趙昶潞,尹聰,高繼寧

1.山西中醫(yī)藥大學,山西 太原 030024; 2.山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院,山西 太原 030024

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是腎臟內(nèi)科臨床常見難治性疾病,具有發(fā)病率高、早期知曉率低、并發(fā)癥多、預后差等特點[1-2]。中醫(yī)認為,本病屬“水腫”“腎風”等范疇。該病初期以尿血、尿濁、水腫為主要表現(xiàn),中后期逐步發(fā)展為癃閉、關格等危重證候。臨床認為,本病病變部位在腎,與脾功能密切相關。本病中醫(yī)證型包括脾腎陽虛證、脾腎氣虛證、肝腎陰虛證、脾腎氣陰兩虛證、陰陽兩虛證;兼證包括濕濁證、濕熱證、水氣證、血瘀證和風動證[3]。

筆者認為,脾腎虧虛、濕毒瘀阻是CKD核心病因病機,提出 “以腎為主,五臟同調(diào),通腑降濁化瘀”的治療原則,所創(chuàng)強腎湯治療CKD早期脾腎氣虛證取得了很好的臨床療效,可有效延緩腎臟纖維化和腎功能損傷的進展,改善患者癥狀,減少蛋白的漏出,從而保護腎功能。本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術檢測CKD 2—3期脾腎氣虛證患者經(jīng)強腎湯治療前、治療后1周的血清代謝譜差異,并進一步分析強腎湯的作用機制,以期從代謝層面闡釋強腎湯的科學內(nèi)涵,為該方的合理應用提供科學依據(jù),現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準CKD診斷標準參照改善全球腎病預后組織指南[3]。任何原因所致的腎臟病理學異?；蜓?、尿、影像學檢查異?；蚰I小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)<60 mL·min-1·1.73 m-2,并持續(xù)3個月,包括各類腎小球、腎小管間質(zhì)或腎血管疾病。CKD 1期:eGFR≥90 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 2期:60≤eGFR<90 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 3期:30≤eGFR<60 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 4期:15≤eGFR<30 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 5期:eGFR<15 mL·min-1·1.73 m-2或透析。

1.1.2 中醫(yī)辨證標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》提出的辨證原則。脾腎氣虛證:主癥:神疲乏力,少氣懶言,動則氣促,納差便溏,腰膝酸軟;次癥:自汗易外感,口淡不渴;舌淡有齒痕;脈弱。

1.2 病例納入標準(自擬)(1)年齡為18～75歲,性別不限;(2)符合西醫(yī)慢性腎臟病診斷標準,且eGFR為30～89 mL·min-1·1.73 m-2;(3)符合中醫(yī)脾腎氣虛證診斷標準;(4)感染、酸中毒、電解質(zhì)紊亂、高血壓得到有效控制;(5)自愿參加,能夠完全理解試驗且簽署知情同意書[4]。

1.3 病例排除標準(自擬)(1)各種原因?qū)е碌募毙阅I衰竭患者、慢性腎功能不全急性加重者;(2)妊娠期、圍生期及哺乳期患者;(3)有心、肝、腦及造血系統(tǒng)嚴重原發(fā)病者;(4)無法合作者,如:精神疾病者;(5)CKD已經(jīng)開始腎臟替代治療者;(6)合并有活動性感染疾病者。

1.4 一般資料選擇2021年9月至2022年9月在山西中醫(yī)藥大學附屬山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院腎病三科就診的CKD 2—3期脾腎氣虛證患者35例,均為脾腎氣虛證組(服藥前為PA組,用藥1周后為TP組);健康組(NL組)35例來源為本科室患者家屬志愿者,均簽署知情同意書,自愿參與本課題研究。脾腎氣虛證組與健康組的性別、年齡等資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.5 治療方法除基礎治療外,所有患者均給予強腎湯。方藥組成:黃芪30 g,當歸15 g,桃仁10 g,紅花15 g,川芎30 g,制何首烏15 g,積雪草30 g,金蟬花15 g,鱉甲20 g,大黃炭10 g,車前子30 g,枳實 10 g,厚樸10 g,砂仁6 g,甘草6 g。每日1劑,早晚分服,連續(xù)服用1周。以上中藥飲片均由山西中醫(yī)藥大學附屬山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房提供,開水沖調(diào),每次150 mL,每天兩次,連續(xù)口服7 d。

