張曉雨,孫光軍,鮑新坤,肖文潔,潘姣,林愛珍

1.湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430061; 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430060

便秘因病程纏綿、證候復(fù)雜、波及臟腑較多、治療缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)而被列為難治性疾病,全球患病率約為16%[1]。目前便秘的臨床管理主要依靠對癥治療,如潤濕劑和各種瀉藥的使用。然而,由于藥物的不良反應(yīng)和難治性,這些治療方法常常療效局限?；谥嗅t(yī)理論指導(dǎo)下的中藥施治在慢性疾病的防治上具有獨(dú)特優(yōu)勢。湖北省中醫(yī)院肛腸科林愛珍教授認(rèn)為便秘病程纏綿反復(fù),患者長期服用攻下之藥,致使津傷更甚,且攻下藥多為苦寒?dāng)∥钢?使脾運(yùn)化無力;且久病必虛,氣虛則胃腸傳導(dǎo)無力,陽虛則胃腸失于溫煦,導(dǎo)致排便時(shí)間加長。林愛珍教授經(jīng)過嚴(yán)格的辨證論治及多年的臨床實(shí)踐,在濟(jì)川煎與補(bǔ)中益氣湯的基礎(chǔ)上化裁,凝練出行之有效的臨證經(jīng)驗(yàn)方——益腸通秘湯,此方具有溫陽益氣、潤腸通便的功效,越來越多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明益腸通秘湯在治療陽虛型便秘中效如桴鼓[2-4],但關(guān)于益腸通秘湯治療便秘的具體分子作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

代謝組學(xué)主要用于研究影響宿主代謝及其生化功能的小分子代謝物,這些化合物在微生物選擇和代謝信號通路的構(gòu)建中起著關(guān)鍵作用[5]。相關(guān)研究顯示,便秘的發(fā)生與多種代謝途徑的紊亂密切相關(guān)[6]。因此,本研究應(yīng)用超高液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)-質(zhì)譜(mass spectrum,MS)技術(shù)對各組小鼠血清進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,通過分析便秘相關(guān)代謝產(chǎn)物探討益腸通秘湯干預(yù)便秘的代謝途徑和可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物48只SPF級雄性BALB/c小鼠(6周齡)購自湖北省疾病預(yù)防控制中心(動(dòng)物合格證號:SYXK2020-0002),恒溫(23±2) ℃、恒濕、12 h/12 h 明暗循環(huán)飼養(yǎng)。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理實(shí)驗(yàn)委員會審批通過(倫理號:20190001-DS-20220520-001),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序參照并符合《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用法》。

1.2 藥物與試劑洛派丁胺、活性炭(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號:HY-B0418A、A304261);乙腈(色譜級,德國Merk公司,貨號:MFCD00001878);甲酸(色譜級,美國ACS公司,貨號:R003652);色胺(美國Sigma-Aldrich公司,貨號:193747);其他化學(xué)試劑均為分析級或色譜級;蘇木素伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司,貨號:C0105S);RNA提取液(美國Ambion公司,貨號:15596-026);cDNA合成試劑盒(日本Takara公司,貨號:A4202-1)。肉蓯蓉、懷牛膝、當(dāng)歸、升麻、肉桂、制何首烏、生白術(shù)、火麻仁、枳實(shí)、黃芪由湖北省中醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 儀器UPLC-MS儀(日本島津公司,型號:LC-30A);Triple TOFTM4600型質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Kinetex C18色譜柱(規(guī)格:2.1 mm×100.0 mm,2.6 μm,美國Phenomenex公司);Waters Atlantis T3色譜柱(規(guī)格:2.1 mm×100.0 mm,3 μm,美國Waters Corp公司)。

