侯 雨，朱 琳，張奇鑌，葉小風(fēng)，柯俏穎，徐志士，魏穎慧

大黃-黃芪組分自微乳的制備及在體腸吸收特性研究

侯 雨，朱 琳，張奇鑌，葉小風(fēng)，柯俏穎，徐志士，魏穎慧*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

研究大黃-黃芪多組分自微乳的處方與制備工藝，評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量，并考察其大鼠腸吸收特性。通過(guò)溶解度實(shí)驗(yàn)、油相與乳化劑和助乳化劑配伍實(shí)驗(yàn)及偽三元相圖的繪制，篩選出最優(yōu)處方組成；并從自微乳的外觀、形態(tài)、粒徑、穩(wěn)定性等方面對(duì)自微乳進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)考察自微乳的腸吸收特性。自微乳處方中油相為辛酸癸酸單雙甘油酯、乳化劑為聚氧乙烯蓖麻油35、助乳化劑為乙二醇。在微乳形成區(qū)選擇各輔料用量，采用適宜方法加入大黃總蒽醌及黃芪總皂苷制得的組分自微乳，外觀均一透明，加水分散后形成黃色乳光的微乳液，透射電鏡顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）下觀察到微乳分散均勻，無(wú)黏連，呈大小均一圓球形乳滴；平均粒徑為（33.01±0.12）nm、多分散指數(shù)（polydispersion index，PDI）為0.10±0.02、電位為（?10.10±1.00）mV；自微乳中大黃總蒽醌和黃芪總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.29、8.80 mg/g。自微乳中大黃總蒽醌在十二指腸、空腸段的吸收速率常數(shù)（a）及表觀吸收系數(shù)（app）較回腸段均有顯著提高；黃芪總皂苷在小腸吸收良好，各腸段間無(wú)顯著性差異。篩選出的自微乳處方對(duì)大黃-黃芪多組分具有良好的負(fù)載性能，乳化效率高；自微乳中大黃總蒽醌及黃芪總皂苷在小腸各段均有良好的吸收，有望改善二者的生物利用度以更好地發(fā)揮其協(xié)同作用。

大黃總蒽醌；黃芪總皂苷；自微乳給藥系統(tǒng)；處方研究；偽三元相圖；在體腸吸收

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）為世界重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全球發(fā)病率為10.0%～13.0%[1]，其主要病理特征為各種原因?qū)е碌哪I臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[2-3]。目前，臨床藥物治療主要包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑等[4-6]，但都僅能延緩CKD向終末期腎病的進(jìn)展。因此，繼續(xù)探索CKD的有效治療方法具有重大意義。中醫(yī)將CKD歸屬為“虛勞”“水腫”“癃閉”“腰痛”“關(guān)格”等范疇，臨床治療多以“補(bǔ)虛培本，益腎健脾，泄?jié)峤舛?，化瘀通絡(luò)”為法[7-9]，常采用加味桃仁承氣湯、尿毒清利湯、腎毒寧、健脾補(bǔ)腎湯、補(bǔ)脾化濕湯等經(jīng)方、驗(yàn)方。這些方劑中常以大黃-黃芪配伍，共奏攻邪補(bǔ)益之效。由二者配伍制成的醫(yī)院制劑大黃黃芪膠囊用于治療CKD氮質(zhì)血癥、尿毒癥及腎纖維化已有數(shù)十年，具有較明確的臨床有效性及安全性[10]。然而，由于大黃黃芪膠囊為第一代傳統(tǒng)中藥制劑（兩藥均直接粉碎入藥），存在所含成分復(fù)雜、給藥劑量大、物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制不明、釋藥行為不明、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)不清晰、起效緩慢等問(wèn)題[11]，在很大程度上限制了大黃黃芪膠囊藥效的發(fā)揮及廣泛應(yīng)用。研究表明，大黃總蒽醌和黃芪總皂苷分別是大黃和黃芪治療CKD的有效組分[12-15]。然而，大黃總蒽醌與黃芪總皂苷較差的水溶性，導(dǎo)致其口服生物利用度很低[16-17]，且二者在理化性質(zhì)、生物藥劑學(xué)性質(zhì)等方面也存在較大差異，阻礙了二者協(xié)同作用的發(fā)揮。

