胡穎文,馬曉嵐,牛海濤,黃躍,3*

(1.暨南大學 口腔醫(yī)學院,廣東 廣州 510632;2.暨南大學 附屬口腔醫(yī)院,廣東 佛山 528300;3.廣州市無菌動物與微生態(tài)轉化重點實驗室,廣東 廣州 510632;4.暨南大學 基礎醫(yī)學與公共衛(wèi)生學院,廣東 廣州 510632;5.暨南大學 實驗動物管理中心,廣東 廣州 510632)

慢性牙周病影響著全球近50%的人口,許多研究發(fā)現(xiàn)它與全身系統(tǒng)疾病有著密切的關聯(lián),特別是與約占全球人類所有死亡的1/3的心血管系統(tǒng)疾病有著顯著的相關性。而牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivali)是定植于牙周袋中的絕對厭氧菌,是牙周炎的常見致病菌,與心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的發(fā)生發(fā)展密切相關。Porphyromonasgingivalis及其釋放的毒性產物可通過引發(fā)機體一系列的免疫炎癥反應,使得炎癥介質進入血液循環(huán),加速動脈粥樣硬化的進展、誘導免疫反應加重高血壓、抑制梗死心肌的愈合等,從而影響CVD的發(fā)生和發(fā)展［1-2］。隨著研究的深入,本綜述詳細地總結了Porphyromonasgingivalis與CVD的相關性,揭示了不同致病因子、途徑、機制之間導致的不同結果,為今后Porphyromonasgingivalis與CVD相關性研究提供新的研究視角。

1 牙齦卟啉單胞菌的致病因子

Porphyromonasgingivalis是一種機會致病菌,其通過逃避宿主免疫監(jiān)視來干擾宿主防御機制,通過致病因子入侵宿主細胞導致致病。其致病因子包括外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、牙齦蛋白酶、菌毛、莢膜等［3］。它們單獨或一起發(fā)揮著作用,加重CVD的發(fā)生［4］。

1.1 外膜囊泡

OMVs直徑在 50 至 250 nm 之間,平均約為 50 nm［5］,其內部含有LPS、外膜蛋白、磷脂、熱休克蛋白和DNA［6］。OMVs高度集中大量的毒性因子,避免了蛋白水解酶的降解和破壞,增強了Porphyromonasgingivalis的毒性。Farrugia等［7-8］研究表明,OMVs可通過牙齦蛋白酶水解切割人血管內皮細胞(endothelial cells,ECs),血管通透性增加,導致組織滲出液增加,組織水腫 。OMVs通過抑制一氧化氮,血管收縮增加,內皮細胞凋亡增多,促進AS的發(fā)生［9］。OMVs還參與了細菌黏附,生物膜形成、侵襲并損傷宿主細胞和從而影響宿主免疫應答的調節(jié)［4,10-11］。

1.2 脂多糖

LPS是細菌外膜的一個相對分子量約為10 kD的較大的分子,是細菌外膜的重要組成部分,對牙周組織具有很強的毒性作用,是Porphyromonasgingivalis的主要毒力因子。LPS可以在Porphyromonasgingivalis存活期間游離成膜泡釋放出來,也可以在Porphyromonasgingivalis死亡裂解后釋放出來,透過組織的上皮屏障,侵入并破壞深層組織。Porphyromonasgingivalis-LPS及Porphyromonasgingivalis菌毛,能夠誘導不同Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR),發(fā)生炎癥和免疫反應,并且識別TLR2并結合蛋白LBP對機體CD14受體等信號通路誘導成骨細胞產生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子誘導牙槽骨溶解破壞［12-14］。

1.3 牙齦蛋白酶

牙齦蛋白酶可以直接損傷牙周組織,并且輔助Porphyromonasgingivalis逃逸宿主免疫系統(tǒng)使其長時間持續(xù)存在并破壞牙周組織。牙齦蛋白酶誘導基質金屬蛋白酶表達量過大,基質金屬蛋白酶組織抑制因子過小,從而致使牙周組織細胞間隙擴大,通透性增強,開辟通道使細菌及其毒性產物入侵,破壞結締組織并引起牙周組織變性、降解,加深牙周袋和牙槽骨的吸收［15-17］。

