伊文剛,董新剛,董曉坤,李偉峰

1.河南省洛陽正骨醫(yī)院,河南 洛陽 471002; 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 3.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是缺血或出血性腦血管病引起腦組織損傷所致的癡呆類型[1]。作為影響老齡人群體健康的重要疾病,本病患病率伴隨著中國人口老齡化持續(xù)加劇和其他潛在危險因素而呈逐年上升態(tài)勢,如腦血管病、糖尿病及肥胖等代謝綜合征患病人群日益增多[2-3]。中醫(yī)認為,本病發(fā)病部位在腦,與心、肝、腎等臟器密切相關(guān),腎精虧虛、痰濁內(nèi)阻、瘀血阻滯乃日久損髓傷腦的主因,故本病基本病機為腎虛、瘀血、痰濁凝滯經(jīng)脈[4]。癡呆健腦方是依據(jù)“三元絡(luò)腦”學說擬定,該方由薯蕷丸和通竅活血湯的合方化裁而成,方中諸藥合用,共起益腎填髓、滌痰開竅和祛瘀通絡(luò)之功[4]。癡呆健腦方是全國老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導老師經(jīng)驗方,初步臨床驗證效果良好[5-6]。為進一步明確癡呆健腦方對血管性癡呆的干預(yù)機制,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討癡呆健腦方的作用機制,并輔以動物實驗驗證,以期為后續(xù)臨床與實驗研究提供參考。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1.1 資料與方法

1.1.1 癡呆健腦方活性成分檢索在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)依次檢索熟地黃、山茱萸、肉桂、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、黨參、白術(shù)、生姜等各自活性成分,按照口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為標準篩選;使用SwissADME篩選在化源網(wǎng)上獲取的遠志的活性成分。癡呆健腦方有效活性成分通過Drugbank數(shù)據(jù)庫進一步預(yù)測潛在靶點。

1.1.2 血管性癡呆靶點收集在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)及GeneCards數(shù)據(jù)庫以“vascular dementia(VD)”為關(guān)鍵詞進行檢索,獲取血管性癡呆相關(guān)靶點。

1.1.3 Venn圖構(gòu)建依據(jù)Venn2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線平臺取藥物靶點和疾病靶點的交集,獲取癡呆健腦方治療血管性癡呆的潛在靶點,并以Venn圖顯示。

1.1.4 構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖將癡呆健腦方藥物組成、活性成分及對應(yīng)靶點進行映射,運用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction networks,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建把藥物和疾病的交集靶點導入STRING(https://string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為“Homo sapiens”,構(gòu)建交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.6 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析把藥物和疾病的交集靶點導入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html)在線數(shù)據(jù)庫,把物種設(shè)置為“Homo sapiens”,進行GO富集分析,得到癡呆健腦方對血管性癡呆的生物功能注釋,包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組成(cellular component,CC),同時進行數(shù)據(jù)可視化處理。以相同方法進行KEGG通路富集分析,得到癡呆健腦方作用于血管性癡呆的主要通路,結(jié)果以表格形式展現(xiàn)。

1.2 結(jié)果

1.2.1 癡呆健腦方活性成分對應(yīng)靶點及血管性癡呆相關(guān)靶點的獲取在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索癡呆健腦方的藥物活性成分,按照OB≥30%和DL≥0.18標準篩選,獲得癡呆健腦方有效活性成119個,其中白術(shù)21個、川芎7個、黨參21個、茯苓15個、肉桂10個、山茱萸20個、生姜5個、石菖蒲4個、熟地黃2個、桃仁23個;化源網(wǎng)檢索遠志26個,經(jīng)SwissADME篩選后剩余有效活性成分5個。根據(jù)篩選得到的活性成分,從Drugbank數(shù)據(jù)庫中提取每個活性成分的潛在作用靶點信息,進一步利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)檢索得到靶點對應(yīng)的基因名,獲得癡呆健腦方活性成分潛在作用靶點208個。利用OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫共預(yù)測得到血管性癡呆相關(guān)靶點133個。

