姚楚玄,張 磊,秘彩莉,周 碩,董福雙,劉永偉,楊 帆,焦 博,柴建芳

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心,河北石家莊 050051; 2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北石家莊 050024)

小麥1B/1R易位系由于1R染色體短臂(1RS)上攜帶有抗病、高產(chǎn)、廣適性等優(yōu)良基因[1-2],在中國(guó)已得到廣泛應(yīng)用[3-5],但其加工品質(zhì)不佳,主要體現(xiàn)在面筋強(qiáng)度低、耐揉性差和面團(tuán)發(fā)粘,因此不適合加工優(yōu)質(zhì)面包和優(yōu)質(zhì)面條[6-7]。原因可能是1RS攜帶的黑麥堿基因編碼的ω-黑麥堿和γ-黑麥堿[8]均為單體蛋白,其中ω-黑麥堿極易溶于水。

小麥高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)分別由1A、1B和1D染色體長(zhǎng)臂上的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)編碼。研究表明,Glu-D1位點(diǎn)編碼的5+10優(yōu)質(zhì)亞基取代等位變異2+12亞基后,可在一定程度上提高1B/1R易位系的加工品質(zhì)[9-10]。但僅靠導(dǎo)入5+10優(yōu)質(zhì)亞基提高小麥加工品質(zhì)的幅度有限。Glu-B1位點(diǎn)編碼的超表達(dá)7OE亞基是另一個(gè)重要的優(yōu)質(zhì)亞基,該亞基在國(guó)外應(yīng)用相對(duì)較多[11],在國(guó)內(nèi)強(qiáng)筋春小麥育種中也有應(yīng)用[12],但在改善小麥1B/1R易位系品質(zhì)方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

麥谷蛋白溶脹指數(shù)(swelling index of glutenin, SIG)作為反映小麥品質(zhì)的一個(gè)參數(shù),測(cè)定時(shí)僅需要少量的面粉或全粉[13-14]。乳酸-SDS溶劑保持力(lactic acid-sodium dodecyl sulfate solvent retention capacity,LA-SDS SRC)是軟質(zhì)小麥品質(zhì)的特有參數(shù),其反映軟質(zhì)小麥的優(yōu)劣,測(cè)定時(shí)面粉或全粉用量較多,但重復(fù)性較好,適合對(duì)早代材料進(jìn)行品質(zhì)預(yù)測(cè)[15]。SDS沉降值能體現(xiàn)小麥烘烤品質(zhì)的好壞,測(cè)定時(shí)需要樣品量也較少[16]。本研究選用小麥1B/1R易位系品種科農(nóng)199為母本,與含有7OE亞基的強(qiáng)筋春小麥品種津強(qiáng)6號(hào)雜交,從后代中篩選出黑麥堿基因與7OE亞基基因聚合在同一條染色體上的1B/1R易位系材料,然后通過(guò)SIG、LA-SDS SRC和SDS沉降值測(cè)定,初步了解這種聚合材料的品質(zhì)情況,以期為今后更好利用1B/1R易位系提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及種植

供試材料包括科農(nóng)199(母本)、津強(qiáng)6號(hào)(父本)及其雜交后代。其中,科農(nóng)199為中筋冬小麥品種,含1B/1R易位,其HMW-GS組成為1/7+9/2+12;津強(qiáng)6號(hào)為強(qiáng)筋春小麥品種,不含1B/1R易位,其HMW-GS組成為1/7OE+8*/5+10;雜交后代選用7+9和7OE+8*亞基基因之間發(fā)生替換的F4代單株及其后代。F4代種子播種于玻璃溫室,溫度控制在18～25℃,每天光照16 h;F5代種子播種于大田,種成株行,常規(guī)大田管理。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

用天根生化科技有限公司(北京)生產(chǎn)的植物基因組DNA小量提取試劑盒提取小麥葉片的基因組DNA,使用北京GenStar公司(北京)生產(chǎn)的StarMix,在BIO-RAD S1000TMPCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。雜交后代黑麥堿基因的純合性檢測(cè)按照Chai等[17]的方法進(jìn)行;5亞基基因的純合性檢測(cè)按照Ishikawa等[18]的方法進(jìn)行;7OE亞基基因的純合性檢測(cè)使用Bx7OE標(biāo)記[19],9亞基基因的純合性檢測(cè)使用By9標(biāo)記[20]。選用位于1BL的4個(gè)SSR標(biāo)記Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582[21-22]檢測(cè)7OE亞基發(fā)生聚合的位點(diǎn)。所用的標(biāo)記信息見(jiàn)表1。

