裴會敏, 王 芬, 木 仁, 李國棟, 喻 佩

(1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院, 貴州 都勻 558000;2.貴州大學(xué)茶學(xué)院, 貴陽 550025)

貴州省地處云貴高原,海拔較高,為典型的喀斯特地貌,年均降水量較多,四季溫差小,冬暖夏涼,以陰天為主,日照較少,這些獨特的氣候條件十分適宜種植茶樹,使貴州省成為享譽(yù)全國的茶產(chǎn)業(yè)大省,有著“茶樹發(fā)源地”和“茶葉經(jīng)濟(jì)之鄉(xiāng)”的美稱[1]。截至2016年,貴州的茶樹種植面積達(dá)到4.4×105hm2,是茶樹種植面積最大的省份[2]。都勻毛尖茶是貴州省的優(yōu)良品種,是近代中國十大名茶之一,曾在巴拿馬食品博覽會上榮獲優(yōu)質(zhì)獎,享有“千年貢茶,百年金獎”的美譽(yù)。都勻毛尖茶具有外形條索緊結(jié)、卷曲纖細(xì)、滋味鮮爽甘甜等諸多特點,是中國高端茶葉中的上等精品,深受消費者的喜歡[3]。因此,開展都勻毛尖本地種茶樹莖、葉和根的蛋白質(zhì)組研究對茶樹品質(zhì)、質(zhì)量及抗逆相關(guān)的遺傳改良具有重要意義。

蛋白質(zhì)組源于蛋白質(zhì)與基因組學(xué)的雜合,意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”,即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[4-5]。隨著人們對茶樹研究的不斷深入,茶樹在蛋白質(zhì)組方面的研究也逐步展開。梁猛[6]利用iTRAQ技術(shù)對紫娟茶樹花青素代謝調(diào)控的差異蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究,為選育功能成分獨具特色的茶樹品種奠定基礎(chǔ)。李勤[7]對安吉白茶新梢生育期間蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)安吉白茶返白前與復(fù)綠后葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度發(fā)生了明顯改變,為后期培育茶樹新品種提供數(shù)據(jù)支持。莊重光[8]通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究了不同水分處理下鐵觀音茶樹的生理機(jī)制,為探尋茶樹優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的灌溉機(jī)理提供依據(jù)。袁清華[9]采用Lable-free技術(shù)研究了茶樹“信陽10號”生態(tài)休眠不同時期的蛋白質(zhì)組的變化,結(jié)果表明,差異蛋白可能是芽休眠形成的原因,并且類黃酮類生物合成和JA信號途徑可能參與了茶樹進(jìn)入生態(tài)休眠的過程。郭春芳等[10]利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,分析了鐵觀音茶樹幼苗在聚乙二醇脅迫下葉片蛋白組的變化。林金科等[11]采用蛋白組技術(shù)研究了無公害化學(xué)誘導(dǎo)因子可使茶樹葉片EGCG含量提高20%以上。Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析,該技術(shù)不需要使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn),只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù),比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號強(qiáng)度,從而對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量[12-13]。本研究以貴州都勻毛尖茶樹莖葉和根為研究材料,利用Label-free蛋白質(zhì)組技術(shù)研究茶樹葉、莖和根中的蛋白質(zhì)表達(dá)量并利用STRING 9.1數(shù)據(jù)庫[14]構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[15],為都勻毛尖茶樹生長發(fā)育及良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

茶苗選用種植于黔南民族師范學(xué)院后山基地的都勻毛尖茶樹扦插苗。選取9株生長環(huán)境和管理條件相同、生長發(fā)育水平相近且沒有病蟲害的健康茶苗植株,將茶苗洗凈擦干后分為3組,每組3株;在每組的植株上分別取嫩葉5片,3段5 cm莖,適量(5 g)根,每組3個生物學(xué)重復(fù),共9個重復(fù),分別放入離心管并迅速放入液氮中。采樣時在茶樹上剪取相同的部位、發(fā)育階段相似、完整無殘缺的葉片、莖和根,隨后將9個樣本放入實驗室的-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