1.6 檢測方法

1.6.1 樣本采集與處理分別空腹采集治療前、治療后1周所有患者全血樣品,置肝素鈉采血管室溫靜置30 min,離心(15 min,3 500 r·min-1,4 ℃),取上清液分裝到1.5 mL EP管,每管0.5 mL,分批貯存-80 ℃冰箱中。檢測前樣品在4 ℃環(huán)境解凍 30 min 后取樣品100 μL于1.5 mL EP管中,加入400 μL預冷的甲醇-乙腈溶液(1：1),渦旋混勻 1 min,離心(15 min,13 000 r·min-1,4 ℃),取上清液加至新的1.5 mL EP管,離心濃縮至干,進樣前加入 150 μL 20%甲醇(質(zhì)譜級)復溶,離心(15 min,13 000 r·min-1,4 ℃),吸取上層血清供檢測。

1.6.2 樣本測試分析血清樣本通過超高效液相色譜儀(日本島津公司)結合Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)進行測定,液相條件為流速:0.2 mL·min-1,流動相為甲酸水(A)和乙腈(B)(賽默飛世爾科技有限公司);質(zhì)譜條件為離子源參數(shù):霧化氣:55 Psi;輔助氣:55 Psi;氣簾氣(CUR):30 Psi;霧化溫度(TEM):450.0 ℃;噴霧電壓(ISVF):5 500 V。MS/MS參數(shù):去簇電壓(DP):±60 V;數(shù)據(jù)采集范圍:50～1 500m/z;碰撞能量(CE):±30 eV;碰撞能量范圍(CES):15 eV。

1.7 觀察指標(1)臨床療效。(2)治療前后24小時尿蛋白定量。(3)治療前后血清肌酐(serum creatinine,Scr)、腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、β2微球蛋白(β2microglobulin,β2-MG)及胱抑素C(Cystatin-C,Cys-C)水平。(4)治療前后血紅蛋白水平、血漿白蛋白水平。

1.8 臨床療效判定標準根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則》中的證候療效判定標準,擬定“CKD 2—3期中醫(yī)證型量化統(tǒng)計表”,對試驗組患者進行調(diào)查,并于治療前、治療后1周詳細記錄患者的四診情況。調(diào)查表內(nèi)容主要包括中醫(yī)癥狀和體征共21個變量,并將每一癥狀分三等級,即輕、中、重度,分別為0、1、2分。采用尼莫地平法計算療效指數(shù)并判定療效。其中,療效指數(shù)≥95%為痊愈;70%≤療效指數(shù)<95%為顯效;30%≤療效指數(shù)<70%為有效;療效指數(shù)<30%為無效。

療效指數(shù)=[(治療前積分-治療后積分)/治療前積分]×100%

1.9 數(shù)據(jù)分析方法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用導出的數(shù)據(jù)通過One-MAP轉(zhuǎn)化,再經(jīng)歸一化處理后,導入SIMCA 13.0軟件進行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA),再用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)找出樣品間差異變量。模型檢驗分別采用排列實驗(permutation test)和CV-ANOVA進行分析。顯著性差異通過曼惠特尼U檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。若模型檢驗不通過,則采用火山圖(Volcano Plot)進行單變量分析。差異變量通過檢索數(shù)據(jù)庫METLIN(http://metlin.scripps.edu)、HMDB(www.hmdb.ca/metabolites、KEGG和 LIPID) 進行代謝物定性鑒定。

2 結果

2.1 CKD患者治療前后證候積分比較治療1周后,痊愈0例(0.0%),有效31例(88.6%),無效4例(11.4%),見表2。

表2 CKD患者治療前后證候積分比較 分)

