關琴笑,廖嘉儀,張玉娥,李綺婷,譚娥玉,宋向崗

(1.江門市五邑中醫(yī)院,廣東 江門 529000;2.江門市藥品檢驗所,廣東 江門 529000)

慢性支氣管炎(Chronic bronchitis,CB)是臨床發(fā)病率較高的呼吸系統疾病之一,尤以老年人多發(fā)[1]。該病指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥,每年至少3個月且連續(xù)2年的慢性咳嗽和咳痰[2],屬于中醫(yī)學咳嗽、痰飲、咳喘等疾病范疇。古人云:“脾為生痰之源,肺為貯痰之器”[3],形象地說明了肺、脾功能失調,影響津液輸布與排泄,以致水濕內停,聚濕成痰,出現咳嗽、咳痰癥狀,也是現代疾病慢性支氣管炎的病理基礎,臨床常使用理氣健脾、燥濕化痰的中藥治療。

中藥陳皮CitriReticulataePericarpium為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮,藥材分為陳皮和廣陳皮,味苦、辛,歸肺脾經,有理氣健脾、燥濕化痰的功效,用于脘腹脹滿,食少吐瀉,咳嗽痰多。半夏PinelliaeRhizoma為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖,具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效,用于濕痰寒痰、咳喘痰多等癥。陳皮-半夏兩藥常作為經典化痰藥對配伍入復方[4],如二陳湯、溫膽湯,共奏理氣健脾、燥濕化痰行氣之功,現代研究表明,兩者可用于治療慢性呼吸系統疾病[5-6],但有關這一藥對治療CB的藥理學作用機制研究報道較少。本研究基于網絡藥理學,篩選陳皮-半夏藥對的活性成分,預測活性成分的作用靶點和生物學信號通路,探討陳皮-半夏藥對治療CB的潛在作用機制。

1 方法

1.1 陳皮-半夏化學成分和靶點收集

利用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及文獻檢索收集陳皮-半夏的化學成分,設置口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為篩選標準,結合文獻篩選出活性成分。使用TCMSP、BATMAN-TCM、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)數據庫獲得目標化合物的相關靶點,并利用Uniprot數據庫對靶點進行標準化處理。

1.2 CB疾病靶點和與成分交集靶點收集

在GeneCards(http://www.genecards.org/)數據庫中,以“chronic bronchitis”為搜索關鍵詞,獲得CB相關靶點,并歸納出藥對和疾病的交集靶點。

1.3 “陳皮半夏-活性成分-靶點”網絡關系構建及分析

將獲得藥對的活性成分及交集靶基因導入Cytoscape 3.7.2軟件,構建可視化網絡,直觀地反映活性成分和靶點的關系。網絡活性成分設置為長方形節(jié)點,靶點為橢圓形節(jié)點,節(jié)點之間連接次數越大,節(jié)度值(degree)越大,通過分析節(jié)度值和GeneCards數據庫中CB相關系數,預測重要活性成分和靶點。

1.4 蛋白質互作(PPI)網絡構建及核心靶點篩選

將交集靶點輸入String數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),物種限定為“Homosapiens”,相互作用閾值選定為0.7最高置信度,去除游離基因,構建PPI。邊(edge)的顏色深淺設置反映關系程度,導出交集靶蛋白相互作用關系網絡。通過分析網絡的節(jié)度值(degree),獲得PPI網絡中的核心靶點。

1.5 功能富集和基因組百科全書通路富集分析

利用David 2021數據庫(htpps://david.ncifcrf.gov/)對陳皮-半夏和CB交集靶點進行GO功能和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6 分子對接

從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取“藥物-活性成分-靶點”網絡關系圖中度值較高化合物的2D結構,將其導入Chem3D軟件轉換為3D結構,通過結構優(yōu)化使其能量最小化并保存為mol2 格式;通過PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載PPI網絡獲取到的核心蛋白受體結構,并利用 Pymol 軟件去水、去小分子配體,然后導入AutoDockTools軟件進行加氫等預處理后,將活性成分、蛋白受體的格式轉為*pdbqt 格式;最后利用Vina軟件進行分子對接,驗證其結合活性。