尿素(Amresco,M 123-1 KG)、四乙基溴化銨TEAB(Sigma-Aldrich,T 7408-100 mL)、二硫蘇糖醇(Amresco,M 109-5 G)、碳酸氫銨(Sigma-Aldrich,A 6141-500 G)、甲酸(Sigma-Aldrich,T 79708)、乙腈(J.T.Baker, 34851 MSDS)、碘代乙酰胺(Amresco, M 216-30 G)。

離心機(jī)(Eppendorf)、電泳系統(tǒng)(bio-rad)、酶標(biāo)儀(DR 200 B)、渦旋振蕩器(SCILOGEX,型號:MX-S)。

1.2 蛋白質(zhì)提取和定量

將冷凍的樣本研磨成粉末,加入適量裂解液(lysis buffer)(8 mol/L尿素),渦旋混勻超聲1 s,停1 s,累計120 s。14 000 r/min離心20 min,取上清液,分裝,留取10 μL定量,其余凍入-80 ℃冰箱中。

采用Bradford法測定提取的蛋白質(zhì)濃度。先將樣本用裂解液(lysis buffer)進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋使其終濃度在標(biāo)準(zhǔn)線范圍內(nèi),稀釋好的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各取10 μL分別和300 μL蛋白定量燃料避光反應(yīng)10 min,用酶標(biāo)儀同時測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在595 nm下的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每管吸光值和濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后計算樣本濃度。

每例樣本取5 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色30 min,脫色直至背景清晰。

1.3 酶解脫鹽

取出100 μg蛋白,加入終濃度為10 mol/L二硫蘇糖醇,37 ℃ 1 h,然后恢復(fù)至室溫。加入終濃度為40 mol/L的碘代乙酰胺,避光室溫45 min。使用碳酸氫銨稀釋樣本,測量pH=8并按照蛋白和胰酶比例50∶1加入胰酶,37 ℃過夜。次日,加入50 μL 0.1%的甲酸進(jìn)行終止反應(yīng)。使用C 18脫鹽柱對樣本進(jìn)行脫鹽,100%乙腈活化脫鹽柱,0.1%甲酸平衡柱子,加載樣本到柱子上,隨后使用0.1%甲酸洗滌柱子,洗掉雜質(zhì),最后使用70%乙腈洗脫,收集流穿液,凍干。

1.4 LC-MS/MS質(zhì)譜分析

配制流動相A液(100%水、0.1%甲酸)和B液(80%乙腈、0.1%甲酸)。使用10 μL A液溶解凍干粉末,4 ℃下14 000 r/min離心20 min,取上清液1 μg樣品進(jìn)樣,液質(zhì)檢測,洗脫梯度:0 min(8%B),5 min(12%B),35 min(30%B),44 min(40%B),45 min(95%B),60 min(95%B),分離流速600 nL/min。使用Orbitrap ExplorisTM480質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式,質(zhì)譜全掃描范圍為350～1 200 m/z,一級質(zhì)譜分辨率設(shè)為60 000(200 m/z),二級質(zhì)譜檢測采用“Top Speed”模式,生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Proteome Discoverer 2.4軟件進(jìn)行Uniprot搜庫,獲得蛋白質(zhì)和肽段定性和定量的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果評估

質(zhì)譜鑒定到的肽段長度范圍為15～36個氨基酸,肽段長度在15～18個之間達(dá)到峰值(圖1 A)。鑒定到肽段的PSM(二級肽段譜圖)數(shù)目分布情況,匹配到肽段的PSM數(shù)目范圍為1～19個(圖1 B),平均每個肽段捕獲的PSM數(shù)目越少,說明質(zhì)譜能更有效避開重復(fù)取樣而獲得更多的結(jié)果,而平均PSM數(shù)量越多,則說明單個肽段鑒定的可靠性越高。鑒定到蛋白質(zhì)的肽段分布中含有1個肽段的蛋白質(zhì)最多,其次是含有2個肽段的蛋白次多,說明肽段的蛋白質(zhì)鑒定效率高,蛋白質(zhì)的數(shù)量相對集中在1～20個肽段的范圍內(nèi)(圖1 C)。蛋白質(zhì)的覆蓋率越高,對于解釋蛋白異構(gòu)體等越有利。鑒定到蛋白質(zhì)的覆蓋率在2%～6%達(dá)到峰值,覆蓋率在64%以上的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎為零(圖1 D)。