1.2.2 藥物和疾病交集靶點Venn圖將癡呆健腦方活性成分靶點映射到血管性癡呆靶點中,得到交集靶點10個。見圖1。

圖1 潛在靶點韋恩圖

1.2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中顯示節(jié)點337個,其中藥物活性成分119個、藥物節(jié)點10個(熟地黃成分有兩個且均為共同成分,未顯示)、靶點節(jié)點208個,見圖2。圖中淺藍色為靶點,RG為肉桂活性成分,DS為黨參活性成分,BZ為白術(shù)活性成分,SDH為熟地黃活性成分,SJ為生姜活性成分,SZY為山茱萸活性成分,SCP為石菖蒲活性成分,FL為茯苓活性成分,CX為川芎活性成分,TR為桃仁活性成分,A1、B1、C1、D1為共同成分。

圖2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖將藥物和疾病交集靶點傳至STRING數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建蛋白間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,其中節(jié)點為靶蛋白,邊為靶蛋白間相互作用關(guān)系。見圖3。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

1.2.5 GO功能富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對癡呆健腦方作用于血管性癡呆的有效作用靶點進行GO功能富集分析,得到GO條目867條,其中BP 730條、MF 90條、CC 47條,選擇前20條作圖。由BP分析結(jié)果可知,癡呆健腦方對血管性癡呆的治療作用主要與對異種物質(zhì)刺激的發(fā)應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、異種物質(zhì)分解代謝過程(xenobiotic catabolic process)、單萜類代謝過程(monoterpenoid metabolic process)等生物過程有關(guān)。MF分析表明共同靶點主要涉及氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)、花生四烯乙醇胺8,9環(huán)氧氧化酶活性(anandamide 8,9 epoxidase activity)等分子功能?；贑C分析結(jié)果,突出后膜(postsynaptic membrane)、樹突(dendrite)及突出膜(synaptic membrane)等細胞組分在癡呆健腦方對血管性癡呆的治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見圖4—圖6。

圖5 潛在靶點MF分析

圖6 潛在靶點CC分析

1.2.6 KEGG通路富集分析運用Metascape在線數(shù)據(jù)庫對癡呆健腦方治療血管性癡呆有效作用靶點進行KEGG通路富集分析,篩選標準為P<0.05及FDR<0.05,取前20條通路。分析顯示,共同靶點主要富集于AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路和MAPK信號通路等。見表1。

表1 KEGG富集分析結(jié)果

2 動物實驗

2.1 材料

2.1.1 實驗動物SD雄性健康大鼠100只,體質(zhì)量(250±20)g,動物許可證號:SCXK(豫)2020-0010,購于鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場,飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動物實驗中心,相關(guān)動物實驗經(jīng)河南省中醫(yī)院動物實驗中心倫理委員會批準,實驗操作均符合有關(guān)實驗動物福利和倫理規(guī)范,福利倫理審查批準編號:DWLL20200156。

2.1.2 藥物與試劑熟地黃、山茱萸、肉桂、遠志、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、黨參、白術(shù)、生姜飲片來自河南省中醫(yī)院藥劑科;鹽酸多奈哌齊片[商品名:安理申,衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司,規(guī)格:10 mg,國藥準字:H20070181]。白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、NF-κB抗體、p65/p50抗體(英國Abcam公司,貨號:ab255730、ab178013、ab215539、ab181421、ab16502、ab131546);熒光二抗(美國Proteintech公司,貨號:SA00007-2)。

2.1.3 儀器TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(濟南歐萊博科學儀器有限公司);MultiSkan3型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Mini P-4型電泳槽、VE-186型濕轉(zhuǎn)電泳槽、5200型全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);Mini-Sbucell GT型電泳儀(美國Bio-Rad公司);XK-802型水平脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司);pH211型酸度計(意大利Hanna公司);F10型電動組織勻漿器(美國Fluka公司)。

2.2 方法

2.2.1 動物造模采用改良雙側(cè)頸總動脈分次結(jié)扎法建立VD模型。術(shù)前禁食水12 h,稱大鼠質(zhì)量,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)進行麻醉,麻醉成功后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上,取頸正中切1.5～2.0 cm切口,鈍性分離皮下軟組織及肌層,充分暴露右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng),用1號手術(shù)線將右側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎,傷口縫合3 d后拆線;腹腔注射慶大霉素 0.05 mL,每天1次,連續(xù)5 d;左側(cè)頸動脈結(jié)扎同上。假手術(shù)組僅做麻醉和頸總動脈分離,不結(jié)扎。術(shù)后自由獲取水源及飼料,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用水迷宮篩選實驗動物,首次跨越平臺時間明顯延長、跨越平臺次數(shù)明顯少于正常大鼠者為造模成功。

