常馨月, 萬(wàn)路生, 楊小林, 蔣 騰, 楊雯靜, 劉 峰, 趙墾田

(1.西藏大學(xué)理學(xué)院, 拉薩 850000; 2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 重慶 萬(wàn)州 404000;3.西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院, 西藏 林芝 860000;4.華能西藏雅魯藏布江水電開(kāi)發(fā)投資有限公司, 西藏 林芝 860000;5.中國(guó)電建集團(tuán)成都勘測(cè)設(shè)計(jì)研究院有限公司, 成都 610000;6.華能西藏水電安全工程技術(shù)研究中心, 西藏 林芝 860000)

巨柏(Cupressusgigantea)系柏科(Cupressaceae)柏木屬(Cupressus)高大喬木[1],為我國(guó)西藏特有物種,主要散生分布在雅魯藏布江及其支流沿岸的林芝市巴宜區(qū)、米林縣和朗縣等地,或在海拔3 000～3 400 m的陽(yáng)坡形成疏林。因種群數(shù)量稀少和天然更新困難等原因,巨柏被確定為國(guó)家一級(jí)保護(hù)物種,并在2004年列入中國(guó)物種紅色名錄[2]。

目前,巨柏的研究主要集中在苗木培育、群落生態(tài)學(xué)和種子繁育等方面[3-9],且研究發(fā)現(xiàn)巨柏群落存在天然更新困難等問(wèn)題。通過(guò)對(duì)巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中的生理指標(biāo)進(jìn)行研究分析,明確巨柏種子萌發(fā)的生理變化規(guī)律,以期更深層次地了解巨柏種子繁育機(jī)制,促進(jìn)巨柏種質(zhì)資源保護(hù),進(jìn)而為巨柏的天然更新和種群擴(kuò)大提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

巨柏采種林分位于西藏自治區(qū)林芝市朗縣洞嘎鎮(zhèn)扎西塘村,地理坐標(biāo)為28°59′49″N,93°18′0″E,海拔3 060 m。研究地為高山峽谷地帶,具有干熱河谷氣候特征,年降水量在400 mm左右,降水主要集中在4—9月,且以6、7月最高,是溫帶半濕潤(rùn)至半干旱的過(guò)渡區(qū)。

于2020年8月在雅魯藏布江右岸的階地巨柏林進(jìn)行采種,分別采集3棵巨柏母樹(shù)樹(shù)冠下部不同方位的球果混合備用,自然風(fēng)干取種,5 ℃貯藏。種子千粒重為4.137 g,含水量為7.59%。

1.2 方 法

2020年11月,將供試種子用0.5%的高錳酸鉀溶液進(jìn)行消毒后用20 ℃蒸餾水浸種2 d[8],采用沙培法[9]進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。在巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中,自浸種開(kāi)始每2 d進(jìn)行一次取樣,觀察種子形態(tài)特征,并測(cè)定各時(shí)期的主要生理生化指標(biāo),包括含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和過(guò)氧化物酶(POD)活性。

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法和蒽酮-H2SO4比色法分別測(cè)定種子的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量。采用紫外吸收(Tris-HCl)法和愈創(chuàng)木酚法分別測(cè)定CAT活性和POD活性[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2003軟件和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、數(shù)據(jù)處理和圖表制作,用R軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中形態(tài)特征的變化

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),巨柏種子萌發(fā)過(guò)程的第1～2天為巨柏種子吸脹時(shí)期;第4天巨柏種子種殼破裂露白;第6天胚根長(zhǎng)度達(dá)到2 mm,約為巨柏種子長(zhǎng)度的一半,開(kāi)始記錄種子萌發(fā);第8天胚根長(zhǎng)度達(dá)到1 cm,巨柏種子萌發(fā)達(dá)到高峰時(shí)期,可測(cè)定其種子發(fā)芽勢(shì);第12天胚根長(zhǎng)度為2～2.5 cm,可觀察到子葉生長(zhǎng),并有極少數(shù)種子的種皮脫落、子葉開(kāi)始展開(kāi);第16天胚根長(zhǎng)度為2.5～3.0 cm,子葉完全展開(kāi),萌發(fā)基本結(jié)束。

根據(jù)巨柏種子的萌發(fā)特征將巨柏種子的萌發(fā)過(guò)程劃分為7個(gè)階段:第一階段為未處理時(shí)期;第二階段為吸水膨脹的時(shí)期;第三階段為種殼破裂,出現(xiàn)露白的時(shí)期;第四階段為胚根長(zhǎng)度達(dá)到2 mm的時(shí)期;第五階段為胚根長(zhǎng)度達(dá)到1 cm的時(shí)期;第六階段為出現(xiàn)子葉的時(shí)期;第七階段為子葉展開(kāi)的時(shí)期。