近年來(lái)，脂質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)（固體脂質(zhì)納米粒、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米乳、納米脂質(zhì)體、自微乳等）被廣泛用于經(jīng)胃腸道遞送藥物而提高其口服生物利用度[18-20]。其中自微乳因具有顯著提高生物利用度、增加藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒性的優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于經(jīng)胃腸遞送中藥成分或有效部位[21]，但大多用于遞送中藥單一成分或單組分[22-24]，較少用于遞送中藥多組分。因此，本研究擬制備大黃總蒽醌-黃芪總皂苷多組分自微乳，以有效提高二者口服生物利用度，并充分發(fā)揮二者的協(xié)同作用，同時(shí)采用大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)自微乳的腸吸收特性，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，并為中藥多組分協(xié)同治療CKD提供思路和方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SpectraMax M2e型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Nano-ZS 90型激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern公司；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社；BT100-2J型恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；Waters型高效液相色譜儀，2998全波長(zhǎng)檢測(cè)器，2424 ELSD檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；Eppendorf 5427R型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf有限公司；CP225D型電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司；Mill-Q型超純水器，美國(guó)Millpore公司。

1.2 藥品與試劑

大黃總蒽醌，南京世洲生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞50%，批號(hào)2021；黃芪總皂苷，成都錦泰和有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%，批號(hào)AGS-98-21120；對(duì)照品蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芪甲苷，上海詩(shī)丹德有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)分別為6530、5996、5940、5834、5995、5081；聚山梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油35、聚乙二醇400（PEG400），上海源葉生物科技有限公司；聚山梨酯20，上海生工生物工程有限公司；1,2-丙二醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；異丙醇，廣東光華科技有限公司；丙三醇，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；油酸乙酯，廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸異丙酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；橄欖油，上海麥克林生化科技股份有限公司；辛酸癸酸單雙甘油酯，嘉法獅貿(mào)易有限公司。

1.3 動(dòng)物

健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理/管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)SYXK（浙）2019-0024。

2 方法與結(jié)果

2.1 自微乳中藥物含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 自微乳中大黃總蒽醌含量測(cè)定方法

（1）色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；體積流量1.0 mL/min。

（2）對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆薈大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液（402 μg/mL）、大黃酸對(duì)照品儲(chǔ)備液（402 μg/mL）、大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液（376 μg/mL）、大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備液（400 μg/mL）和大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備液（392 μg/mL）。

（3）混合對(duì)照品溶液的制備：分別精密量取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚各對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0 mL，大黃酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的質(zhì)量濃度分別為40.2、80.4、37.6、40.0、39.2 μg/mL）。

（4）供試品溶液的制備：精密稱取自微乳液0.100 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，于4000 r/min離心10 min，取上清，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

（5）專屬性試驗(yàn)：分別取溶劑、混合對(duì)照品溶液、空白自微乳供試品溶液及自微乳供試品溶液各20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄圖譜（圖1）。結(jié)果表明，溶劑及輔料對(duì)自微乳中大黃總蒽醌的含量測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性良好。

（6）線性范圍考察：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以峰面積（）對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得蘆薈大黃素回歸方程：＝98 186＋57 704，2＝0.999 3（＝6），線性范圍為1.26～40.2 μg/mL；大黃酸回歸方程：＝28 865＋12 325，2＝0.999 7（＝6），線性范圍為1.26～40.0 μg/mL；大黃素回歸方程：＝54 923＋46 656，2＝0.999 2（＝6），線性范圍為1.18～37.6 μg/mL；大黃酚回歸方程：＝79 146＋174.19，2＝0.999 9（＝6），線性范圍為1.25～40.0 μg/mL；大黃素甲醚回歸方程：＝56 073＋39 042，2＝0.999 1（＝6），線性范圍為1.22～39.2 μg/mL。