2 結果

2.1 化合物篩選

TCMSP數據庫中同時符合OB≥30%和DL≥0.18的成分,陳皮有7個,半夏有12個。查閱資料和文獻,陳皮中黃酮類和揮發(fā)油為其主要活性成分,且2020年版《中華人民共和國藥典》對陳皮的黃酮類成分橙皮苷、橘皮素有含量測定要求,揮發(fā)油中檸檬烯、γ-萜品烯含量較高,鄰甲氨基苯甲酸甲酯為廣陳皮的特征性成分[7-9]。故將以上5種成分納入分析,共篩選24個成分。見表1。

表1 陳皮-半夏化學成分信息

2.2 陳皮-半夏活性成分與CB的交集靶點

經整理,GeneCards數據庫中CB涉及1 204個疾病靶點,相關性分數范圍為0.21～61.04,中位數為4.83。目標活性成分共有331個靶點,其中91個為活性成分和CB的交集靶點。交集靶點在GeneCards數據庫中CB相關性分數范圍為0.82～45.48,中位數為7.79,70%交集靶點相關性>4.83,與疾病關系密切。TP53等11個靶點相關性分數>15(見表2),為陳皮-半夏治療CB的相關性較高靶點。

表2 CB疾病高相關性靶點信息

2.3 “陳皮半夏-活性成分-靶點-CB”網絡關系構建分析

可視化網絡(見圖1)中長方形代表陳皮-半夏中的 21種活性成分(去除無對應靶點的活性成分),橢圓形代表91個共同靶點,活性成分平均節(jié)度值為10.24,≥節(jié)度值15的成分(節(jié)度值)有柚皮素(21)、檸檬烯(19)、γ-萜品烯(18)、川陳皮素(17)、黃芩素(17)、β-谷甾醇(16)、橘皮素(15)。靶點平均節(jié)度值為2.36,PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2等節(jié)點節(jié)度值較大,4個及以上成分的交集靶點中,75%靶點相關性分數高于CB中位數(見表3)。從網絡中可看出,陳皮-半夏不同類型組分通過作用于不同靶點發(fā)揮作用。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”可視化網絡

表3 4種及以上活性成分的交集靶點信息

2.4 靶蛋白互作網絡分析

PPI網絡(見圖2),網絡中靶點之間的連線代表靶點間存在相互作用,網絡總邊數為324,平均節(jié)度值為7.12,PPI富集P<1.0e-16。靶點的節(jié)度值越大,表示該靶點在網絡中作用越關鍵,其中節(jié)度值>20的靶點(節(jié)度值)包括AKT1(26)、MAPK3(25)、TP53(25)、HSP90AA1(24)、JUN(24)、IL1B(21)、MAPK1(21)為核心靶點(見表4)。

圖2 靶蛋白的PPI網絡

表4 PPI網絡中核心靶點

2.5 靶基因功能分析

以P≤0.01為截點,靶基因涉及229個生物過程條目,39個細胞組成條目,55個分子功能條目。生物過程涉及缺氧反應、脂多糖反應、藥物反應、尼古丁反應、老化、外源刺激的反應、蛋白磷酸化正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、心室心肌細胞動作電位、凋亡過程的正向調控等;細胞組成涉及大分子配合物、細胞外間隙、細胞外區(qū)、細胞表面、膜筏、質膜、小窩、細胞外泌體、線粒體、肌膜等;分子功能涉及酶結合、血紅素結合、相同的蛋白質結合、蛋白質同源二聚化活性、離子通道結合、支架蛋白結合、轉錄輔激活劑結合、蛋白結合、芳香酶活性、Hsp90蛋白結合等。見圖3。

圖3 GO生物學富集分析

2.6 靶基因信號通路分析

KEGG富集分析結果(見圖4)以P≤0.01為截點,共獲得通路117條通路,主要包括癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、化學致癌-受體激活、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