2.2 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中含水量的變化

巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中含水量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),不同時(shí)期的含水量存在顯著差異。由表1、圖2可知,巨柏種子的含水量在浸種前最低,吸脹期間含水量顯著升高,日增長(zhǎng)速率達(dá)到12.97%,種子含水量由7.59%變?yōu)?3.53%;而后日增長(zhǎng)速率降低,為2.045%,含水量緩慢增長(zhǎng),巨柏種子的含水量在種殼破裂和種子開(kāi)始萌動(dòng)時(shí)分別為36.82%和45.80%;胚根開(kāi)始生長(zhǎng)后,含水量再一次顯著升高,日增長(zhǎng)速率約為4.12%,當(dāng)子葉完全展開(kāi)時(shí),巨柏種子的含水量可達(dá)78.77%。

圖1 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程的形態(tài)特征

圖2 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中含水量的變化

表1 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中生理指標(biāo)的差異性分析

2.3 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化

巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白的含量呈先降后升的變化趨勢(shì),可溶性糖的含量呈先升后降再升的變化趨勢(shì),見(jiàn)圖3。不同時(shí)期的可溶性蛋白和可溶性糖含量均存在顯著性差異,見(jiàn)表1。

圖3 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化

巨柏種子中可溶性蛋白的含量在種子吸脹時(shí)期幾乎沒(méi)有變化;隨著種子種殼破裂、出現(xiàn)露白,巨柏種子中可溶性蛋白的含量發(fā)生顯著變化,由292.62 mg/g降低為102.10 mg/g;在胚根生長(zhǎng)時(shí)期,巨柏種子中可溶性蛋白含量的降低速率減慢,但仍出現(xiàn)顯著性變化,并在第8天達(dá)到整個(gè)萌發(fā)時(shí)期的最低含量(80.00 mg/g);而后隨著子葉的出現(xiàn)和生長(zhǎng),可溶性蛋白含量顯著升高。

巨柏種子中可溶性糖含量在種子吸脹時(shí)期顯著升高;成熟的巨柏種子中可溶性糖含量較高,為28.10 mg/g。第4天種殼破裂、出現(xiàn)露白時(shí),巨柏種子可溶性糖含量達(dá)到最高,為41.08 mg/g;而后胚根開(kāi)始生長(zhǎng),可溶性糖含量逐漸降低,在第12天能觀察到子葉生長(zhǎng)時(shí)達(dá)到最低值,為1.07 mg/g;之后隨著子葉的生長(zhǎng),可溶性糖含量迅速顯著升高。

2.4 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中CAT和POD活性的變化

巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中CAT和POD活性均呈先升后降的變化趨勢(shì),且均存在顯著性差異。

由表1、圖4可知,巨柏種子的CAT活性在種殼破裂、出現(xiàn)露白之前沒(méi)有明顯變化,CAT活性顯著較低,約為0.79～2.70 U/g;隨著種殼破裂,種子開(kāi)始萌發(fā),CAT活性顯著升高,第8天達(dá)到巨柏種子萌發(fā)過(guò)程的最高值(134.63 U/g);子葉出現(xiàn)后,CAT活性略有降低但不存在顯著性變化,而后隨著子葉的生長(zhǎng),CAT活性開(kāi)始顯著下降。

圖4 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中CAT和POD活性的變化

巨柏種子的POD活性在子葉出現(xiàn)之前隨著種子的萌發(fā)逐漸升高,吸脹期間升高速率最快,可達(dá)22.71 μg/(g·d),POD活性升高為68.97 μg/g;之后速率降低,在第8天種子萌發(fā)達(dá)到高峰時(shí),巨柏種子的POD活性達(dá)到整個(gè)萌發(fā)過(guò)程的最高值(108.62 μg/g);而后隨著胚根和子葉的生長(zhǎng),POD活性顯著下降。

2.5 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表2可知,在巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中,萌發(fā)時(shí)間與含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和CAT活性均存在顯著相關(guān)性,其中萌發(fā)時(shí)間與含水量和CAT活性存在極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.943和0.608;與可溶性蛋白含量存在極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.713;與可溶性糖含量存在顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.470。含水量與可溶性蛋白含量和CAT活性存在顯著相關(guān)性,其中含水量與CAT活性存在顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.543;與可溶性蛋白含量存在極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.595?？扇苄缘鞍缀颗c可溶性糖含量和CAT活性存在顯著相關(guān)性,其中可溶性蛋白含量與可溶性糖含量存在顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.477;與CAT活性存在極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.694?？扇苄蕴呛颗cCAT活性存在極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.854。