2 方法

2.1 藥物制備湖北省中醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的益腸通秘湯水煎液,具體操作如下:取肉蓯蓉15 g,懷牛膝10 g,當(dāng)歸12 g,升麻10 g,肉桂6 g,制首烏10 g,生白術(shù)20 g,火麻仁15 g,枳實(shí)10 g,黃芪15 g,常規(guī)煎煮要求,加蒸餾水煎汁后濃縮成濃度相當(dāng)于生藥900 g·L-1水煎液,于-40 ℃保存?zhèn)溆谩０凑铡吨兴幩幚韺?shí)驗(yàn)方法學(xué)》計(jì)算出小鼠藥物灌胃劑量為15 g·kg-1·d-1(按臨床常用劑量換算)[7]。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥48只SPF級雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、便秘組、益腸通秘湯組、便秘+益腸通秘湯組,每組12只。益腸通秘湯組和便秘+益腸通秘湯組小鼠灌胃給予15 g·kg-1益腸通秘湯,正常組和便秘組小鼠灌胃給予無菌水,預(yù)處理14 d后,便秘組和便秘+益腸通秘湯組小鼠灌胃洛哌丁胺(10 mg·kg-1)溶液進(jìn)行造模,正常組和益腸通秘湯組小鼠灌胃等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)7 d。

2.3 便秘相關(guān)參數(shù)測定末次造模干預(yù)結(jié)束時(shí),收集各組小鼠糞便樣本,測定單只小鼠3 h內(nèi)糞?？倲?shù),然后稱量新鮮糞便樣本的質(zhì)量即為糞便濕質(zhì)量,在60 ℃下干燥12 h得到干燥的糞便,稱其質(zhì)量即為糞便干質(zhì)量,計(jì)算糞便含水率[(糞便濕質(zhì)量-糞便干質(zhì)量/糞便干質(zhì)量)×100%]。為評估腸道轉(zhuǎn)運(yùn)能力,在末次造模干預(yù)結(jié)束后禁食12 h,小鼠灌胃0.2 mL活性炭粉(10%活性炭懸液溶于0.5%羧甲基纖維素),30 min后,將小鼠麻醉處死,取小腸組織,測量活性炭在小腸中的移動(dòng)距離,計(jì)算小鼠的胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率,即為活性炭的移動(dòng)距離相對于小腸全長的百分比。

2.4 組織病理學(xué)檢測結(jié)腸組織采用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成4 μm厚片。固定后的切片用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水合,蒸餾水沖洗,采用HE染色試劑盒測定結(jié)腸的形態(tài)學(xué)變化。

2.5 代謝組學(xué)分析末次給藥結(jié)束后,取小鼠的血清,各組小鼠血清樣本5 000×g離心10 min,取血清50 μL加入甲醇-乙腈溶液(體積為1：1),渦旋30 s,12 000×g離心10 min,收集上清液100 μL,用于UPLC-MS分析。對于疏水性代謝物,采用Kinetex C18色譜柱進(jìn)行親水交互液相色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)分離。流動(dòng)相包含0.1%甲酸(A)和乙腈(B),梯度洗脫:0—1 min,5% B;1—24 min,5%～100% B;24—28 min,100% B;28—28.1 min,100%～5% B;28.1—30 min,5% B。對于親水性代謝產(chǎn)物,采用Waters Atlantis T3色譜柱進(jìn)行反相液相色譜(reverse phase liquid chromatography,RPLC)分離。流動(dòng)相包含6.5 mmol·L-1NH4HCO3(A)和95%甲醇+ 5% 6.5 mmol·L-1NH4HCO3(B),梯度洗脫順序如下:0—1 min,2% B;1—18 min,2% B～100% B;18—22 min,100% B;22—22.1 min,100%～2% B;22.1—25 min,2% B。進(jìn)樣量為3 μL,流速為0.35 mL·min-1。使用TripleTOFTM4600質(zhì)譜儀檢測和脂質(zhì)定量,該質(zhì)譜儀配備有正、負(fù)模式的射流電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI),參數(shù)如下:掃描范圍50～1 000m/z;離子源溫度為500 ℃;正負(fù)兩種模式的離子噴霧電壓:±5.5 kV;護(hù)套和輔助氣體(氮?dú)?為55 psi。碰撞能量為10 V或-10 V,聚束電壓為80 V或-80 V。將Analyst TF軟件與信息采集包(IDA)結(jié)合使用,用于UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)獲取。采用PeakviewTM1.2軟件進(jìn)行UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)采集和處理。使用Markerview 1.2.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正、標(biāo)度和峰值對齊分析,對所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行無偏聚類分析比較。采用SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行多變量分析統(tǒng)計(jì)以檢驗(yàn)數(shù)據(jù)集的內(nèi)在變異。代謝途徑分析和潛在生物標(biāo)志物篩選采用MetaboAnalyst 4.0軟件進(jìn)行分析。