圖1 Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的多肽長度、PSM數(shù)量、肽段數(shù)量和覆蓋率分布

2.2 主成分分析

對都勻毛尖茶樹葉、根、莖的9個樣本的蛋白質(zhì)組進(jìn)行主成分分析,葉、莖和根的蛋白質(zhì)基本上可以區(qū)分(圖2),表明在實驗過程中數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好。主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為63.2%和18.9%,樣品累積貢獻(xiàn)率為82.1%,說明這兩個主成分解釋了82.1%的原始變量信息,代表性較好。

圖2 葉、莖和根蛋白質(zhì)定量的主成分分析

2.3 蛋白質(zhì)表達(dá)分析

2.3.1蛋白質(zhì)功能注釋

對鑒定到的1 963個蛋白質(zhì)進(jìn)行GO、KEGG和COG注釋,總共有1 766個蛋白質(zhì)被注釋,其中1 573個蛋白質(zhì)注釋到GO數(shù)據(jù)庫,881個蛋白質(zhì)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫,1 228個蛋白質(zhì)注釋到COG數(shù)據(jù)庫。

在GO注釋中,187個蛋白質(zhì)注釋到膜的組成部分中,173個蛋白質(zhì)注釋到ATP結(jié)合,116個蛋白質(zhì)注釋到金屬離子結(jié)合,28個蛋白質(zhì)具有過氧化物酶活性,20個蛋白質(zhì)參與防御反應(yīng), 7個蛋白質(zhì)與發(fā)病原相關(guān),7個蛋白質(zhì)與毒素活性有關(guān),5個蛋白質(zhì)參與脫落酸激活的信號通路,5個蛋白質(zhì)參與脫落酸結(jié)合,4個蛋白質(zhì)參與木質(zhì)素分解過程,3個蛋白質(zhì)參與對生物刺激的反應(yīng), 2個蛋白質(zhì)參與對真菌的防御反應(yīng),2個蛋白質(zhì)參與茉莉酸生物合成過程,1個蛋白質(zhì)參與對細(xì)菌的防御反應(yīng),1個蛋白質(zhì)參與脫落酸生物過程的調(diào)控(圖3)。過氧化物酶和木質(zhì)素可有效防御病蟲害的侵染[16-18],茉莉酸和脫落酸途徑參與調(diào)控植物防御病蟲害的防御反應(yīng)[19-20],說明以上蛋白質(zhì)在防御茶樹病蟲害方面具有重要作用。

圖3 蛋白質(zhì)GO功能注釋

在KEGG注釋中,有133個蛋白質(zhì)參與果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、N多糖生物合成、氨基酸糖和核苷酸糖代謝、糖胺聚糖降解等糖類代謝途徑。有317個蛋白質(zhì)參與纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的降解和生物合成、賴氨酸的降解和生物合成、精氨酸和脯氨酸的代謝等各種氨基酸的代謝途徑。有11個蛋白質(zhì)參與類黃酮、黃酮和黃酮醇等的生物合成(圖4)。糖類決定茶的甜味,氨基酸使茶具有鮮爽味,茶多酚使茶具有苦澀味,因此,以上蛋白質(zhì)經(jīng)過多種代謝途徑形成了茶的滋味的重要組成成分。

