胡婷 盧詩麗 李鈺穎 劉潔蘭 侯沅林 莫麗梅 唐玉蓮

【摘要】 目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因（transforming growth factor β-induced gene， TGFBI）在頭頸部鱗癌（head and neck squamous carcinoma，HNSC）中的表達及其預(yù)后意義。

方法 首先通過TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析TGFBI基因在泛癌中的表達水平；并進一步利用UALCAN數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索TGFBI基因在HNSC與正常組織中的表達水平，以及TGFBI基因與患者種族、年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等相關(guān)臨床特征的關(guān)系；通過STRING數(shù)據(jù)庫分析TGFBI基因的互作蛋白，借助DAVID數(shù)據(jù)庫對其與互作蛋白基因進行功能富集分析；最后通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TGFBI基因在HNSC中的生存意義。

結(jié)果 發(fā)現(xiàn)TGFBI在HNSC中的表達明顯高于正常組織（P<0.05），TGFBI高表達的患者總生存期明顯低于低表達的患者（P<0.05）。蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1、MMP14、ITGA3、ITGAM、ITGAV、ITGB1、ITGB2、ITGB3、TGIF2和TGIF2LX這10個蛋白基因與TGFBI存在緊密聯(lián)系，此外，TGFBI及相關(guān)基因功能富集分析顯示它們主要參與了5個生物學(xué)程序、4個細胞組分、3個分子功能、4個信號通路。

結(jié)論 TGFBI在HNSC中的表達水平較正常組織明顯升高，且與患者預(yù)后不良有關(guān)，有望成為HNSC診斷和治療的生物學(xué)靶點。

【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因；頭頸部鱗癌；生物信息學(xué)；預(yù)后

中圖分類號：R739.6?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.02.002

Analysis of expression of TGFBI gene in head and neck squamous cell carcinoma and its prognostic significance based on bioinformatics

HU Tinga， LU Shilib， LI Yuyingb， LIU Jielanb， HOU Yuanlinb， MO Limeia， TANG Yulianb

（a. School of Clinical Medicine， b. School of Laboratory Medicine， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the expression of transforming growth factor β-induced （TGFBI） gene in head and neck squamous carcinoma （HNSC） and its prognostic significance.

Methods First， the expression level of TGFBI gene in pan-cancers was analyzed by TIMER2.0 database. Furthermore， UALCAN database and GEPIA database were used to search the expression levels of TGFBI gene in HNSC and normal tissues and the relationship of TGFBI gene with relative clinical characteristics such as race， age， gender， tumor stage and lymph node metastasis status. The interacting proteins of TGFBI gene were analyzed by STRING database， and the functional enrichment analysis was performed on TGFBI gene and its interacting protein genes through DAVID database. Finally， the survival significance of TGFBI gene in HNSC was analyzed through GEPIA database.

Results It was found that the expression level of TGFBI in HNSC was significantly higher than that in normal tissues （P<0.05）， and the overall survival time of patients with high expression level of TGFBI was significantly lower than that of patients with low expression （P<0.05）. Protein interaction analysis showed that there was a close relationship between TGFBI and 10 proteins： FN1， MMP14， ITGA3， ITGAM， ITGAV， ITGB1， ITGB2， ITGB3， TGIF2， and TGIF2LX. In addition， the functional enrichment analysis of TGFBI and related genes showed that they were mainly involved in 5 biological processes， 4 cell components， 3 molecular functions and 4 signal pathways.

Conclusion The expression level of TGFBI in HNSC is significantly higher than that in normal tissues and is related to the poor prognosis of patients， which is expected to become a biological target for the diagnosis and treatment of HNSC.