（7）方法學(xué)考察：參照《中國(guó)藥典》2020年版四部方法進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的日內(nèi)精密度、日間精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性RSD均小于2.00%，平均加樣回收率為103.20%，該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

1-蘆薈大黃素 2-大黃酸 3-大黃素 4-大黃酚 5-大黃素甲醚

（8）樣品測(cè)定：分別取適量樣品溶液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚含量，采用自定義權(quán)重系數(shù)法整合大黃總蒽醌含量[25-26]。具體方法：根據(jù)大黃總蒽醌中5種主要成分的質(zhì)量占比，設(shè)定蘆薈大黃素的加權(quán)系數(shù)為15.0%、大黃酸的加權(quán)系數(shù)為3.0%、大黃素的加權(quán)系數(shù)為9.3%、大黃酚的加權(quán)系數(shù)為61.5%、大黃素甲醚的加權(quán)系數(shù)為11.2%，則大黃總蒽醌的含量＝蘆薈大黃素的含量×15.0%＋大黃酸的含量×3.0%＋大黃素的含量×9.3%＋大黃酚的含量×61.5%＋大黃素甲醚的含量×11.2%。

2.1.2 自微乳中黃芪總皂苷的含量測(cè)定方法

（1）色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫程序：0～15 min，30%～70%乙腈；16～20 min，70%～30%乙腈；檢測(cè)時(shí)間為20 min；柱溫35 ℃；增益為135 dB；漂移管溫度為85 ℃；氣體壓力為275.790 kPa（40 psi）；進(jìn)樣量20 μL；體積流量1.0 mL/min。

（2）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液（796 μg/mL）。

（3）供試品溶液的制備：同“2.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液制備”。

（4）專屬性試驗(yàn)：分別取溶劑、混合對(duì)照品溶液、空白自微乳供試品溶液及自微乳供試品溶液各20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄圖譜（圖2）。結(jié)果表明，溶劑及輔料對(duì)自微乳中黃芪總皂苷的含量測(cè)定無(wú)影響，方法專屬性良好。

圖2 空白溶劑(A)、黃芪甲苷對(duì)照品(B)、空白自微乳(C)、大黃-黃芪組分自微乳(D)的HPLC圖

（5）線性范圍考察：分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備系列質(zhì)量濃度的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以黃芪甲苷峰面積（）對(duì)質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程：＝7 743.3－177 156，2＝0.999 8（＝6），線性范圍為25.9～414.0 μg/mL。

（6）方法學(xué)考察：參照《中國(guó)藥典》2020年版四部方法進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明，黃芪甲苷的日內(nèi)精密度RSD為1.62%、日間精密度RSD為1.64%，穩(wěn)定性RSD為1.58%，重復(fù)性RSD為1.31%，平均加樣回收率為101.08%，該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

（7）樣品測(cè)定：分別取適量樣品溶液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定黃芪甲苷含量。因黃芪甲苷為黃芪總皂苷代表性活性成分，因此本實(shí)驗(yàn)以黃芪甲苷含量表征黃芪總皂苷含量[27-28]。