2.2 CKD患者治療前后實驗室指標比較治療后,24小時尿蛋白定量、Scr、BUN、β2-MG、Cys-C水平顯著降低(P<0.01),GFR、血紅蛋白、血漿白蛋白顯著升高(P<0.01),見表3。

表3 CKD患者治療前后實驗室指標比較

2.3 血清LC-MS檢測結果

2.3.1 血清QC樣本LC-MS總離子流圖分析在不同質(zhì)譜掃描模式下,血清中代謝響應不同,見圖1。

注:A:正離子模式;B:負離子模式。圖1 正、負離子模式下血清LC-MS總離子流圖

2.3.2 CKD患者治療前后血清樣本差異分析首先采用PCA對強腎湯治療前后患者血清代謝表型進行分析,見圖2。PA組和TP組中樣本有重疊現(xiàn)象,表明二者之間代謝物存在較小的差異。進一步進行有監(jiān)督的PLS-DA分析,相應的排列試驗結果顯示,左邊所有排列值均低于右邊原始值,表明模型不成立(圖3)。進一步采用Volcano Plot(圖4)進行單變量分析,篩選影響二者分組的差異變量,并通過HMDB數(shù)據(jù)庫和文獻數(shù)據(jù)對照,進行代謝物鑒定。結果表明,與PA組比較,TP組中包括鞘氨醇、甘油磷脂、羥谷氨酸等9個代謝物含量顯著升高,而脂肪酸18：0、磷酸乙醇胺36：2 h和SM(d18：1/16：0)共3個代謝物水平顯著降低,表明經(jīng)強腎湯治療1周后對2—3期慢性腎臟病脾腎氣虛證有一定的治療作用,代謝產(chǎn)物具體變化趨勢見表4。

注:A:正離子模式;B:負離子模式。圖2 離子模式下PA組和TP組樣本PCA圖

注:A:正離子模式;B:負離子模式。圖3 離子模式下PA組和TP組PLS-DA permutation test圖

注:A:正離子模式;B:負離子模式。圖4 離子模式下PA組和TP組Volcano圖

表4 患者治療前后血清中差異代謝物的變化趨勢

2.3.3 代謝通路分析將上述差異代謝物輸入Metaboanalyst網(wǎng)站中進行通路分析,圖中圓點越大表示該途徑在整體代謝輪廓中占的比重越大,顏色越深表示該通路越顯著,作用越明顯。在此基礎上,綜合RawP值(P<0.05)、FDR(false discovery rate)和Impact(0.01)值共發(fā)現(xiàn)兩條主要的代謝通路:甘油磷脂代謝、鞘脂代謝,推測它們與強腎湯治療2—3期慢性腎臟病脾腎氣虛證患者密切相關,見圖5。

圖5 強腎湯治療2—3期慢性腎臟病脾腎氣虛證患者血清代謝物的代謝途徑分析

3 討論

代謝組學是對內(nèi)源性代謝物定性定量分析,是尋找代謝物與機體生理病理變化關系的研究方法[5]。代謝組學已廣泛應用于生命科學研究及醫(yī)藥學相關領域,對疾病的代謝輪廓及通路、早期診斷、藥物療效、預后等方面都有重大意義[6]。將代謝組學技術應用于中醫(yī)臨床,有助于實現(xiàn)從系統(tǒng)生物學角度闡釋中醫(yī)奧秘,以闡明中藥方劑的作用及機制。

強腎湯具有補腎健脾、化瘀通腑降濁的作用,治療CKD早期脾腎氣虛證可取得很好的臨床療效。方中黃芪、當歸可健脾補腎,大黃、鱉甲攻下逐瘀,積雪草、車前子利水滲濕。諸藥合用,可緩解患者浮腫、小便不利、氣短乏力等癥狀。研究證實,黃芪甲苷可降低尿蛋白[7],制何首烏、大黃可改善GFR、Scr等腎功能指標[8-9],積雪草、金蟬花可抑制腎臟細胞凋亡,增強腎小球濾過作用[10-11],川芎、當歸可提高體內(nèi)血紅蛋白水平[12-13],鱉甲可通過影響腎間質(zhì)成纖維細胞功能以延緩腎纖維化[14-15]。

本研究基于LC-MS代謝組學技術研究表明,強腎湯治療2—3期慢性腎臟病脾腎氣虛證的作用機制可能與調(diào)節(jié)鞘脂代謝和甘油磷脂代謝密切有關。細胞內(nèi)鞘脂代謝即以神經(jīng)酰胺的合成和分解為核心的脂質(zhì)代謝,其中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和神經(jīng)酰胺-1-磷酸(C1P)是神經(jīng)酰胺在神經(jīng)酰胺酶作用下的分解產(chǎn)物[16]。有研究表明,鞘脂代謝異常與腎小球疾病密切相關,主要通過損傷足細胞功能、影響脂肪酸氧化、參與胰島素抵抗等,從而加重腎損傷[17]。C1P和S1P代謝改變會損傷細胞膜脂筏結構域的完整性,另鞘脂類有毒脂質(zhì)代謝產(chǎn)物堆積直接導致足細胞損傷,影響腎小球濾過功能,加重腎損害。同時,C1P是一種重要的炎癥調(diào)節(jié)因子,參與細胞氧化增殖[18];S1P與蛋白尿的產(chǎn)生有關。研究證實,S1P的高表達會增加CKD患者活性氧的生成,影響線粒體氧化功能,加重腎損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn),CKD 2—3期患者及正常組織細胞中鞘脂代謝水平存在顯著差異,通過調(diào)控神經(jīng)酰胺代謝來減少足細胞損傷,保護腎功能成為一種新的治療手段[20]。本研究結果顯示,35例患者經(jīng)強腎湯治療后血清中鞘氨醇、羥谷氨酸等代謝物水平顯著升高,脂肪酸 18：0、SM(d18：0/16：0)等代謝物水平顯著降低,提示強腎湯延緩腎損傷,保護腎功能的作用可能與調(diào)節(jié)鞘脂代謝、下調(diào)神經(jīng)酰胺水平有關。