2.6 結(jié)腸組織相關(guān)指標(biāo)的RT-PCR檢測用RNA提取液從結(jié)腸組織中分離總RNA,將分離的RNA用cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成完整的DNA,隨后采用cDNA模板在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR檢測。用于RT-PCR分析的指標(biāo)包括芳香-l-氨基酸(dopa decarboxylase,DDC)、乙酰轉(zhuǎn)移酶(arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)、磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)、溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(lysophosphatidylcholine acyltransferase,LPCAT1)、磷脂酶D2(phospholipaseD2,PLD2)、鞘脂去飽和酶(degenerative spermatocyte homolog 2,DEGS2)、堿性神經(jīng)酰胺酶(alkaline ceramidase1,ACER1)、鞘氨醇激酶(sphingosine kinase 2,SPHK2) 和GAPDH?；虻囊镄蛄幸姳?。PCR程序如下:95 ℃反應(yīng)10 min,40個(gè)循環(huán),95 ℃反應(yīng)10 s,然后60 ℃反應(yīng)30 s。所有目的基因的表達(dá)均按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行歸一化處理。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠便秘相關(guān)參數(shù)比較與正常組比較,便秘組小鼠3 h內(nèi)糞便粒數(shù)、糞便含水率以及腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率均顯著降低(P<0.05或P<0.01);與便秘組比較,經(jīng)益腸通秘湯處理后,便秘+益腸通秘湯組各項(xiàng)排便參數(shù)均有所恢復(fù),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步表明造模成功,同時(shí)提示益腸通秘湯具有良好的通便效果。見表2。

表2 各組小鼠排便參數(shù)比較inparagraph

3.2 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)比較各組小鼠結(jié)腸組織HE染色可見,正常組與益腸通秘湯組小鼠結(jié)腸腸腺排列整齊,杯狀細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目正常。與正常組比較,便秘組結(jié)腸絨毛排列不致密,杯狀細(xì)胞明顯減少,伴少許炎性細(xì)胞浸潤。經(jīng)益腸通秘湯治療后,便秘+益腸通秘湯組結(jié)腸絨毛排列趨向正常,損傷情況減輕,杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加,無明顯炎性細(xì)胞浸潤,表明益腸通秘湯可以有效改善便秘小鼠的結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)損傷,見圖1。

注:A:正常組;B:便秘組;C:益腸通秘湯組;D:便秘+益腸通秘湯組。圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE染色)

3.3 小鼠血清代謝物主成分分析(principal component analysis,PCA)與正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)利用PCA和OPLS-DA來反映模式識別,發(fā)現(xiàn)各組樣本分布于不同區(qū)域,所建立方法可良好表征不同組別代謝物的差異性。從PCA圖中可以看出,四個(gè)組的血清樣本分化程度較好,不同組別代謝物譜顯示出較好的聚類效果,見圖2A。OPLS-DA結(jié)果顯示,4組樣本有明顯的分離,表明各組之間血清代謝物存在顯著差異,見圖2B。

注:A:PCA分析;B:OPLS-DA分析;Ctrl:正常組;LOP:便秘組;YCTM:益腸通秘湯組;LOP+YCTM:便秘+益腸通秘湯組。圖2 小鼠血清樣本PCA與OPLS-DA分析

3.4 潛在標(biāo)志物篩選為尋找益腸通秘湯治療便秘的相關(guān)代謝差異物,篩選VIP值>1且P<0.05的代謝物為潛在生物標(biāo)志物,通過HMDB和KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析,共鑒定出21個(gè)代謝差異物,見表3。