2.2 組分自微乳的制備及處方優(yōu)化

2.2.1 溶解度試驗(yàn) 分別于1 g油相、乳化劑及助乳化劑中加入過(guò)量大黃總蒽醌或黃芪總皂苷，渦旋混合均勻密封后，置于37 ℃、180 r/min恒溫震蕩器中震蕩24 h，至平衡后，5000 r/min離心（離心半徑為5 cm）10 min，吸取適量上清加甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定大黃總蒽醌及黃芪總皂苷含量，計(jì)算大黃總蒽醌及黃芪總皂苷在各油相、乳化劑及助乳化劑中的溶解度。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，大黃總蒽醌在各油相中的溶解度大小為油酸乙酯＞辛酸癸酸單雙甘油酯＞肉豆蔻酸異丙酯＞橄欖油；黃芪總皂苷在此4種油相中的溶解度均極低，且油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、橄欖油會(huì)干擾黃芪總皂苷的測(cè)定，因此，選擇辛酸癸酸單雙甘油酯作為油相。大黃總蒽醌在各乳化劑中的溶解度大小為聚山梨酯20＞聚氧乙烯蓖麻油35＞聚山梨酯80；黃芪總皂苷在3種乳化劑中的溶解度無(wú)顯著性差異，因此該3者均作為備選乳化劑；對(duì)于助乳化劑，大黃總蒽醌及黃芪總皂苷在乙二醇、1,2-丙二醇及聚乙二醇400中溶解度均較高，因此，乙二醇、1,2-丙二醇及聚乙二醇400均作為備選助乳化劑。

2.2.2 乳化劑篩選 為進(jìn)一步優(yōu)選乳化劑并考察輔料的相容性，將辛酸癸酸單雙甘油酯（油相）與聚氧乙烯蓖麻油35、聚山梨酯20及聚山梨酯80分別以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6比例混合，渦旋均勻后，吸取50 μL于磁力攪拌下滴加至5 mL超純水中，觀察自乳化情況并測(cè)定乳滴粒徑及分散系數(shù)（polymer dispersity index，PDI）。將自乳化情況按照以下5個(gè)級(jí)別進(jìn)行評(píng)定：a）澄清或略泛藍(lán)光；b）略渾濁，呈藍(lán)白色；c）不透明，藍(lán)白色液體；d）色澤灰暗，呈灰白色；e）難以乳化，有油浮于液面。

表1 大黃總蒽醌與黃芪總皂苷在各輔料中的溶解度(, n = 3)

自乳化情況結(jié)果表明，以聚氧乙烯蓖麻油35、聚山梨酯80為乳化劑時(shí)，油/乳化劑比例為4∶6、3∶7、2∶8、1∶9時(shí)，微乳自乳化情況均為a級(jí)；以聚山梨酯20為乳化劑時(shí)，油相/乳化劑比例為4∶6、3∶7、1∶9時(shí)，自乳化情況均為a級(jí)。此外，以聚氧乙烯蓖麻油35為乳化劑時(shí)，形成的微乳具有較小的粒徑及PDI，結(jié)果見(jiàn)表2。因此，選擇乳化效果好的聚氧乙烯蓖麻油35為乳化劑。

表2 含不同乳化劑微乳粒徑及PDI (, n = 3)

2.2.3 助乳化劑篩選 將聚氧乙烯蓖麻油35與各助乳化劑分別以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例混合后，再將辛酸癸酸單雙甘油酯與混合乳化劑分別以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5比例旋渦混合均勻后吸取適量于磁力攪拌下滴加至5 mL超純水中，記錄相變點(diǎn)，采用Origin 8.5軟件繪制偽三元相圖。結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，以乙二醇為助乳化劑時(shí)，形成的微乳區(qū)域最大，因此選用乙二醇作為助乳化劑。

2.2.4 組分自微乳的制備 在偽三元相圖中微乳形成區(qū)任選一點(diǎn)處方比例制備大黃總蒽醌-黃芪總皂苷自微乳。稱取處方量的聚氧乙烯蓖麻油35及乙二醇中于燒杯中，加入大黃總蒽醌及黃芪總皂苷，超聲2 h，混合均勻；另稱取處方量辛酸癸酸單雙甘油酯，于磁力攪拌下加入上述混合溶液，混合均勻后超聲2 h，即得組分自微乳。