表1 本研究所用的標(biāo)記引物信息Table 1 Primers of markers used in this study

1.3 麥谷蛋白溶脹指數(shù)(SIG)的測(cè)定

用FOSS旋風(fēng)磨(帶有1 mm的不銹鋼濾網(wǎng))將小麥籽粒磨成全粉,按照Wang等[13]的方法進(jìn)行SIG測(cè)定,略有改動(dòng)。具體步驟:稱取40 mg全粉置于稱重的2 mL離心管中,加入0.6 mL蒸餾水,在旋渦震蕩器中(1 400 r·min-1) 水化20 min,然后再加入0.6 mL SDS-乳酸溶液[2% SDS溶液∶乳酸儲(chǔ)液(85%乳酸用蒸餾水稀釋8倍后加熱回流6 h) = 48∶1]混合5 min,使其溶脹,然后300 g離心5 min后,去掉上清液,離心管再300 g離心2 min后,倒置20 min,然后稱取整個(gè)離心管的重量。離心管中殘留物質(zhì)的重量與面粉重量的比值即為SIG值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4 微量SDS沉降值的測(cè)定

按照Dick等[16]的方法進(jìn)行SDS沉降值測(cè)定,略有改動(dòng)。具體步驟:每個(gè)樣品稱取0.5 g小麥全粉,置于10 mL具塞刻度試管中,然后加入2 mL溴酚蘭水溶液(10 mg·L-1),用渦旋震蕩器混合20 s,靜置5 min,再渦旋震蕩混合10 s,再靜置5 min后,立即向混合后的樣品中加入6 mL SDS-乳酸混合溶液,上下顛倒10次后,迅速豎立于小麥SDS沉淀值測(cè)定儀試管架上放置10 min,快速準(zhǔn)確讀取沉降值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次。

1.5 乳酸-SDS溶劑保持力(LA-SDS SRC)的測(cè)定

采用Seabourn等[15]的方法測(cè)定小麥全粉的LA-SDS SRC。具體步驟:取25 mL 85%的乳酸溶液加入至200 mL蒸餾水中,將該儲(chǔ)液加熱回流6 h,以減少乳酸分子的聚集趨勢(shì),然后將乳酸儲(chǔ)液與蒸餾水按1∶19 的比例混合為“乳酸工作液”。稱量1.0 g小麥全粉,放入提前稱重的50 mL離心管中,加入5 mL乳酸工作液,用渦旋震蕩儀混合6 s,然后加入20 mL 1.25% 的SDS溶液,再次用渦旋震蕩儀混合6 s。然后將離心管在搖床上搖動(dòng)4 min (300 r·min-1,23 ℃),3 200 g離心2 min后,去掉上清液,倒置在吸水紙上,靜置20 min后稱取整個(gè)離心管的重量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。計(jì)算公式如下:SRC=[(沉降物重量/面粉重量)×86/(100-面粉含水量)-1]×100%。面粉含水量采用HM-105L鹵素水份分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用DPS 9.01軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合7OE亞基1B/1R易位系材料創(chuàng)制結(jié)果

1B/1R易位系中筋小麥品種科農(nóng)199與非1B/1R易位系強(qiáng)筋小麥品種津強(qiáng)6號(hào)雜交,從F2代開(kāi)始對(duì)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的后代進(jìn)行HMW-GS組成檢測(cè),發(fā)現(xiàn)30個(gè)F3代植株中,有3個(gè)植株黑麥堿基因純合而7OE亞基基因雜合,1個(gè)植株7OE亞基基因純合而黑麥堿基因雜合,說(shuō)明這些植株中發(fā)生了7OE亞基基因與黑麥堿基因之間的聚合。為獲得純合聚合體,進(jìn)一步對(duì)黑麥堿基因純合而7OE亞基基因雜合植株的F4代分離群體進(jìn)行PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的44個(gè)植株中,7OE亞基基因與黑麥堿基因均純合的聚合植株7株,雜合聚合植株27株,純合非聚合植株10株。圖1展示了3個(gè)純合聚合植株和3個(gè)非聚合植株及其親本中黑麥堿基因以及Glu-B1位點(diǎn)7OE和9亞基基因的PCR檢測(cè)結(jié)果。由于這6個(gè)后代植株的黑麥堿基因已經(jīng)純合,所以只擴(kuò)出了1條1 076 bp的特異條帶(圖1A)。在Glu-B1位點(diǎn),含有7OE亞基的3個(gè)聚合植株和親本津強(qiáng)6號(hào)擴(kuò)增出7OE亞基基因特異的844 bp條帶(圖1B);而含有9亞基的3個(gè)非聚合植株和親本科農(nóng)199擴(kuò)增出9亞基基因特異的662 bp條帶(圖1C),3個(gè)聚合植株沒(méi)有擴(kuò)出662 bp的特異條帶,說(shuō)明聚合植株中7OE和8*亞基仍連鎖在一起。在Glu-D1位點(diǎn),這3個(gè)純合聚合植株和3個(gè)非聚合植株只擴(kuò)增出了5亞基基因特異的320 bp條帶,而沒(méi)有擴(kuò)出2亞基基因特異的361 bp條帶(圖2),說(shuō)明聚合植株和非聚合植株在Glu-D1位點(diǎn)均攜帶5亞基基因。在Glu-A1位點(diǎn),由于兩個(gè)親本均攜帶1亞基,所以聚合植株和非聚合植株在該位點(diǎn)仍均攜帶1亞基基因。綜合3個(gè)亞基基因的PCR檢測(cè)結(jié)果,說(shuō)明這6個(gè)F4代植株除了在Glu-B1位點(diǎn)有差異外,在Glu-A1和Glu-D1位點(diǎn)上沒(méi)有差異。