【Key words】 transforming growth factor β-induced? gene （TGFBI）; head and neck squamous carcinoma （HNSC）; bioinformatics; prognosis

頭頸部鱗癌（head and neck squamous carcinoma， HNSC）是最常見的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和死亡率給人類的身體健康造成了嚴重威脅，盡管現(xiàn)在的治療技術(shù)不斷進步，但當前患者年生存率仍較低（低于65%）［1-3］。轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因（transforming growth factor β-induced gene， TGFBI），也稱Betaig-h3基因。TGFBI蛋白被認為是一種細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc， ECM）蛋白，其已被證實參與各種生理過程，如形態(tài)發(fā)生、細胞增殖、黏附、遷移、分化和炎癥的激活［4］。在腫瘤微環(huán)境的特定成分中，特別是ECM蛋白，對腫瘤發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)移有一定的影響，其在早期階段有限制癌癥發(fā)生的作用，并推動疾病向惡性腫瘤發(fā)展［5］。據(jù)報道，TGFBI同時具有腫瘤抑制因子和促進腫瘤發(fā)展的作用，早期的研究主要集中在腫瘤抑制方面［6］，現(xiàn)在有越來越多的研究表明TGFBI在促進腫瘤進展方面具有顯著作用［7-8］。目前，TGFBI的研究大多是在角膜營養(yǎng)不良［9］和促進膠質(zhì)瘤細胞［10］增殖及遷移中的作用。然而，TGFBI在HNSC中表達缺乏相關(guān)報道，本研究基于多種數(shù)據(jù)庫分析TGFBI在HNSC中的表達情況，為臨床診斷提供有效依據(jù)，對降低HNSC高發(fā)病率和死亡率具有一定意義。

1 資料與方法

1.1 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫

利用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/），進入“Cancer Exploration”下的“Gene_DE”模塊來檢索TGFBI在多種癌癥中的表達情況。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫

基于UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）數(shù)據(jù)庫的TCGA（TCGA Gene analysis）模塊下的“Expression”分析TGFBI在HNSC與正常組織中的差異表達及其與臨床病理特征（年齡、性別、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等）的相關(guān)性。并利用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）下的“Boxplot”模塊進一步驗證TGFBI在HNSC與正常組織中的表達。

1.3 STRING數(shù)據(jù)庫

采用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），“Organism”選擇“Homo sapiens”，其余條件默認下分析TGFBI基因的互作蛋白，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 DAVID數(shù)據(jù)庫

通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進入“Start Analysis”模塊下的“Upload”。在“Step1”處輸入TGFBI基因及互作蛋白基因；“Step2”處選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”；“Step2a”處選擇“Homo sapiens”；“Step3”處設(shè)置為“Gene List”。最后在“Functional Annotation Clustering”模塊下得到數(shù)據(jù)（t2t_CA7F8C7F18621633430373215），進而對TGFBI基因與互作蛋白基因進行功能富集分析。

1.5 GEPIA數(shù)據(jù)庫

運用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）下的“Boxplot”模塊分析TGFBI在HNSC與正常組織中的差異表達。并在“Survival Analysis”板塊下檢索患者總生存曲線圖，輸入TGFBI基因，設(shè)置“Group Cutoff”為“Quartile”［即“Cutoff-High（%）”值為75；“Cutoff-Low（%）”值為25］，其余條件默認，分析患者的總生存情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)的分析多通過數(shù)據(jù)庫默認的統(tǒng)計學(xué)分析方法進行。采用 Wilcoxon 檢驗分析TGFBI基因在各種常見腫瘤組織與正常組織間的表達；使用單因素方差分析TGFBI基因在 HNSC與正常組織中的表達水平；運用 Pearson 相關(guān)進行TGFBI與其共表達基因的相關(guān)性分析 ；通過 Logrank 檢驗分析TGFBI高、低表達組的生存期。檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 TGFBI基因在泛癌中的表達

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TGFBI基因在多種腫瘤中高表達，包括在HNSC中。見圖1。

2.2 TGFBI基因在HNSC和正常組織中的差異表達

GEPIA數(shù)據(jù)庫和UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果均表明，TGFBI在HNSC中的表達明顯高于正常組織（P<0.05）。見圖2。

2.3 TGFBI基因與HNSC患者臨床病理特征的關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，相對于正常組織，TGFBI與HNSC患者的種族、性別、年齡、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TP53突變均密切相關(guān)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 TGFBI基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建TGFBI及其蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN1、MMP14、ITGA3、ITGAM、ITGAV、ITGB1、ITGB2、ITGB3、TGIF2和TGIF2LX這10個蛋白基因與TGFBI存在緊密聯(lián)系。見圖4。