CKD的發(fā)病機制與甘油磷脂代謝紊亂密切相關,機體內(nèi)甘油磷脂通過磷脂酶降解實現(xiàn)磷脂代謝,不同磷脂酶作用不同酯鍵。磷脂酶A2可催化磷脂裂解產(chǎn)生游離的溶血磷脂,具有腎毒性,可損傷腎功能,加快腎功能衰退[21]。同時磷脂酶活性催化,加快與磷脂結合,破壞線粒體穩(wěn)定性,增加細胞炎癥反應。磷酸乙醇胺是甘油磷脂的代謝產(chǎn)物,激化腎臟氧化應激,造成腎動脈硬化[22]。溶血磷脂酰膽堿作為磷脂酰膽堿合成的中間產(chǎn)物,同樣參與細胞膜的信號轉(zhuǎn)導,能降低血漿膽固醇水平。服藥后患者血清中溶血磷脂酰膽堿、甘油磷脂酰膽堿水平升高,磷酸乙醇胺水平降低,提示該藥可抑制血清中甘油磷脂代謝,從而有效保護腎內(nèi)皮細胞,穩(wěn)定腎功能。

綜上,強腎湯通過調(diào)節(jié)鞘脂代謝和脂肪酸代謝等途徑穩(wěn)定脂質(zhì)代謝,鞘脂代謝和甘油磷脂代謝均為磷脂代謝問題;磷脂代謝直接與線粒體相關,線粒體產(chǎn)能和代謝決定氧自由基(reactive oxygen species,ROS)合成、凋亡,進而導致腎組織的氧化應激,造成腎組織損傷。一方面,磷脂是線粒體膜的主要成分,磷脂代謝紊亂影響線粒體膜的穩(wěn)定性,影響ROS生成、凋亡[23]。另一方面,磷脂代謝受損造成線粒體的數(shù)量、質(zhì)量減少,也會使機體ATP合成減少,ROS生成增加,影響細胞的增殖、凋亡,損傷腎細胞;線粒體內(nèi)ROS生成增多及清除不足最終導致ROS爆發(fā),引起腎組織氧化應激,損傷腎功能。因此,可認為強腎湯通過調(diào)節(jié)線粒體磷脂膜的穩(wěn)態(tài)來修復、預防線粒體損傷,發(fā)揮線粒體保護劑功能,從而延緩腎臟損傷,保護腎功能。

強腎湯通過調(diào)節(jié)磷脂代謝以防止脂質(zhì)堆積,保護腎功能。脂質(zhì)作為機體供能的重要來源,其消化吸收場所在小腸。小腸主液,泌別清濁,其受盛化物就是營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。脂質(zhì)為飲食水谷消化后的精微,后經(jīng)運化傳輸布散周身。CKD 2—3期脾腎氣虛證的患者,腎中元氣虧耗無以濡養(yǎng)小腸,影響小腸化物之功;脾氣不足,水谷精微運化不利,蘊積日久而化瘀濁,更損正氣;則會出現(xiàn)倦怠乏力、氣短懶言、浮腫難消、肢體困重、面色晦暗、脘腹脹滿等正虛邪實的表現(xiàn)。強腎湯中黃芪、當歸益氣補血、健脾益腎;桃仁、紅花、大黃炭、車前子活血行氣、利濕化濁。本方以調(diào)補脾腎為基,加以通腑降濁化濕,以達扶正祛邪之功。

本研究從系統(tǒng)生物學角度分析強腎湯治療2—3期慢性腎臟病脾腎氣虛證的作用機制,為中醫(yī)治療早期CKD的現(xiàn)代研究提供了新思路,也為強腎湯的臨床應用提供科學依據(jù)。今后的研究還應擴大樣本量,可減少年齡、性別、原發(fā)病等對試驗結果的影響?；诖x組學整體性、靈敏性的特點,分析復雜中醫(yī)證型本質(zhì)、中藥方藥機制對中藥現(xiàn)代化研究具有重要意義。