A:黑麥堿基因的檢測(cè)結(jié)果;B:Glu-B1位點(diǎn)7OE亞基基因的檢測(cè)結(jié)果;C:Glu-B1位點(diǎn)9亞基基因的檢測(cè)結(jié)果。M:DL2000;H:陰性對(duì)照(H2O);P1:津強(qiáng)6號(hào)(父本);P2:科農(nóng)199(母本);1～3:7OE亞基基因與黑麥堿基因未聚合植株;4～6:7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合植株,圖2和圖3同。A: PCR results of secalin gene; B: PCR results of 7OE subunit gene at Glu-B1 locus; C: PCR results of 9 subunit gene at Glu-B1 locus. M: DL2000; H: Negative control(H2O); P1: Jinqiang 6(male parent); P2: Kenong 199(female parent); 1-3: 1B/1R translocation plants without pyramiding 7OE subunit; 4-6: 1B/1R translocation plants with pyramiding 7OE subunit. The same in figures 2 and 3.圖1 F4代部分聚合和未聚合植株中黑麥堿基因和Glu-B1位點(diǎn)7OE亞基基因的PCR檢測(cè)Fig.1 PCR result of secalin gene and 7OE subunit gene at Glu-B1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation

圖2 F4代部分聚合和未聚合植株中Glu-D1位點(diǎn)5亞基基因的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR result of 5 subunit gene at Glu-D1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation

2.2 7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合位點(diǎn)的確定

為確定7OE亞基基因與黑麥堿基因發(fā)生聚合的位置,首先對(duì)1B染色體長(zhǎng)臂上的4個(gè)SSR標(biāo)記Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582在2個(gè)親本間的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Xgwm259和Xgwm582在親本間具有多態(tài)性。進(jìn)一步利用這2個(gè)標(biāo)記對(duì)6個(gè)后代植株(3個(gè)純合聚合植株,3個(gè)非聚合植株)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這6個(gè)植株與親本科農(nóng)199具有相同的擴(kuò)增帶型(圖3A, 3B),說(shuō)明這2個(gè)SSR位點(diǎn)均來(lái)自科農(nóng)199。由于7OE亞基基因位于這2個(gè)SSR標(biāo)記之間[20],因此可以確定7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合的位置在1B染色體長(zhǎng)臂上,科農(nóng)199的7+9亞基基因片段被津強(qiáng)6號(hào)的7OE+8*亞基基因片段所取代。

A:Xgwm582標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果;B:Xgwm259標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果。A:Detection results of Xgwm582 marker; B: Detection results of Xgwm259 marker.圖3 F4代部分聚合和未聚合株系的SSR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 SSR detection results of some plants with and without pyramiding in F4 generation

2.3 聚合7OE亞基1B/1R易位系的品質(zhì)

為明確聚合7OE亞基1B/1R易位系的品質(zhì),對(duì)溫室種植的聚合和未聚合7OE亞基的1B/1R易位系植株及其親本進(jìn)行了SIG測(cè)定(表2),發(fā)現(xiàn)在1B/1R易位系中,用5+10優(yōu)質(zhì)亞基取代2+12亞基后(表2中的1、2和3號(hào)植株),SIG值顯著高于不含5+10優(yōu)質(zhì)亞基的親本科農(nóng)199,但仍顯著低于親本津強(qiáng)6號(hào);在聚合5+10優(yōu)質(zhì)亞基的基礎(chǔ)上再引入7OE優(yōu)質(zhì)亞基后(表1中的4、5和6號(hào)植株),4號(hào)和5號(hào)植株的SIG值進(jìn)一步顯著提高,而且與津強(qiáng)6號(hào)相當(dāng),說(shuō)明這2個(gè)植株中1B/1R易位系的品質(zhì)劣變得到了完全的彌補(bǔ)。