表3 益腸通秘湯治療便秘的相關(guān)代謝差異物鑒定

3.5 代謝通路分析采用MetaboAnalyst進(jìn)行代謝通路分析,評價(jià)益腸通秘湯治療便秘過程中受到較大影響的通路。將通路影響值>0.1的代謝通路作為目標(biāo)代謝通路,發(fā)現(xiàn)10條潛在的關(guān)鍵代謝路徑,包括色氨酸代謝,甘油磷脂代謝,鞘脂類代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,不飽和脂肪酸生物合成,硫代謝,初級膽汁酸生物合成,嘧啶代謝,精氨酸生物合成和磷酸肌醇代謝,見表4和圖3。

圖3 主要代謝通路分析概要圖

表4 主要代謝通路分析結(jié)果

3.6 色氨酸、甘油磷脂和鞘脂代謝相關(guān)酶活性分析在上述10條潛在的關(guān)鍵代謝路徑中,發(fā)現(xiàn)其中3條代謝通路在益腸通秘湯治療便秘過程中具有重要意義。DDC和AANAT分別參與色氨酸代謝通路中5-羥色胺和N-乙?；?5-羥色胺的生成;PLA2、LPCAT1和PLD2分別參與甘油磷脂代謝通路中溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酸的生成;DEGS2、ACER1和SPHK2分別參與鞘脂代謝通路中神經(jīng)酰胺、鞘氨醇和磷酸鞘氨醇的生成。與正常組比較,便秘組小鼠結(jié)腸組織中DDC和AANAT的mRNA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01),PLA2、LPCAT1、DEGS2、ACER1和SPHK2的mRNA含量顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01);與便秘組比較,經(jīng)益腸通秘湯治療后,便秘+益腸通秘湯組小鼠結(jié)腸組織中AANATmRNA含量顯著升高(P<0.05),LPCAT1、DEGS2、ACER1和SPHK2的mRNA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01),提示益腸通秘湯對色氨酸代謝相關(guān)酶活性的促進(jìn)及其對甘油磷脂代謝、鞘脂代謝相關(guān)酶活性的抑制可能成為改善便秘的潛在途徑。見圖4。

注:Ctrl:正常組;LOP:便秘組;YCTM:益腸通秘湯組;LOP+YCTM:便秘+益腸通秘湯組;與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與便秘組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖4 益腸通秘湯對小鼠結(jié)腸組織中色氨酸代謝、甘油磷脂代謝和鞘脂代謝相關(guān)酶活性的影響

4 討論

便秘在臨床多以“因虛致秘”為主,《丹溪心法·燥結(jié)》中描述:“虛人臟冷而血脈枯,老人臟寒而氣道澀,此大腸之夾冷然也?！敝赋隼夏瓯忝夭∫虿C(jī)與陽虛相關(guān)。古代醫(yī)家對于便秘的治療有較多記載,其中“凡病涉虛損,而大便閉結(jié)不通,則硝、黃攻擊等劑必不可用;若勢有不得不通者,宜此主之”,這里的“此”即為濟(jì)川煎。另“中氣不足,溲便為之便”,宜補(bǔ)中益氣湯以虛者補(bǔ)之,損者益之出發(fā),補(bǔ)中氣之左升,而降胃以化腸燥也。益腸通秘湯在濟(jì)川煎與補(bǔ)中益氣湯的基礎(chǔ)上化裁,方中重用肉蓯蓉、肉桂,為君藥,起溫補(bǔ)腎陽、潤腸通便的作用;黃芪、生白術(shù)溫中行氣、健脾益氣,懷牛膝補(bǔ)腎固本,共為臣藥;枳實(shí)、厚樸寬氣下腸,導(dǎo)滯通便,當(dāng)歸養(yǎng)血通便,共為佐藥;升麻為引經(jīng)藥,入陽明經(jīng),具有清宣升陽作用;甘草調(diào)和諸藥;全方相輔相成,共同發(fā)揮了溫陽行氣、潤腸通便的作用。

