肌肽作用后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的LAT1表達(dá)下調(diào)，限制了部分氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響了細(xì)胞的氨基酸代謝并產(chǎn)生增殖抑制作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肌肽能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，且常氧和低氧條件下的增殖抑制作用沒有顯著差異，這種抑制作用可能與c-Myc/LAT1軸相關(guān)。肌肽影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的氨基酸代謝，進(jìn)而限制腫瘤細(xì)胞的增殖來發(fā)揮抗癌作用。