1.4 菌毛

Porphyromonasgingivalis菌毛是Porphyromonasgingivalis的表面結構,是從外膜突出的薄的絲狀細胞表面突起,Porphyromonasgingivalis主要有長菌毛和短菌毛,其中牙周炎患者中分布最廣的是I型和II長菌毛型。菌毛FimA和Mfa1均有利于Porphyromonasgingivalis早期黏附并定植到唾液蛋白、真核細胞、細胞外基質或其他細菌,并且能夠增強生物膜形成、細菌運動、細菌與宿主細胞的黏附及細菌侵入細胞。長菌毛可以被上皮細胞、內皮細胞和免疫細胞的TLR2受體識別激活NF-κB通路并誘導促炎細胞因子和黏附分子的產生,而CD14是識別PorphyromonasgingivalisFimA所需的TLR2 共同受體,與TLR2受體共同作用［18］。長菌毛與單核細胞/巨噬細胞中的補體受體3(complement receptors,CR3;CD11b/CD18) 相互作用,導致細胞外信號調節(jié)激酶 1/2磷酸化并抑制 LPS 誘導的白細胞介素-12(interleukin cell-12,IL-12)產生。短菌毛除了與 TLR2 和 CD14 相互作用誘導細胞因子產生外,還可刺激樹突狀細胞吞噬Porphyromonasgingivalis［19］,但促進了抗菌自噬和溶酶體融合的逃逸,導致Porphyromonasgingivalis在骨髓樹突細胞中持續(xù)存在［20-22］。

1.5 莢膜

Porphyromonasgingivalis莢膜是Porphyromonasgingivalis的表面結構,是毒力因子之一,由氨基半乳糖、氨基葡萄糖等構成的黏附于細胞壁外層的多聚物。研究發(fā)現(xiàn),在有莢膜和無莢膜的Porphyromonasgingivalis小鼠模型中有莢膜的Porphyromonasgingivalis毒力較強,能引起小鼠全身感染［3］,并且發(fā)現(xiàn)感染有莢膜Porphyromonasgingivalis的小鼠產生IL-8 等炎癥因子較少,可能與其抗吞噬,減緩傷口愈合有關［23］。Porphyromonasgingivalis的致病因子如圖1所示。

圖1 Porphyromonas gingivalis的致病因子

2 Porphyromonas gingivalis與心血管疾病關系

Porphyromonasgingivalis與心血管疾病密切相關,研究表明,患有牙周病的患者其患心血管疾病的風險更高［24］。CVD包括心肌梗死(myocardial infarction,MI)、高血壓、心力衰竭、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、心肌炎、冠心病等［25］。報道中顯示129 630名志愿者對22項研究報告表明牙周炎患者患心肌梗死的概率比非牙周炎患者高出2倍［26］。在許多動脈粥樣硬化術后病灶標本中檢出了高含量的Porphyromonasgingivalis［27-29］。64.1%的主動脈瘤患者的動脈瘤標本和口腔牙菌斑中發(fā)現(xiàn)Porphyromonasgingivalis的感染等［30-31］。Porphyromonasgingivalis與CVD相關性研究,證實了Porphyromonasgingivalis從多個途徑感染CVD相應病灶部位,它們之間存在著相關性(表1)。

表1 Porphyromonas gingivalis與CVD相關性研究Table 1 Study on the correlation between Porphyromonas gingivalis and CVD

3 Porphyromonas gingivalis對CVD的致病途徑

Porphyromonasgingivalis對CVD的致病途徑主要為吞噬細胞介導和通過入血導致菌血癥引起心血管疾病。

3.1 吞噬細胞介導

在CVD中,血管內皮受到異常刺激,導致血小板黏附在內皮細胞脫落的區(qū)域［39］。并從血液中招募單核細胞黏附到內膜下并持續(xù)釋放前炎性介質,最終分化為泡沫細胞和導致VSMCs增生［40］,從而形成成熟的斑塊并增大,甚至阻塞血管導致CVD發(fā)生［41-43］。