代謝組學(xué)用于識別因生物系統(tǒng)操作而發(fā)生變化的代謝物,具有獨(dú)特的潛力來定義預(yù)測疾病發(fā)生率,影響疾病嚴(yán)重程度和進(jìn)展的生物標(biāo)志物為潛在的生理病理生理機(jī)制提供了新思路。通過評估代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性小分子的動(dòng)態(tài)變化,篩選差異代謝物來揭示其分子機(jī)制途徑。因此,代謝組學(xué)不僅提供了內(nèi)源代謝活動(dòng)和生物標(biāo)志物的整體變化,而且有助于揭示藥物在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理[8]。本文采用UPLC-MS的非靶向代謝組學(xué)研究,通過對血清樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),便秘組和治療組之間的代謝物特征存在顯著差異。PCA和OPLS-DA等多變量分析廣泛用于組間差異代謝物的鑒別,且OPLS-DA能夠直接揭示導(dǎo)致組間差異的具體變量[9]。OPLS-DA結(jié)果充分顯示了4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間的不同聚類,表明造模以及益腸通秘湯干預(yù)后便秘小鼠與正常小鼠、治療小鼠之間的代謝產(chǎn)物存在明顯差異,血清中的代謝產(chǎn)物成分發(fā)生了顯著變化,提示益腸通秘湯在治療便秘小鼠中的有效性。

本研究鑒定出21種代謝差異物,經(jīng)益腸通秘湯治療后部分逆轉(zhuǎn)了這些代謝物的水平。在這些變化的代謝物中,相當(dāng)部分是10條潛在的關(guān)鍵代謝路徑中色氨酸代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝途徑中主要節(jié)點(diǎn)分子。此外,部分代謝物還參與了膽汁酸、不飽和脂肪酸的生物合成、氨基酸代謝。據(jù)報(bào)道,膽汁酸的生物合成途徑的增加可增加肝腎損害的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)影響腸道動(dòng)力[10];不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物在便秘型腸易激綜合征相關(guān)內(nèi)臟痛中起著關(guān)鍵作用[11];痛瀉藥方可以通過增強(qiáng)氨基酸代謝增強(qiáng)能量代謝,調(diào)節(jié)免疫功能,改善便秘型腸易激綜合征小鼠脾虛證[12],這些報(bào)道與本研究的結(jié)果一致。

色氨酸代謝是與胃腸道直接相關(guān)的關(guān)鍵代謝途徑,通過產(chǎn)生5-HT來調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)。L-色氨酸用于神經(jīng)遞質(zhì)(如血清素)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑(如色胺)的生成;5-HT可以通過作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元增強(qiáng)胃腸道內(nèi)臟神經(jīng)的敏感性,刺激胃腸蠕動(dòng),緩解便秘[13]。為了進(jìn)一步證明益腸通秘湯對色氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)在改善便秘小鼠中發(fā)揮的作用,本研究對代謝途徑中的關(guān)鍵酶做了進(jìn)一步研究。DDC和AANAT都是色氨酸代謝通路上的酶,DDC可以激活5-HT的合成,促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,進(jìn)而刺激腸道蠕動(dòng);5-HT又可以通過AANAT乙酰化形成N-乙?；?-羥色胺,通過褪黑途徑調(diào)控免疫應(yīng)答[14]。結(jié)果表明,經(jīng)過益腸通秘湯治療后,AANAT顯著上調(diào),提示了該代謝途徑在調(diào)節(jié)便秘中發(fā)揮重要作用。因此,推測益腸通秘湯可能通過促進(jìn)色氨酸代謝途徑中有益代謝物的生成來參與胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)進(jìn)而減輕便秘。

某些脂質(zhì)包括磷脂衍生物會增強(qiáng)內(nèi)臟超敏反應(yīng),引發(fā)腹痛等便秘相關(guān)癥狀。據(jù)報(bào)道,脂類特別是溶血磷脂酰膽堿在以便秘為主的腸易激綜合征中上調(diào)最為顯著。同時(shí),溶血磷脂酰膽堿也會在溶血磷脂酶D的作用下轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酸,通過上調(diào)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)一氧化氮合酶激活炎癥反應(yīng)[15]。磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是真核細(xì)胞膜的主要磷脂成分之一,參與炎癥相關(guān)的各種信號傳導(dǎo)途徑。此外,該條代謝通路上的三種酶也與炎癥密切相關(guān),PLA2和PLD2可以通過誘導(dǎo)IL-6的釋放來激活炎癥[16],LPCAT1在巨噬細(xì)胞的表達(dá)和刺激Toll樣受體4和Toll樣受體2配體的釋放中起關(guān)鍵作用[17]。經(jīng)過益腸通秘湯治療后,PLA2、PLD2及LPCAT1部分下調(diào),推測益腸通秘湯可能通過抑制甘油磷脂代謝途徑中諸如溶血磷脂酰膽堿等代謝產(chǎn)物介導(dǎo)氧化應(yīng)激和腸道炎癥來改善便秘。