圖3 不同助乳化劑(PEG400、丙三醇、乙二醇)制備的自微乳的偽三元相圖

2.3 組分自微乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 微乳粒徑、ζ電位及形態(tài) 稱取所制備的自微乳適量，攪拌下滴加至超純水中，形成帶黃色乳光的微乳液，以超純水適當(dāng)稀釋后，采用Nano-ZS 90激光粒度分析儀測(cè)定微乳粒徑、PDI及ζ電位，結(jié)果表明，所得微乳平均粒徑為（33.01±0.12）nm，PDI為0.10±0.02，ζ電位為（?10.10±1.00）mV （＝3）。將適量微乳液滴加至銅網(wǎng)上，鋪展均勻后滴加2.0%磷鎢酸溶液，負(fù)染10 min，從邊緣吸去多余微乳液，室溫條件下自然晾干，于TEM下觀察微乳的形貌，結(jié)果表明，自微乳乳化后形成的微乳為分散均勻，無(wú)黏連，大小均一圓球形乳滴。TEM見(jiàn)圖4。

圖4 組分微乳液的TEM圖

2.3.2 自微乳中大黃總蒽醌和黃芪總皂苷含量測(cè)定 平行制備3批組分自微乳，分別按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得自微乳中大黃總蒽醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（6.29±0.07）mg/g，黃芪總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（8.80±0.11）mg/g。

2.3.3 自微乳初步穩(wěn)定性 取所制備的自微乳3份，分別于攪拌下滴加至超純水中，均勻乳化后，分別于0、2、4、8、12、24、48、96、144 h后測(cè)定所得微乳粒徑、PDI及ζ電位，結(jié)果如表3所示，自微乳均勻乳化后在測(cè)定時(shí)間內(nèi)粒徑PDI與ζ電位均幾無(wú)變化，表明微乳的穩(wěn)定性良好。

2.4 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)

取健康SD大鼠12只（實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水），隨機(jī)分為3組（十二指腸組、空腸組、回腸組）。ip 20%烏拉坦（1 g/kg），麻醉后固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，沿腹中線剪開(kāi)腹腔，結(jié)扎膽管，仰臥固定于保溫墊上（37 ℃），手術(shù)剪刀沿腹部正中線打開(kāi)腹腔，依次小心分離大鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，分別于各腸段兩端切口，插入硅膠管并用細(xì)線結(jié)扎，進(jìn)口端連接蠕動(dòng)泵，出口端連接已知質(zhì)量的離心管，開(kāi)口處以生理鹽水浸潤(rùn)的紗布覆蓋保濕，電熱毯保溫。先用生理鹽水沖洗腸道至洗出物澄清后，再使用預(yù)熱至37 ℃的K-R溶液以1 mL/min灌流腸段平衡15 min，采用供試液繼續(xù)平衡30 min后，調(diào)節(jié)體積流量為0.2 mL/min進(jìn)行恒速灌流，并分別在0、15、30、45、60、75、90、105、120 min更換離心管收集流出液，記錄離心管質(zhì)量后，取出0.5 mL灌流液，加甲醇0.5 mL，渦旋混勻后于4000 r/min離心（離心半徑為7 cm）10 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定灌流液中大黃總蒽醌及黃芪總皂苷含量。試驗(yàn)結(jié)束后，剪下灌流腸段并記錄直徑及長(zhǎng)度，測(cè)量其長(zhǎng)度與周長(zhǎng)，測(cè)量3次周長(zhǎng)計(jì)算平均內(nèi)徑。按公式（1）（2）計(jì)算吸收速率常數(shù)（a）及表觀吸收系數(shù)（app）。

表3 不同儲(chǔ)存時(shí)間自微乳粒徑、PDI及ζ電位(, n = 3)

a＝(1－outout/inin)/2π（1）

app＝ln(inin/outout)/2π（2）

in、out分別為腸道進(jìn)出口灌流液中藥物質(zhì)量濃度，in、out分別為腸道灌流進(jìn)出口灌流液體積，為灌流腸段橫截面半徑，為灌流腸段的長(zhǎng)度，為灌流體積流量（0.2 mL/min）