2.5 TGFBI及相關(guān)基因功能富集

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對TGFBI及相關(guān)基因進行功能富集，結(jié)果顯示，它們主要參與了5個生物學(xué)程序（biological process， BP），如細胞外基質(zhì)組織、白細胞遷移和細胞黏附等，4個細胞組分（cell component， CC），如整合素復(fù)合體、細胞表面和胞外體等，3個分子功能（molecular function， MF），如蛋白酶結(jié)合、金屬離子結(jié)合和纖維連接蛋白結(jié)合，4個信號通路（kegg pathway， KEGG），如PI3K-Akt信號通路、ECM受體相互作用和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)。見表1。

2.6 TGFBI基因與HNSC預(yù)后的關(guān)系

TGFBI在HNSC中的總生存狀況中，TGFBI高表達較TGFBI低表達的生存期縮短（P<0.05）。見圖5。

3 討? 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因。有研究表明，腫瘤微環(huán)境中ECM的分子改變在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中有一定的影響。它不僅調(diào)節(jié)組織發(fā)育和平衡，還是腫瘤的組成部分之一，腫瘤細胞黏附到ECM的增加可以繞過許多正常的生長抑制途徑并促進惡性轉(zhuǎn)化［11］。TGFBI是由TGF-β誘導(dǎo)的ECM蛋白，作為ECM的重要組成部分，在許多細胞類型中，與其他基質(zhì)蛋白（如膠原蛋白、纖維素）相互作用，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附和遷移等［12］。其外分泌TGFBI還促進腫瘤細胞的增殖、入侵和轉(zhuǎn)移，而細胞遷移和侵襲過程是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)。先前研究描述TGFBI在癌癥進展中具有相互矛盾的作用，可作為癌癥發(fā)生發(fā)展的促進者或抑制因子［13］。但近年來，越來越多的研究顯示TGFBI在癌癥中起促進作用，其已被證實在結(jié)直腸癌［14］、膀胱癌［15］、乳腺癌［16］和胰腺癌［17］中表達。可見，TGFBI在腫瘤發(fā)病機理中是重要的正向或負向調(diào)節(jié)劑，這表明了它可能作為生物標志物或治療靶點發(fā)揮潛在作用。目前，尚未見有TGFBI基因在HNSC中的研究，因此TGFBI具有重要的研究價值。我們的研究表明TGFBI基因在HNSC中的表達明顯高于正常組織，其高表達與相關(guān)臨床特征（年齡、種族、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TP53突變等）存在緊密聯(lián)系。TGFBI的作用不同可能取決于腫瘤類型和腫瘤分期，在晚期患者診斷中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是HNSC預(yù)后不良的主要原因［18］，進而導(dǎo)致高死亡率。而靶向TGFBI的機制在治療晚期癌癥方面具有潛在的臨床效用。此外，我們在分析HNSC患者生存情況時，發(fā)現(xiàn)TGFBI基因高表達對HNSC患者的總生存時間存在顯著影響。因此，TGFBI基因可能是評估腫瘤進展的生物標志物。