3.2 菌血癥感染

慢性牙周炎有高達8～20 cm2的牙周袋潰瘍上皮襯里,如果損傷使牙周袋潰瘍上皮襯里連續(xù)性中斷,則有可能導致Porphyromonasgingivalis進入血液循環(huán)引起菌血癥［44］。從而導致血管內皮的通透性被破壞,低密度脂蛋白(density lipoprotein,LDL)被VSMCs攝入,同時氧化應激發(fā)生在內皮中并產生大量超氧化物,形成泡沫細胞,然后被氧化得到氧化低密度脂蛋白(Oxidized density lipoprotein,oxLDL),導致VSMCs增生,從而導致CVD發(fā)生［45］。Porphyromonasgingivalis進入心血管系統(tǒng)的致病途徑如圖2所示。

圖2 Porphyromonas gingivalis進入心血管系統(tǒng)的致病途徑

4 Porphyromonas gingivalis對CVD的致病機制

在機制上,Porphyromonasgingivalis及其釋放的毒性產物可通過引發(fā)機體一系列的免疫炎癥反應,使得炎癥介質CRP、IL-6、TNF-α等進入血循環(huán),從而影響心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［46］。Porphyromonasgingivalis對CVD的致病機制有以下幾個方面:氧化應激(oxidative Stress,OS)和內皮功能障礙;脂質蓄積與泡沫細胞形成;血管重塑;血管鈣化;血栓形成;斑塊破裂。

4.1 氧化應激和內皮功能障礙

OS是體內氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài),其產生的中間產物對體內組織產生不良影響。Shiheido等［2］研究發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis侵入了 MI 小鼠的缺血心肌,增加氧化應激反應,基質金屬蛋白酶-9(matrix met-alloproteinases,MMP-9)活性增加,并誘導心臟破裂。Xie等［29］發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis感染可激發(fā)TLRs-NF-κB信號轉導軸和增加DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT-1)表達,使鐘基因BMAL1的轉錄下降,并增強鐘基因CLOCK表達使p65磷酸化,使NF-κB信號傳導增加,促進氧化應激和人主動脈內皮細胞的炎癥反應,從而誘導AS發(fā)生。內皮功能障礙是內皮在血管疾病中的全身病理狀態(tài)［47］,Porphyromonasgingivalis可通過改變炎癥物質和增加血管緊張素Ⅱ從而使血管內皮功能障礙誘導AS、高血壓發(fā)生［1］。Sampath等［47］的研究發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis感染的原代人主動脈內皮細胞活力下降,誘導二氫葉酸還原酶mRNA下降,糖原合酶激酶3β的mRNA增高,從而使血管內皮功能障礙,誘導AS等其他心血管疾病發(fā)生。因此,在慢性牙周炎中,Porphyromonasgingivalis可誘導誘發(fā)氧化應激反應,并且介導巨噬細胞攝取膽固醇和轉變成泡沫細胞［48］,促進促炎細胞因子釋放、通過NF-κB、NF-κB-BMAL1-NF-κB、NLRP3、激活蛋白 1 (AP-1)、p38、c-Jun N-激酶等通路增加血管內皮損傷［29,49-50］。Porphyromonasgingivalis誘導血管內皮細胞間質轉化和凋亡,損害其完整性并失去修復能力［51］,證實其在破壞心血管內皮穩(wěn)態(tài)的進展中產生關鍵作用［52-54］。因此,在實驗設計和臨床研究中,如果能從減緩Porphyromonasgingivalis介導的炎癥因子的釋放和氧化應激反應而增加血管內皮細胞的完整性和增強其修復功能的切入點進行研究,或許能減少心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

3）驗證性實驗過多，不能培養(yǎng)學生的實踐能力。所使用的實驗設備為模擬電路工具箱，學生實驗只是連接封裝的模型，由示波器觀察實驗結果。實驗內容包含典型環(huán)節(jié)模擬、二階系統(tǒng)時間響應、典型環(huán)節(jié)頻率特性以及控制系統(tǒng)分析，這些實驗均以驗證性為主，延展性不足，無法達到鍛煉動手能力的目的，對于學生理解幫助不大。