圖4 KEGG通路富集分析

2.7 分子對接結果

“藥物-成分-靶點”網絡關系圖中度值較高化合物柚皮素、檸檬烯、γ-萜品烯、川陳皮素、黃芩素、β-谷甾醇、橘皮素分別與PPI網絡的核心靶點AKT1(PDB ID:4EJN)、MAPK3(PDB ID:2ZOQ)、TP53(PDB ID:5AOM)、HSP90AA1(PDB ID:3O0I)、JUN(PDB ID:5T01)、IL1B(PDB ID:5R85)、MAPK1(PDB ID:6SLG)進行分子對接。根據文獻報道,一般結合能分值≤-5.0kCal/mol,表示成分和靶點具有較好結合作用[10]。結果主要活性成分與核心靶點的結合能均小于-5.0kCal/mol,表明其具有較好的結合能力(見表5、圖5)。

注:A.AKT1與川陳皮素;B.AKT1與黃芩素;C.AKT1與柚皮素;D.HSP90AA1與黃芩素;E.HSP90AA1與柚皮素;F.JUN與川陳皮素;G.JUN與黃芩素;H.MAPK1與黃芩素;I.MAPK3與黃芩素。

表5 活性化合物與核心靶點結合能

3 討論

本研究利用TCMSP等數據庫,研究了陳皮-半夏的活性成分治療慢性支氣管炎的分子機制,篩選出陳皮的黃酮、揮發(fā)油,半夏甾醇、黃酮多個物質基礎。在活性成分-靶點網絡中,柚皮素、檸檬烯、γ-萜品烯、川陳皮素、黃芩素、β-谷甾醇作用于較多靶點,為主要活性成分;AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1為PPI網絡核心靶點。

柚皮素、川陳皮素、黃芩素為黃酮類成分,均具有抗炎的藥理作用。Fouad等[11]表明,柚皮素能明顯減輕LPS誘導急性肺損傷模型大鼠肺組織病理損傷,顯著降低肺組織中TNF-α、caspase-3的表達,顯著升高HSP70的表達。Chen等[12]研究發(fā)現,陳皮黃酮類成分川陳皮素具有良好的抗炎作用,減少促炎因子NO,抑制誘導型的iNOS和COX-2基因的表達。Duan等[13]研究表明,黃芩素顯著抑制脂多糖LPS刺激的巨噬細胞系中炎性因子的TNF-α、IL-4和IL-6的表達。揮發(fā)油類成分檸檬烯、γ-萜品烯也具有抗炎作用。檸檬烯誘導的A2A腺苷受體激活可減少哮喘小鼠模型中的氣道炎癥和反應性[14];γ-萜品烯能減少卡拉膠誘導的腹膜炎模型動物的中性粒細胞遷移,以及IL-1β和TNF-α的產生[15]。此外,檸檬烯、γ-萜品烯具有抗氧化作用[16]。β-谷甾醇為甾醇類化合物,能減少卵蛋白誘導的哮喘小鼠模型中支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞,降低肺組織和BAL液中IL-4和IL-5[17]。

PTGS2、PTGS1為陳皮-半夏藥對較多成分的相同靶點,慢性支氣管疾病如哮喘與PTGS1和PTGS2基因的遺傳變異有關[18]。Wu等[19]研究表明,川陳皮素的主要代謝物4′-Demethylnobiletin(4DN)具有一定的抗炎作用,4DN不僅劑量依賴性地抑制LPS誘導的NO的產生,顯著降低促炎介質PGE2、IL-1β和 IL-6,在蛋白和mRNA水平上抑制iNOS和COX-2的表達,還抑制NF-κB和AP-1的核轉位。ADRB2基因編碼β2腎上腺素受體,主要分布于支氣管平滑肌、血管平滑肌和心肌等,介導支氣管平滑肌松弛,血管擴張等作用,β2受體激動劑治療支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎等呼吸系統疾病療效較好[20-21]。SCN5A、KCNH2屬于電壓門控通道,與慢性呼吸系統疾病相關的研究較少,Chatterjee等[22]研究肺內皮失去流體剪切應力(缺血)時,通過ATP敏感的K+通道關閉,引起內皮質膜去極化,啟動信號級聯,導致NOX2激活和ROS產生。其他多配體靶點還包括激素受體ESR1、AR,神經系統的CHRM3、ACHE等。研究表明,肺癌和慢性阻塞性肺病的發(fā)病率在女性中均顯著增加,可能與生殖器官合成的雌激素以及局部肺雌激素合成,參與激活肺中多種細胞類型表達的雌激素受體有關,促進生長和肺部炎癥表達[23-24]。