2.3.2蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用Label-free蛋白質(zhì)組技術(shù)對都勻毛尖茶樹的葉、莖和根中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析,共獲得1 963個蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)與STRING 9.1數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對獲得葉、莖和根中的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),1 057個節(jié)點,15 500個相互作用。利用Cytoscape 3.3.0軟件可視化蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并預(yù)測出關(guān)鍵蛋白。對預(yù)測出的都勻毛尖茶樹蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?網(wǎng)絡(luò)聚合系數(shù)為0.376,網(wǎng)絡(luò)直徑12,網(wǎng)絡(luò)半徑為1,平均鄰居數(shù)14.664。網(wǎng)絡(luò)度分布符合冪律分布的規(guī)律(圖5 A),度是指網(wǎng)絡(luò)中的一個蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的互作數(shù),度分布P(x)=59.719x-0.597,相關(guān)系數(shù)0.617,R2=0.531。拓?fù)湎禂?shù)是一個蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)共有鄰居蛋白質(zhì)程度的相對度量,P(x)=0.99x-0.424,相關(guān)系數(shù)0.776,R2=0.648(圖5 B)。最短路徑是網(wǎng)絡(luò)中一個蛋白質(zhì)到其他各個蛋白質(zhì)的最短邊數(shù),最短路徑分布(圖5 C)可以應(yīng)用在疾病的治療方面。蛋白質(zhì)的鄰域連通性定義為某一個蛋白質(zhì)的所有鄰居的平均連通性。鄰域連通性分布(圖5 D)是具有k個鄰居的所有蛋白質(zhì)的鄰域連通性的平均值。以上結(jié)果說明網(wǎng)絡(luò)是一種無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò),具有小世界特性。

圖4 蛋白質(zhì)KEGG功能注釋

圖5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦?/p>

3 討 論

本研究以貴州都勻地區(qū)都勻毛尖茶樹的葉莖和根為材料,利用Label-free蛋白質(zhì)組技術(shù)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)對茶樹葉片、莖和根的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析,共鑒定出1 963個蛋白質(zhì)。對蛋白質(zhì)進(jìn)行GO和KEGG注釋,并進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

圖6 氨基酸生物合成與代謝的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖7 類黃酮生物合成途徑

在GO注釋中,5個蛋白質(zhì)(A 0 A 4 S 4 DNH 8;A 0 A 4 S 4 F 3 B 6;A 0 A 4 S 4 ECK 1;A 0 A 4 S 4 EKT 6;A 0 A 4 S 4 DC 94)參與絲氨酸生物合成過程。4個蛋白質(zhì)參與芳香族氨基酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 DR 40;A 0 A 4 S 4 DA 65;A 0 A 4 S 4 DLY 2;A 0 A 4 S 4 EW 76)。3個蛋白質(zhì)參與異亮氨酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 ENQ 7;A 0 A 4 S 4 DEB 8;A 0 A 4 S 4 CWV 2),3個蛋白質(zhì)參與甲硫氨酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 D 702;A 0 A 4 S 4 CWR 4;A 0 A 4 S 4 DEB 8)。2個蛋白質(zhì)參與纈氨酸生物合成(A 0 A 4 S 4 ENQ 7;A 0 A 4 S 4 CWV 2)。2個蛋白質(zhì)參與氨基酸結(jié)合(A 0 A 4 S 4 D 6 F 1;A 0 A 4 S 4 E 3 N 5)。1個蛋白質(zhì)參與脯氨酸生物合成過程(A 0 A 4 V 3 WPG 1)。1個蛋白質(zhì)參與谷氨酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 DIC 5)。1個蛋白質(zhì)參與亮氨酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 EQ 52)。1個蛋白質(zhì)參與蛋氨酸代謝過程(A 0 A 4 V 3 WKL 4)。8個蛋白質(zhì)參與細(xì)胞氨基酸代謝過程(A 0 A 4 V 3 WN 11;A 0 A 4 S 4 E 3 N 5;A 0 A 4 S 4 D 389;A 0 A 4 S 4 DKZ 2;A 0 A 4 V 3 WP 54;A 0 A 4 S 4 E 3 T 5;A 0 A 4 S 4 E 0 B 0;A 0 A 4 S 4 DNP 9)。3個蛋白質(zhì)參與細(xì)胞氨基酸生物合成過程(A 0 A 4 S 4 DXY 0;A 0 A 4 S 4 DMD 9;A 0 A 4 S 4 DXF 9)。從都勻毛尖茶樹蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中提取出參與氨基酸生物合成與代謝的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖6),共有116個蛋白質(zhì),153個相互作用,推測這些參與氨基酸生物合成與代謝的蛋白質(zhì)相互作用在都勻毛尖茶葉品質(zhì)形成中具有重要作用。氨基酸是茶葉鮮味的主要來源,也是形成干茶香氣的重要底物,在受熱條件下,氨基酸與糖類等發(fā)生“美拉德”反應(yīng),產(chǎn)生令人愉悅的焦糖香氣。因此,氨基酸是決定都勻毛尖茶葉品質(zhì)的重要成分,與劉劍君等[21]、王春波等[22]的研究結(jié)果一致。