4.2 脂質蓄積與泡沫細胞形成

LDL通過氧化修飾激活內皮等細胞,其細胞因子能夠使血液循環(huán)中的單核細胞遷移到內膜并分化成巨噬細胞,并衍生出泡沫細胞,而Porphyromonasgingivalis能夠增加VSMCs攝取脂質并在巨噬細胞內蓄積［55］。Yang等［56］研究表明Porphyromonasgingivalis通過LDL誘導泡沫細胞形成并溶酶體整合膜蛋白2(Lysosomal integrated membrane protein 2,LIMP2)的表達導致動脈壁中脂質沉積和斑塊形成［57］,內膜細胞增生,血流流動受阻,誘發(fā)心血管疾?。?6,58］。同時發(fā)現(xiàn)Porphyromonasgingivalis促進泡沫細胞的形成,并使溶酶體整合膜蛋2(lysosomal integral membrane protein 2,LIMP2)表達上升、NF-κB通路激活和JNK激酶(Jun kinas,JNK)活性升高,使Porphyromonasgingivalis誘導的LIMP2 的表達升高,導致泡沫細胞形成,誘導AS發(fā)生。

這些研究表明,Porphyromonasgingivalis-LPS可干擾巨噬細胞中的脂質代謝,增加巨噬細胞對LDL膽固醇的攝取,并通過LDL刺激巨噬細胞和泡沫細胞導致促炎細胞因子上調,從而誘導AS的發(fā)生發(fā)展。因此,如何通過減緩Porphyromonasgingivalis-LPS的作用來調控巨噬細胞對脂質的攝取代謝,減少泡沫細胞形成,或許能減少Porphyromonasgingivalis對CVD的加劇。

4.3 血管重塑

血管重塑是通過使血管壁增厚或變薄,從而改變血管動力學,是一種病理性的適應性改變,Porphyromonasgingivalis可增加血管斑塊的形成,促使血管重塑,防止血管變窄發(fā)生缺血。DeLeon-Pennell等［32］發(fā)現(xiàn),接種Porphyromonasgingivalis-LPS的小鼠分泌Ccl12促炎因子增多,修復反應減少,疤痕形成減少,單核細胞趨化蛋1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)增多,致使血管重塑,從而對MI后的左心室產生不良影響,誘導MI發(fā)生。Zaidi等［33］發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis-LPS激活記憶CD8+T細胞,巨噬細胞增多,導致MI后心臟血管重塑不良,從而誘導MI發(fā)生。

因此,為了適應血管內膜的增生、斑塊增大,血管得以重塑,以維持恒定的血流防止缺血,Porphyromonasgingivalis釋放的牙齦蛋白酶可刺激主動脈平滑肌細胞中血管生成素-2的表達,促使主動脈平滑肌細胞遷移誘導血管重塑。而Porphyromonasgingivalis-LPS可上調血管平滑肌VSMCs中內皮素β受體的表達,進而使動脈對內皮素-1介導的血管收縮敏感［59-60］。所以,如何從減緩Porphyromonasgingivalis及其毒性物質能抑制ECs的功能、增殖和遷移并誘導凋亡的角度出發(fā),從而減少誘導血管重塑并加重CVD還有許多值得研究的地方。

4.4 血管鈣化

血管鈣化是血管壁出現(xiàn)異常的鈣化沉積,從而使血管壁硬化,舒張收縮功能下降,引起局部缺血。唐路等［35］發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis誘導VSMCs活力和鈣化增高,VSMCs異常的分化、遷移和凋亡會造成血管的損傷,導致主動脈壁鈣化增高,導致血管鈣化,誘導AS的發(fā)生。

血管壁的中內膜層,是血管發(fā)生鈣化的結構基礎,許多研究都表明血管鈣化是由VSMCs分化所致［61］。而Porphyromonasgingivalis可誘導VSMCs活性增強并分化,并且導致VSMCs和主動脈鈣化,并直接引起主動脈壁鈣化沉積。血管鈣化使血管硬度增加,斑塊形成,并導致AS的發(fā)生［62-64］。臨床上可加強牙周等治療,改善口腔衛(wèi)生環(huán)境,從而減少Porphyromonasgingivalis的產生而導致的血管鈣化引起的AS。