2.2.2 藥物干預(yù)將造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法進行分組,分為模型組、多奈哌劑組及癡呆健腦方高、低劑量組。假手術(shù)組和模型組以生理鹽水灌胃;多奈哌齊組以3 mg·kg-1劑量灌胃鹽酸多奈哌齊,癡呆健腦方高、低劑量組分別以32 g·kg-1、16 g·kg-1灌胃,藥物給藥劑量按人和動物體表面積折算的等效劑量比較表換算,各組連續(xù)干預(yù)1個月。

2.2.3 空間學習記憶能力考察干預(yù)1個月后,Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力,包括定位航行實驗及空間探索實驗。實驗前應(yīng)完善準備工作,水的高度為高過站臺0.5～1.0 cm,池子水溫保持在24 ℃左右,最后加入奶粉使水變渾濁,以看不見臺子為準,并在水迷宮上固定標記物。實驗前 30 min 讓動物熟悉實驗環(huán)境。把實驗大鼠依次編號,實驗期間按照固定順序?qū)嶒?不能更改。取出實驗大鼠按照順序依次從水迷宮第一象限面向池壁放入水中,然后開始記錄,保證周圍環(huán)境的穩(wěn)定。設(shè)置軟件記錄時間為1 min,當實驗大鼠到達站臺并上臺停留3 s則視為找到臺子,錄像自動停止,若實驗小鼠沒有找到臺子則1 min自動停止。當小鼠沒有找到臺子,實驗人員應(yīng)在錄像停止后引導實驗小鼠上站臺,讓其在臺子上停留 30 s 以熟悉周邊環(huán)境。前5 d訓練,從第一象限開始,當實驗大鼠依次做完一遍,然后按照同樣要求在第二、三、四象限重復(fù)實驗,共做4遍。第6天實驗需撤掉站臺,然后選擇站臺所在象限的對側(cè)象限為入水點,只做1次,數(shù)據(jù)采集完成后使用軟件進行分析。

2.2.4 炎性因子檢測按照試劑盒操作說明,用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定各指標的水平。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的可測范圍分別為4～500 ng·L-1、30～4 000 ng·L-1、15～2 000 ng·L-1和2～200 ng·L-1,重復(fù)3次實驗。

2.2.5 NF-κB、p65/p50蛋白表達檢測運用Western blot法檢測NF-κB、p65/p50蛋白的表達水平。取大鼠海馬組織,利用RIPA細胞裂解液(含PMSF和磷酸酶抑制劑)進行裂解,采用BCA法進行蛋白定量測定后,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)法將樣本轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗按照1：1 000比例進行稀釋,4 ℃孵育過夜,使用緩沖液重復(fù)洗滌3次,每次10 min,然后按照1：5 000 比例配置HRP標記的二抗稀釋液,將條帶置于二抗,室溫孵育2 h后,使用緩沖液重復(fù)洗滌三次,每次10 min,按照化學發(fā)光試劑盒說明書的步驟進行顯影,利用凝膠成像系統(tǒng)進行成像檢測,并用圖像處理軟件Gelpro32對條帶進行光密度分析。

2.3 結(jié)果

2.3.1 空間學習記憶能力實驗結(jié)果比較與假手術(shù)組比較,模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05),目標象限時間比明顯較小(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05),目標象限時間比明顯較大(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組和低劑量組之間各項指標比較差異不明顯(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠空間學習記憶能力對比

2.3.2 海馬區(qū)炎性因子水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組和癡呆健腦方低劑量組IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α各項指標比較差異不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平比較

2.3.3 NF-κB、p65/p50表達水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū) NF-κB、p65/p50蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組與癡呆健腦方低劑量組NF-κB、p65/p50蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4,圖7。