進一步分析TGFBI基因的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)FN1、MMP14、ITGA3、ITGAM、ITGAV、ITGB1、ITGB2、ITGB3、TGIF2和TGIF2LX這10個蛋白基因與TGFBI蛋白存在緊密聯(lián)系。纖維連接蛋白1（fibronectin 1， FN1）在胃癌和結(jié)直腸癌［19-20］等惡性腫瘤的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。有研究表明，F(xiàn)N1是HNSC放射抗性的潛在生物標志物［21］，作為一種ECM糖蛋白，在細胞黏附和細胞遷移中起重要作用。MMP14調(diào)節(jié)多種細胞外和質(zhì)膜蛋白的活性，影響細胞間和ECM的通信，調(diào)節(jié)ECM降解和重塑、細胞侵襲和癌癥轉(zhuǎn)移等過程，并且在大量的實驗研究中顯示MMP14與腫瘤大小、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)，是腫瘤入侵的關(guān)鍵［22］。整合素是異源二聚體跨膜受體的一大家族，由α和β亞基組成。ITGA3、ITGAM和ITGAV為α亞基基因；ITGB1、ITGB2和ITGB3為β亞基基因。然而，整合素在生理上參與細胞增殖、分化和遷移的信號通路，重點是轉(zhuǎn)移過程和腫瘤細胞與ECM之間的相互作用［23］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)有許多腫瘤的整合素異常表達，包括乳腺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等，并通過介導(dǎo)細胞遷移和侵襲來促進腫瘤的惡性表型。這表明了整合素與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。TGIF2是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，通過與TGF-β 相互作用來充當轉(zhuǎn)錄抑制因子。已有研究表明TGIF2可能通過基因擴增機制在一些卵巢腫瘤的發(fā)育和/或進展中發(fā)揮重要作用［24］。TGIF2LX（轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的因子2樣，X連鎖）是一種同源域（HD）蛋白，與細胞信號通路的負調(diào)節(jié)相關(guān)，其已被暗示為人類惡性腫瘤發(fā)生的腫瘤抑制基因。

功能富集分析顯示它們在信號通路中主要參與了PI3K-Akt信號通路，PI3K-Akt信號通路是細胞增殖和凋亡不可或缺的，也是癌癥中最常見的受管制途徑之一，在許多癌癥的發(fā)病機制中起著重要的作用［25］。據(jù)報道，PI3K-Akt信號通路在90% HNSC中過度活躍，具有調(diào)節(jié)腫瘤增殖、代謝、活力和轉(zhuǎn)移的作用［26］。在分子功能方面主要參與了纖維連接蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合和蛋白酶結(jié)合。TGFBI通常作為連接蛋白，通過集成物相互連接ECM分子，并誘導(dǎo)細胞相互作用，不同類型腫瘤細胞中的癌性纖維連接蛋白在實驗和臨床上與腫瘤惡性、轉(zhuǎn)移或預(yù)后不良相關(guān)［27］。在金屬結(jié)合方面，金屬離子在生物體中是必不可少的，然而其在人體內(nèi)的作用是復(fù)雜的。如鋅、鐵、氦和銅，這些微量元素以酶的共生體的形式參與各種生化反應(yīng)，并通過與受體和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來控制重要的生物過程，在化學(xué)、分子和生物水平上對細胞功能起到重要作用［28］。大量臨床證據(jù)表明，細胞內(nèi)和組織水平的金屬平衡調(diào)節(jié)不良導(dǎo)致許多不同類型癌癥的發(fā)生發(fā)展，其觸發(fā)細胞的腫瘤轉(zhuǎn)化或降低免疫細胞的抗腫瘤功能［29］。此外，它們對于穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)和維持基因組穩(wěn)定性具有重要作用；在蛋白酶結(jié)合方面，蛋白酶涉及許多重要的正常生理過程，包括蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、營養(yǎng)消化、受精、細胞分化和生長、免疫反應(yīng)和凋亡。其除了調(diào)節(jié)ECM代謝外，還通過處理細胞間和細胞基質(zhì)黏附分子，為腫瘤的發(fā)生提供了重要的優(yōu)勢［30］。由此可見，TGFBI的表達和功能受到多種機制的嚴格調(diào)節(jié)，與TGFBI緊密互作的蛋白基因的功能和信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，TGFBI基因在HNSC中的表達水平高于正常組織，且與種族、年齡、性別、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等都密切相關(guān)；生存分析顯示，TGFBI基因高表達與患者預(yù)后不佳相關(guān)，高表達TGFBI基因的HNSC患者的總生存期（OS）較低表達者縮短；蛋白互作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1、MMP14、ITGA3、ITGAM、ITGAV、ITGB1、ITGB2、ITGB3、TGIF2和TGIF2LX這10個蛋白基因與TGFBI緊密互作；它們共同的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，其與癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要信號通路——PI3K-Akt信號通路相關(guān)。故多項證據(jù)表明，TGFBI基因可能參與HNSC的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，其可能作為HNSC潛在的早期診斷標志物和治療靶點。

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（收稿日期：2021-11-23 修回日期：2022-05-13）

（編輯：梁明佩）