4.5 血栓形成

Porphyromonasgingivalis釋放的牙齦蛋白酶誘導ECs的促凝,并降低ECs的質膜上的血栓調節(jié)蛋白(CD141)的活性,使轉化為抗凝酶的凝血酶可以與血小板結合,刺激血小板聚集,形成血栓［53,65］。Senini等［66］研究發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis-LPS 刺激Cdc42升高,凝血時間減少,導致血栓形成,誘導MI等心血管疾病的發(fā)生。為防止失血和維持血管的完整性,血管損傷后血栓便形成了,這不僅減少了血流量,而且導致了組織缺氧和梗死,誘導并加重MI。

4.6 斑塊破裂

Zhang等［53］研究發(fā)現(xiàn),Porphyromonasgingivalis增多可導致輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)增多和調節(jié)性T細胞(Regulatory cells,Tregs)減少,導致Th17/Tregs失衡和斑塊不穩(wěn)定。Porphyromonasgingivalis及代謝產物使單核細胞增多,誘導Th17/IL-17 反應增多,使 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-17升高,通過 TLR2/TLR4 調控和炎癥反應形成AS斑塊,導致AS發(fā)生。

5 小結與展望

綜上所述,口腔微生物的發(fā)生發(fā)展與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生息息相關,Porphyromonasgingivalis是其中常見而典型的細菌,研究其中的關系將為未來口腔與心血管疾病的防治提供重要參考價值,有利于疾病的轉歸。

在牙周炎致病過程中,Porphyromonasgingivalis是其常見致病菌,當合并其他細菌如伴放線桿菌(Aa)、福賽坦氏菌等時,它們的致病因子、致病途徑和致病機制對CVD的影響值得深入探討。

在致病因子上,Porphyromonasgingivalis的菌毛、血凝素均有不同分型,還有牙齦素、Toll樣受體、膠原酶等不常見的毒力因子未被深入研究,它們可對Porphyromonasgingivalis的毒力、侵襲力產生影響并可通過調節(jié)宿主的免疫、炎癥等反應,誘導心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展,可以對其做探討。

在發(fā)病機制上,目前許多報道Porphyromonasgingivalis與CVD的密切關系,Porphyromonasgingivalis可通過募集黏附單核細胞,使泡沫細胞形成和內膜細胞增生,促進巨噬細胞表面LDL增加導致硬化斑塊及血栓形成,從而引發(fā)CVD［68］。然而,對于急性心肌梗死(AMI),Sun等［61］發(fā)現(xiàn)Porphyromonasgingivalis毒素雖可激活記憶 CD8+T 細胞,但在阻斷CD8+T 細胞的激活后,并沒有影響巨噬細胞數(shù)量或使其細胞壁變薄,表明該激活CD8+T 細胞可能只是AMI的發(fā)生其中一個原因,其原理值得深究［33］;另一方面,Porphyromonasgingivalis對血管鈣化的作用研究目前也較少;因此,Porphyromonasgingivalis參與CVD發(fā)生發(fā)展的過程及發(fā)病機制尚有許多值得探討與深入研究的地方。

在治療上,Shiheido等［2］用免疫球蛋白 Y 對抗牙齦蛋白酶治療顯著降低了由心臟破裂引起的 Pg 接種 MI 小鼠的死亡率;Chen 等［69］的發(fā)現(xiàn)表明BMP4 在感染相關血管鈣化中可能具有治療作用。唐路等［35］發(fā)現(xiàn)通過牙周治療,可減緩頸總動脈內膜厚度增加的進程。這都是我們在臨床上治療思路值得借鑒的地方,通過有效牙周治療,減少Porphyromonasgingivalis等炎癥因子,有利于防治CVD。也可以通過增加臨床樣本量,對大量受試者進行隨訪,明確牙周治療對CVD轉歸的影響。

作者貢獻聲明

胡穎文:提出研究思路,整理文獻,撰寫論文;馬曉嵐:提出研究框架,修改論文;牛海濤:制定大綱,審核論文;黃躍:提出研究思路,修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。