組分自微乳在大鼠各腸段吸收參數(shù)見(jiàn)表4。自微乳中大黃總蒽醌及黃芪總皂苷在整個(gè)小腸腸段均有較好的吸收。其中大黃總蒽醌在十二指腸與空腸段較在回腸段的吸收更好（＜0.05）；黃芪總皂苷在各小腸段吸收無(wú)顯著性差異。此外，大黃總蒽醌中的蘆薈大黃素及大黃素的吸收以十二指腸最高；大黃酸及大黃素甲醚吸收以空腸段最高；大黃酚在各小腸段的吸收無(wú)顯著性差異。

表4 自微乳中大黃總蒽醌、黃芪總皂苷在不同腸段的吸收參數(shù)(, n = 3)

十二指腸空腸：*＜0.05；十二指腸回腸：#＜0.05##＜0.01；空腸回腸：&＜0.05

duodenumjejunum:*< 0.05; duodenumileum:#< 0.05##< 0.01; jejunumileum:&< 0.05

3 討論

自微乳可與脂蛋白結(jié)合形成乳糜微粒后通過(guò)腸道淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，也可以直接通過(guò)細(xì)胞旁路途徑、腸上皮細(xì)胞和腸道相關(guān)淋巴組織的內(nèi)吞作用進(jìn)入腸道淋巴系統(tǒng)，因此，可顯著提高難溶性藥物的口服生物利用度[29-30]。本研究將大黃-黃芪組分（大黃總蒽醌和黃芪總皂苷）制備成自微乳以提高二者的口服生物利用度以利于多組分發(fā)揮協(xié)同作用。前期研究中，參考大黃黃芪膠囊原方中大黃與黃芪劑量比及大黃中總蒽醌含量、黃芪中總皂苷含量，設(shè)置了大黃總蒽醌與黃芪總皂苷比例（1∶0.6、1∶1.0、1∶1.4、1∶2.0、1∶5.0），采用NRK-49F及HK-2細(xì)胞模型，確定了二者協(xié)同比，因此，本研究所制備的自微乳中大黃總蒽醌與黃芪總皂苷的質(zhì)量比為1∶1.4。

此外，因大黃總蒽醌在聚氧乙烯蓖麻油35中的溶解度，黃芪總皂苷在乙二醇中的溶解度遠(yuǎn)高于二者在各油相中的溶解度，故在載藥自微乳的制備中采用了將大黃總蒽醌及黃芪總皂苷先溶于聚氧乙烯蓖麻油35及乙二醇中，再與油相進(jìn)行混合的制備工藝。結(jié)果表明，所制得的自微乳外觀澄清、透明，乳化后形成的微乳平均粒徑為（33.01±0.12）nm，粒度分布均勻，穩(wěn)定性良好。

在體單向腸灌流具有保證腸道神經(jīng)、血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)的完整性的優(yōu)點(diǎn)，可在一定程度上代表人體腸道蠕動(dòng)的生理狀態(tài)，因此，本實(shí)驗(yàn)采用該模型進(jìn)行大黃-黃芪組分自微乳腸吸收特性研究。在腸灌流過(guò)程中，各腸段不僅會(huì)吸收藥物，同時(shí)也會(huì)吸收和分泌水分，造成灌流液濃度的變化[31]，本研究采用重量分析法進(jìn)行校正，消除體積變化對(duì)腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)管路對(duì)藥物有明顯的吸附，故在正式實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)延長(zhǎng)了供試液的平衡時(shí)間。本研究考察了自微乳在大鼠不同腸段的吸收，結(jié)果表明，制備自微乳后大黃總蒽醌在大鼠十二指腸的a及app較空腸段及回腸的a及app高，這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致。