基于String數據庫構建陳皮-半夏藥對治療CB靶點PPI網絡,篩選出的核心基因有AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1等。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K/AKT信號通路中核心因子,研究表明,AKT1通過誘導巨噬細胞產生IL-13來調節(jié)肺纖維化[25]。MAPK基因編碼絲裂原活化蛋白激酶,是信號從細胞表面?zhèn)鲗е良毎藘炔康闹匾獋鬟f者,能被不同的細胞外刺激,如細胞因子、激素、神經遞質、細胞應激及細胞黏附等激活。研究發(fā)現,LPS激活慢性支氣管炎大鼠巨噬細胞MAPK后,ERK和p38 MAPK抑制劑可顯著抑制其巨噬細胞中COX-2和TGF-β的表達[26]。TP53基因是一種抑癌基因,Zhou等[27]研究發(fā)現,橙皮素能抑制AKT1、IL6、VEGFA、MMP9上調TP53蛋白表達,從而降低COPD發(fā)病風險進展為肺癌。HSP90AA1屬于熱休克蛋白,應激狀態(tài)時幫助細胞維持正常的生理活動。Wang等[28]研究發(fā)現,HSP90AA1可能是慢性阻塞性肺疾病潛在的治療靶點。

GO生物學富集結果主要集中于細胞對缺氧的反應、脂多糖的反應、藥物的反應、尼古丁的反應、外源刺激的反應及老化等。KEGG 通路富集結果主要集中于AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。AGE-RAGE信號通路與炎癥和抗氧化應激有關,在RAGE的各種配體中,晚期糖基化終末產物(AGEs)主要與慢性呼吸系統疾病COPD相關[29]。AGEs作用于GLUTag細胞,可上調細胞RAGE受體表達,激活NADPH 氧化酶,升高 p38MAPK磷酸化水平,促使NF-κB 因子表達,釋放炎癥因子,并調節(jié)細胞凋亡相關蛋白表達,從而導致細胞炎癥損傷與凋亡[30]。TNF信號通路與炎癥有關,半夏能抑制小鼠主動脈內皮細胞炎性因子TNF-α、IL-6的分泌[31];川陳皮素能通過抑制NF-κB和AKT1激活,來抑制TNF-介導的炎癥反應[32]。MAPK信號通路與炎癥和細胞凋亡有關,在慢性支氣管炎的進程中,p38MAPK通路通過對肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等多種細胞的作用、對炎癥因子產生的調控、對酶的誘導,以及促進轉錄因子活化等機制來調節(jié)炎癥過程的發(fā)生發(fā)展[33-35]。PI3K-Akt信號通路與炎癥有關,實驗研究證實,PI3K-Akt信號通路參與支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎、肺纖維化等呼吸系統疾病[36-38]。

綜上,本研究基于網絡藥理學探討陳皮-半夏藥對治療CB的潛在活性成分、關鍵靶點和信號通路。陳皮-半夏藥對治療CB的作用機制可能與其中所含的柚皮素、川陳皮素、黃芩素、檸檬烯、γ-萜品烯、β-谷甾醇、橘皮素等多種活性成分,通過調控AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用相關,為分子機制研究提供了方向。