在鞘脂代謝中,L-絲氨酸參與鞘脂的合成,與二氫神經(jīng)酰胺作為神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的關(guān)鍵物質(zhì)參與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生和炎癥標(biāo)志物的表達(dá)[18];磷酸鞘氨醇生成的鞘氨醇在神經(jīng)酰胺合酶的作用下合成神經(jīng)酰胺,神經(jīng)酰胺可激活炎癥小體引發(fā)炎性浸潤,炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α又可使葡萄糖神經(jīng)酰胺積累[19]。SPHK2參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、刺激免疫細(xì)胞浸潤,DEGS2在應(yīng)激狀態(tài)下有較高積累,ACER1能夠介導(dǎo)氧化應(yīng)激,促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20-21],經(jīng)過益腸通秘湯處理后均有顯著下調(diào)。本文結(jié)果表明,便秘可能與鞘磷脂代謝增強(qiáng)相關(guān),過量的促炎神經(jīng)酰胺輸出到受體細(xì)胞,從而引起炎癥狀態(tài),進(jìn)一步引起腸道運(yùn)動(dòng)障礙。益腸通秘湯可以下調(diào)L-絲氨酸、磷酸鞘氨醇、神經(jīng)酰胺以及葡糖神經(jīng)酰胺的水平改善腸道炎癥,緩解便秘。

越來越多的證據(jù)表明膽汁酸、不飽和脂肪酸及氨基酸代謝異常也會影響便秘的發(fā)生。膽汁酸的生物合成在減緩腸道運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。結(jié)腸運(yùn)輸?shù)难娱L導(dǎo)致厭氧菌數(shù)量增加以及7α-去羥基化酶的活性增強(qiáng),最終引起血清中膽酸、脫氧膽酸的比例增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn),益腸通秘湯顯著降低了便秘小鼠血清中兩種膽汁酸生物合成代謝物,即膽酸、?；蛆Z去氧膽酸。此外,還發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸的生物合成同樣受到益腸通秘湯的影響,其中花生四烯酸及其相關(guān)代謝途徑在炎癥反應(yīng)中起重要作用[23]。硬脂酸通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)促炎反應(yīng)和氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致腸道運(yùn)動(dòng)障礙[24]。結(jié)果表明,益腸通秘湯顯著逆轉(zhuǎn)了便秘小鼠血清中花生四烯酸和硬脂酸的上調(diào)。據(jù)報(bào)道,一些特定的氨基酸,包括丙氨酸、谷氨酸、精氨酸,對包括便秘在內(nèi)的腸道相關(guān)疾病具有潛在的治療作用[25-26]。研究表明,服用含有天冬氨酸的氨基酸口服液在增強(qiáng)小鼠腸屏障功能和維持腸道完整性中起到至關(guān)重要的作用。在洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘小鼠中,3種氨基酸水平(丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)顯著降低,經(jīng)過益腸通秘湯治療后得到有效恢復(fù)。因此,益腸通秘湯對便秘小鼠的改善作用可能與抑制膽汁酸、不飽和脂肪酸的生物合成,促進(jìn)有益氨基酸的產(chǎn)生有關(guān)。

綜上所述,在使用益腸通秘湯治療洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠后,內(nèi)源性代謝物發(fā)生了顯著變化,影響的代謝途徑包括鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、色氨酸代謝以及膽汁酸、不飽和脂肪酸的生物合成和氨基酸代謝。本研究證明了益腸通秘湯對便秘小鼠血清代謝物產(chǎn)生的明顯影響,推測益腸通秘湯可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物的變化來改善便秘。