在KEGG注釋中,有10個蛋白質(zhì)參與類黃酮的生物合成,黃酮類化合物能防治老年高血壓、腦溢血、冠心病,具有止咳、抗菌的活性,還具有護(hù)肝、解肝毒和抗氧化作用。在類黃酮生物合成途徑中(圖7),對香豆酰CoA在查耳酮合成酶(CHS)作用下合成柚皮素查耳酮,并在查耳酮異構(gòu)酶(CHI)作用下環(huán)化得到柚皮素。柚皮素在類黃酮3′-羥化酶(F 3′H)、類黃酮3′,5′-羥化酶(F 3′,5′H)作用下得到圣草酚,隨后被黃烷酮3-羥化酶(F 3 H)和二氫黃烷醇4-還原酶(DFR)催化還原合成無色花青素。無色花青素可被還原酶(LAR)直接還原得到兒茶素,也可被無色花青素雙加氧酶(LDOX)和花青素還原酶(ANR)連續(xù)催化得到表型兒茶素。圣草酚在F 3 H的催化下得到二氫槲皮素,接著在F′5′H、DFR和LAR的催化下得到?jīng)]食子兒茶素,再在LDOX和ANR的作用下得到表沒食子兒茶素,與前人研究結(jié)果一致[23-25]。兒茶素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病菌以及保護(hù)心腦器官等多種藥理作用。類黃酮和兒茶素總體上具苦澀味,收斂感,是茶葉重要的滋味成分,是決定都勻毛尖茶葉品質(zhì)的重要成分。

在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中,對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了聚合系數(shù)、網(wǎng)絡(luò)直徑、網(wǎng)絡(luò)半徑、平均鄰居數(shù)、網(wǎng)絡(luò)度分布、拓?fù)湎禂?shù)和最短路徑分析,網(wǎng)絡(luò)具有小世界特性,是一種無尺度網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測關(guān)鍵蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的功能。因此,通過網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測一些在茶葉品質(zhì)形成過程中的相關(guān)的蛋白質(zhì)。A 0 A 4 S 4 DAB 8(Ubiquitin receptor RAD 23)是一種泛素受體蛋白質(zhì),度為1 554,因此,與之互作的1 554個蛋白質(zhì)也可能具有泛素結(jié)合的功能。A 0 A 4 V 3 WL 21(Ubiquitin-like domain-containing protein)度為1 528,與之互作的蛋白質(zhì)也可能具有與泛素結(jié)合相關(guān)的功能。A 0 A 4 S 4 EBY 0(Ubiquitin-like domain-containing protein)度為1 520,研究結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)都是度最大的蛋白質(zhì)即關(guān)鍵蛋白,并且功能都與泛素結(jié)合相關(guān)。而在氨基酸生物合成中有96個蛋白,這些蛋白對增進(jìn)茶湯的滋味和濃度有重要的作用,與茶葉的鮮味有關(guān)。因此,這96個蛋白的互作蛋白也可能與茶葉的品質(zhì)相關(guān),在它們復(fù)雜的相互作用下產(chǎn)生令人愉悅的香味。例如A 0 A 4 S 4 DET 5(Alanine transaminase)是一種丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶,具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性,與它互作的24個蛋白也可能具有類似的功能。通過網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。本研究結(jié)果為培育良種茶樹提供數(shù)據(jù)支持。