表4 各組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白水平比較

圖7 蛋白表達條帶圖

3 討論

血管性癡呆屬中醫(yī)學“呆病”范疇,《雜病源流犀燭·中風源流》“中風后善忘”是有關(guān)本病的較早記載[7]?！额愖C治裁》載“血瘀于內(nèi),則善忘如狂”,即瘀血阻滯腦脈而致腦失充養(yǎng),神靈失用,則發(fā)為癡呆[8]。血管性癡呆與心、肝、脾、腎等臟腑功能失調(diào)相關(guān),其發(fā)病與年齡、情志、痰濁和瘀血關(guān)系密切,為本虛標實之證[9]。目前,血管性癡呆西醫(yī)治療以預(yù)防和改善癥狀為主,尚無針對本病病理干預(yù)的藥物用于臨床,作為中西醫(yī)協(xié)同攻關(guān)優(yōu)勢病種,中醫(yī)藥治療本病優(yōu)勢逐漸彰顯[10-11]。癡呆健腦方是全國名老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導老師臨床經(jīng)驗方,方中諸藥合用,共奏益腎填髓、滌痰開竅和祛瘀通絡(luò)之功[4]。前期臨床小樣本研究已初見成效[12],但其治療本病的有效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理尚需進一步探究。

本次網(wǎng)絡(luò)藥理學研究顯示,癡呆健腦方活性成分相關(guān)靶點與血管性癡呆相關(guān)靶點的交集靶點10個;富集分析獲取GO條目867條,其中生物過程730條、分子功能90條、細胞組分47條;KEGG富集獲取通路26條;參與的信號通路主要為MAPK、PI3K-Akt、TNF和NF-κB等信號通路。

鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究的局限性,本研究同時以改良雙側(cè)頸總動脈分次結(jié)扎法[12]制作動物模型進行了實驗驗證研究。采用Morris水迷宮對大鼠空間學習與記憶能力進行檢測[13],結(jié)果顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數(shù)明顯增加,目標象限時間比明顯升高,提示該藥能有效提升血管性癡呆大鼠空間位置感和方向感。

血管性癡呆發(fā)病機制雖不十分明確,但炎癥反應(yīng)機制卻備受關(guān)注[14-15],過度炎癥反應(yīng)可導致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡,觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),加劇本病發(fā)展;抑制炎癥反應(yīng)則有助于神經(jīng)元細胞存活,改善臨床癥狀與預(yù)后[16]。研究證實,通過抑制VD大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞活化,降低IL-1β、IL-18、TNF-α等因子釋放,可減輕海馬神經(jīng)細胞損害,改善學習記憶能力[17-19]。本研究顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等炎性因子水平降低明顯,提示癡呆健腦方可通過降低海馬區(qū)炎性因子表達水平改善血管性癡呆臨床癥狀。

NF-κB主要由p65、p50的兩個亞基以同源或異源二聚體形式組成的轉(zhuǎn)錄因子,可以控制DNA轉(zhuǎn)錄、細胞因子產(chǎn)生和細胞存活,廣泛參與細胞對各種刺激的應(yīng)答[20]。作為腦缺血損傷反應(yīng)最早的關(guān)鍵炎癥因子,NF-κB通過增強TNF-α、IL-1β等促炎癥因子表達,間接促進炎癥反應(yīng)[21]。研究表明,NF-κB與腦內(nèi)免疫和應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[22],當NF-κB 抑制劑濃度在腦外傷周圍組織中明顯升高時,可減輕繼發(fā)性腦損傷并降低炎性細胞因子表達。抑制NF-κB信號通路,可減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,保護神經(jīng)元細胞功能,延緩血管性癡呆疾病進程[23]。本研究顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白表達水平明顯降低。結(jié)合炎癥因子檢測結(jié)果,提示癡呆健腦方可通過調(diào)控NF-κB信號通路,抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展,從而改善認知功能,這也進一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學關(guān)于NF-κB信號通路作用機理的推測[24]。

本研究整合了疾病基因和藥物PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),對癡呆健腦方治療血管性癡呆關(guān)鍵靶點進行了有效篩選和富集分析,明確了藥物發(fā)揮療效的潛在機制,并通過動物實驗進一步驗證了其療效和作用機制。鑒于目前血管性癡呆患者樣本數(shù)據(jù)相對較少,本研究也存在一定局限性。隨著TCGA、GEO等大型疾病基因數(shù)據(jù)庫快速建設(shè),越來越多基因芯片信息將被整合到中藥研究中,因此,持續(xù)深化癡呆健腦方治療血管性癡呆關(guān)鍵靶點和作用機制,闡明癡呆健腦方對血管性癡呆深層保護機制仍然是今后研究的重點領(lǐng)域。