表2 F4代部分聚合和未聚合植株及其親本的麥谷蛋白溶脹指數(shù)Table 2 SIG of some plants with and without pyramiding in F4 generation and their parents

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,把F4代聚合和未聚合7OE亞基的1B/1R易位系及其親本單株收獲的種子播種于大田,成熟后收獲株行的種子進(jìn)行LA-SDS SRC和SDS沉降值的測(cè)定(表3),發(fā)現(xiàn)在1B/1R易位系中,用5+10優(yōu)質(zhì)亞基取代2+12亞基后,LA-SDS SRC和SDS沉降值仍顯著高于不含5+10優(yōu)質(zhì)亞基的親本科農(nóng)199(除F2-34-52-27-43株系的SDS沉降值與科農(nóng)199無(wú)顯著差異外);在聚合5+10優(yōu)質(zhì)亞基的基礎(chǔ)上再引入7OE優(yōu)質(zhì)亞基后,這些株系的LA-SDS SRC和SDS沉降值又進(jìn)一步顯著提高,但并未達(dá)到強(qiáng)筋親本津強(qiáng)6號(hào)的水平。2個(gè)種植環(huán)境的結(jié)果說(shuō)明,聚合5+10和7OE優(yōu)質(zhì)亞基的1B/1R易位系材料的加工品質(zhì)顯著高于只聚合5+10優(yōu)質(zhì)亞基的1B/1R易位系材料。因此,聚合7OE亞基可顯著提高1B/1R易位系的加工品質(zhì)。

表3 F5代部分聚合和未聚合株系及其親本的乳酸-SDS溶劑保持力和SDS沉降值Table 3 LA-SDS SRC and SDS sedimentation value of some lines with and without pyramiding in F5 generation and their parents

3 討論

小麥1B/1R易位系具有比較發(fā)達(dá)的根系,在中國(guó)干旱地區(qū)發(fā)揮了較大的作用。但由于1B/1R易位系的加工品質(zhì)較差[6-7],在小麥品質(zhì)育種中,常作為被淘汰的對(duì)象[23],如何提高小麥1B/1R易位系的品質(zhì)仍面臨較大挑戰(zhàn)。

導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)亞基是提高小麥1B/1R易位系加工品質(zhì)的一個(gè)重要途徑。本研究向小麥1B/1R易位系中不僅導(dǎo)入了5+10優(yōu)質(zhì)亞基基因,而且還導(dǎo)入了7OE優(yōu)質(zhì)亞基基因,與不含優(yōu)質(zhì)亞基的親本科農(nóng)199相比,只導(dǎo)入5+10優(yōu)質(zhì)亞基基因可以顯著提高1B/1R易位系的品質(zhì),這與申小勇[10]的報(bào)道一致。本研究在聚合5+10優(yōu)質(zhì)亞基的基礎(chǔ)上進(jìn)一步聚合7OE優(yōu)質(zhì)亞基,發(fā)現(xiàn)1B/1R易位系的品質(zhì)又得到了顯著提升,但與含有5+10和7OE優(yōu)質(zhì)亞基的非1B/1R易位系親本津強(qiáng)6號(hào)相比,仍存在明顯差距。

7OE亞基之所以表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)是由于它包含2個(gè)有功能的7亞基[19],增加的1個(gè)7亞基可以提高籽粒麥谷蛋白總量和面筋強(qiáng)度[24]。7OE作為一個(gè)對(duì)農(nóng)藝性狀沒(méi)有不良影響的優(yōu)質(zhì)亞基[25],在中國(guó)冬小麥育種中還沒(méi)有被利用,與5+10優(yōu)質(zhì)亞基聚合是提高小麥1B/1R易位系加工品質(zhì)的重要育種方向。另外,用離子束誘變創(chuàng)造的黑麥堿位點(diǎn)缺失突變體在常規(guī)小麥育種中可以直接利用,但其白粉病抗性降低[26]。利用7OE亞基來(lái)提高小麥1B/1R易位系的品質(zhì)可有效避免這種問(wèn)題。

本研究得到的聚合7OE亞基的1B/1R易位系材料,盡管其加工品質(zhì)達(dá)不到強(qiáng)筋親本津強(qiáng)6號(hào)的水平,但與中筋親本科農(nóng)199比較,加工品質(zhì)已有顯著提高,這些材料是否適合加工優(yōu)質(zhì)面條、餃子、饅頭等食品,還有待種子量足夠時(shí)進(jìn)行全面的品質(zhì)測(cè)定。