一般認(rèn)為，自微乳稀釋微乳化后主要通過(guò)淋巴途徑吸收，在富有集合淋巴結(jié)的回腸吸收最好。本研究所得結(jié)果為自微乳中大黃總蒽醌在十二指腸吸收最好，原因可能是當(dāng)微乳到達(dá)十二指腸后，會(huì)刺激含有膽酸鹽、膽固醇、卵磷脂等成分膽汁的分泌，降低自微乳表面張力，有利于脂肪消化，從而促進(jìn)藥物在十二指腸的吸收[32]；其次P-糖蛋白在大鼠十二指腸、空腸、回腸的表達(dá)依次增加，從而在一定程度上抑制了自微乳中大黃總蒽醌在小腸中下段的吸收。因在體單向灌流實(shí)驗(yàn)要求藥物必須是溶液，而大黃總蒽醌及黃芪總皂苷組分本身在K-R溶液中不溶，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行組分本身的腸吸收實(shí)驗(yàn)。本研究以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為測(cè)定指標(biāo)，根據(jù)質(zhì)量權(quán)重系數(shù)折算成大黃總蒽醌的a與app值進(jìn)行比較，使數(shù)據(jù)結(jié)果更為科學(xué)合理[33]。

綜上所述，本研究制備了大黃總蒽醌-黃芪總皂苷多組分自微乳，所得的自微乳具有良好負(fù)載中藥多組分的能力，自微乳中大黃總蒽醌及黃芪總皂苷在大鼠各小腸段均吸收良好，預(yù)測(cè)可以有效改善二者口服生物利用度問(wèn)題，使其更好地發(fā)揮協(xié)同抗腎纖維化作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andintestinal absorption study ofetcomponents loaded self-microemulsion

HOU Yu, ZHU Lin, ZHANG Qi-bin, YE Xiao-feng, KE Qiao-ying, XU Zhi-shi, WEI Ying-hui

School of Pharmacy, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

The present investigation focused on the formulation, preparation process and intestinal absorption characteristics of Dahuang (et, RRR)-Huangqi (, AR) components loaded self-microemulsion.The composition of the formula was screened through the solubility test, compatibility of the oil phase with emulsifier and co-emulsifier, and the quasi-ternary phase diagram. Particle size, polydispersion index (PDI) analysis and transmission electron microscopy (TEM) studies were used to evaluate the prepared self-microemulsion. Intestinal absorption of the microemulsion was characterized using rat single-pass intestinal perfusion technique.The optimized emulsion consists of Capmul MCM NF as an oil phase, polyoxyl castor oil EL-35 and ethylene glycol as an emulsifier and co-emulsifier respectively. The droplet size of RRR-AR components loaded microemulsion was (33.01 ± 0.12) nm with their PDI (0.10 ± 0.02), zeta potential (?10.10 ± 1.00) mV. As revealed by the observation under TEM, the microemulsion exhibited homogeneous dispersion and was a spherical emulsion droplet. The content of RRR total anthraquinone and AR total saponins was 6.29 mg/g and 8.80 mg/g, respectively. The microemulsion was stable at room temperature, without stratification or droplet change. Theaandappof RRR total anthraquinone in duodenum and jejunum were significantly higher than those in ileum segments. AR total saponins was well absorbed in all of the small intestine segments.A newly developed microemulsion exhibits high emulsification efficiency with high payload of RRR and AR components. The high intestinal absorption of RRR-AR components in all of the small intestine segments was observed by encapsulation in the emulsion, which is expected to improve the oral bioavailability of RRR-AR components.

rhubarb total anthraquinone; astragalus total saponins; self-microemulsion; prescription research; quasi-ternary phase diagram;-intestinal absorption

R283.6

A

0253 - 2670(2023)12 - 3815 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.008

2022-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873018）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY21H280007）

侯 雨，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬托录夹g(shù)研究。Tel: (0571)61768157 E-mail: houyu9794@163.com

通信作者：魏穎慧，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬托录夹g(shù)研究。Tel: (0571)61768157 E-mail: yhw_nn@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]