表2 巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究中可溶性蛋白含量呈先降后升的變化趨勢(shì),與露水草和川續(xù)斷種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律相同[11-12]。蛋白質(zhì)是種子中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。成熟的巨柏種子中可溶性蛋白的含量較高,當(dāng)其開(kāi)始萌發(fā)后,種子內(nèi)貯藏的蛋白質(zhì)在酶的作用下被不斷分解成氨基酸并輸送至胚根,為種子萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng),可溶性蛋白含量迅速下降[13]。而后隨著子葉的生長(zhǎng),巨柏種子的可溶性蛋白含量升高,這可能是萌發(fā)的巨柏種子進(jìn)入新的代謝模式,合成大量新的蛋白質(zhì)。

可溶性糖含量的變化代表植物體內(nèi)碳水化合物的代謝過(guò)程,反映了種子內(nèi)部復(fù)雜的生理生化反應(yīng)規(guī)律。本研究中,可溶性糖含量呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì),與青蒿和掌葉木種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量的變化規(guī)律相同[14-15]。種子萌發(fā)過(guò)程中的代謝活動(dòng)自種子吸脹開(kāi)始,巨柏種子萌發(fā)初期,種子吸脹并于內(nèi)部進(jìn)行物質(zhì)代謝,可溶性糖含量逐漸升高,為種子進(jìn)一步萌發(fā)積蓄能量;胚根突破種皮的階段是種子萌發(fā)過(guò)程中物質(zhì)代謝最活躍的時(shí)期,隨著種殼破裂、出現(xiàn)露白,可溶性糖含量急劇下降,這可能是種子萌發(fā)過(guò)程需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量,使得種子內(nèi)貯藏的可溶性糖被大量分解、消耗[16];之后隨著子葉的生長(zhǎng),萌發(fā)后的巨柏種子生理機(jī)能逐漸完善,葉片開(kāi)始進(jìn)行光合作用并合成大量可溶性糖,巨柏種子的可溶性糖含量升高。

CAT和POD是植物組織內(nèi)廣泛存在的兩種酶,兩者可以協(xié)同反映種子萌發(fā)的活力大小和細(xì)胞的生長(zhǎng)分化狀況[17],進(jìn)而反映植物的抗衰老能力。多數(shù)研究認(rèn)為,種子內(nèi)POD的活性隨著種胚的生長(zhǎng)逐漸升高,且提高種子內(nèi)POD活性,可有效促進(jìn)種子萌發(fā)[18]。成熟的巨柏種子中CAT和POD活性較低,種子抗衰老能力較強(qiáng),極耐儲(chǔ)存。巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中CAT和POD活性呈先升后降的變化趨勢(shì),與浦梅[19]對(duì)滇重樓種子的研究結(jié)果一致。在巨柏種子萌發(fā)初期,種子萌發(fā)活力較大,細(xì)胞快速分化,CAT活性和POD活性升高,這與巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出的特征一致;而后隨著胚根和子葉的生長(zhǎng),種子萌發(fā)活力減弱,細(xì)胞分化速率減慢,CAT活性和POD活性降低。巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性的變化規(guī)律可能與以種子為主的代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀~片為主的代謝方式有關(guān)。

4 結(jié) 論

巨柏種子萌發(fā)過(guò)程劃分為7個(gè)階段。巨柏種子萌發(fā)過(guò)程中含水量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),可溶性蛋白含量呈先降后升的變化趨勢(shì),可溶性糖的含量呈先升后降再升的變化趨勢(shì),CAT活性和POD活性均呈先升后降的變化趨勢(shì)。

萌發(fā)時(shí)間與含水量和CAT活性存在極顯著正相關(guān),與可溶性蛋白含量存在極顯著負(fù)相關(guān),與可溶性糖含量存在顯著負(fù)相關(guān);含水量與CAT活性存在顯著正相關(guān),與可溶性蛋白含量存在極顯著負(fù)相關(guān);可溶性蛋白含量與可溶性糖含量存在顯著正相關(guān),與CAT活性存在極顯著負(fù)相關(guān);可溶性糖含量與CAT活性存在極顯著負(fù)相關(guān)。