鄧俊昆

(廣東省中醫(yī)院 藥學(xué)部 制劑科,廣東 廣州 510170)

莪棱膠囊由赤芍、丹參、郁金、醋鰲甲、蒸枳殼、浙貝母等十一味中藥組成,是由廣東省中醫(yī)院老中醫(yī)經(jīng)驗方結(jié)合臨床實踐研制的醫(yī)院制劑,主要用于治療子宮肌瘤和子宮內(nèi)膜異位癥等。目前,學(xué)界對其質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報道僅有芍藥苷單一成分的含量測定方法[1],以及丹參、枳殼、延胡索的薄層鑒別方法[2],缺乏多指標(biāo)的含量檢測和質(zhì)量控制方法。為了更好、更全面地控制莪棱膠囊的內(nèi)在質(zhì)量,本研究采用高效液相色譜(HPLC)波長切換法同時測定莪棱膠囊中5種活性成分的含量,以確保其臨床用藥安全有效,為后續(xù)莪棱膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(Agilent公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司);ME104E型電子天平(梅特勒-托利多)。

1.2 試藥

莪棱膠囊(批號:21050601、21052202、21060402)及其陰性對照樣品均為本院制劑;芍藥苷對照品(批號:110736-201927,含量:98.2%)、柚皮苷對照品(批號:110722-202012,含量:94.6%)、橙皮苷對照品(批號:110721-202008,含量:97.8%)、丹酚酸B對照品(批號:111562-201926,含量:96.7%)和丹參酮ⅡA對照品(批號:110766-202011,含量:94.3%),均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈和甲醇為色譜純,磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),切換檢測波長進(jìn)行梯度洗脫(230nm:0～15min 15%A;280nm:15～16min,15%A→21%A,16～32min,21%A,32～45min,21%A→55%A;270nm,45～68min,55%A→85%A);流速1.0mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣體積10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取適量5種待測組分對照品,先用甲醇溶解定容制得不同濃度的單一對照品溶液,再分別精密吸取適量體積的上述單一對照品溶液,置于同一容量瓶中,加甲醇稀釋定容,制得質(zhì)量濃度為芍藥苷18.06mg/mL、柚皮苷7.41mg/mL、橙皮苷24.93mg/mL、丹酚酸B 3.74mg/mL、丹參酮ⅡA1.06mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取莪棱膠囊適量,去掉膠囊后研細(xì)混勻,過80目篩,精密稱取1.0g左右的細(xì)粉,加甲醇50mL,稱定質(zhì)量,超聲提取(功率250W,頻率50kHz)30min,放置室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 陰性對照溶液 根據(jù)莪棱膠囊處方工藝,制備不含赤芍、丹參、枳殼藥材的陰性對照樣品,并按“2.2.2”項下方法處理,制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。

注:1.芍藥苷;2.柚皮苷;3.橙皮苷;4.丹酚酸B;5.丹參酮ⅡA。

從圖1可見,供試品溶液的色譜圖和混合對照品溶液的色譜圖有保留時間相同的色譜峰,而陰性對照溶液的色譜圖在對應(yīng)位置無色譜峰出現(xiàn)。此外,待測的5個成分與其相鄰的峰之間均達(dá)到了基線分離,周邊無雜質(zhì)峰干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液2、5、10、15、20μL,按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程,結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度實驗

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液10μL,注入液相色譜儀,連續(xù)6次進(jìn)樣測定峰面積,分別計算RSD。結(jié)果該方法的精密度良好,芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柚皮苷和橙皮苷的RSD值分別為0.69%、0.57%、0.38%、0.40%和0.52%,均小于2%。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液,在制備后的第0、2、4、8、12、24h分別進(jìn)樣10μL,測定芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柚皮苷和橙皮苷的峰面積,計算出RSD值分別是0.88%、1.12%、0.93%、0.69%和0.77%,表明在該檢測條件下供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗

取同一批次莪棱膠囊(批號:21050601),按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備,在相同的色譜條件下測定5種成分的含量和RSD值。結(jié)果顯示,芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柚皮苷和橙皮苷的含量分別為4.17、0.61、0.22、1.75和5.25mg/g,RSD值分別為0.98%、1.28%、1.64%、1.02%和1.23%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗

取已知含量的莪棱膠囊(批號:21050601)細(xì)粉約0.5g,平行6份,分別準(zhǔn)確加入適量的混合對照品溶液,按照上述供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測。加樣回收率的試驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示,芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、丹酚酸B和丹參酮ⅡA的平均回收率分別為100.53%(RSD=0.41%)、98.91%(RSD=1.26%)、98.56%(RSD=0.53%)、100.03%(RSD=0.93%)和99.54%(RSD=0.99%),表明該方法回收率良好。

表2 五種成分的加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測定

取3批莪棱膠囊(批號:21050601、21052202、21060402),按照上述供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測,做3次平行,根據(jù)峰面積計算各待測組分的含量(mg/g),結(jié)果見表3。

表3 莪棱膠囊各組分含量測定結(jié)果 (mg/g,n=3)

3 討論

3.1 檢測成分選擇

莪棱膠囊包含十一味中藥,前期預(yù)試驗曾結(jié)合2020版《中華人民共和國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)報道[3-5]對其可能存在的活性成分進(jìn)行檢測,結(jié)果當(dāng)歸(阿魏酸)、郁金(姜黃素)和浙貝母(貝母素甲、貝母素乙)等藥材中這些活性成分未見特征峰或峰分離效果不好,分析其原因可能有兩個,一是各中藥在莪棱膠囊處方中所占比例不同,二是不同中藥之間存在相互作用或干擾。本研究根據(jù)前期實驗結(jié)果并綜合考慮各活性成分色譜峰情況、含量差異,以及制劑的綜合評價,最終確定以芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、丹酚酸B和丹參酮ⅡA這5種特征峰明顯且分離較好的組分作為莪棱膠囊質(zhì)量控制的檢測指標(biāo)。

3.2 檢測波長確定

由于本研究檢測的5種活性成分最大吸收波長并不相同,為了能夠使莪棱膠囊中的這些成分在同一色譜條件下均可檢測出。本實驗采用HPLC波長切換法檢測,根據(jù)莪棱膠囊中這5個待測組分的最大吸收波長或接近其最大吸收波長作為本實驗的檢測波長。通過二極管陣列檢測器對各組分進(jìn)行全波長掃描,并結(jié)合《中華人民共和國藥典》和文獻(xiàn)[6]中檢測波長,最終確定了230nm(芍藥苷)、280nm(橙皮苷、柚皮苷、丹酚酸B)和270nm(丹參酮ⅡA)三個檢測波長,在實驗中均取得了較好的檢測效果。

3.3 色譜條件選擇

莪棱膠囊作為由十一味藥材組成的中藥復(fù)方制劑,其包含的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量眾多,不同類型的成分理化性質(zhì)均不相同,為了讓選擇的檢測組分實現(xiàn)較好的分離效果,本研究曾對乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸等不同流動相體系進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,最合適的溶劑體系是采用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫,在該色譜條件下,莪棱膠囊中的5個待測組分均表現(xiàn)出良好的分離效果,可以用于其含量測定。

3.4 供試品溶液制備方法選擇

本研究曾根據(jù)莪棱膠囊中5種活性成分的理化性質(zhì),以理論板數(shù)、出峰情況和雜質(zhì)干擾情況等作為評價指標(biāo),分別考察了不同提取溶劑(甲醇、稀乙醇、50%甲醇、70%乙醇、70%甲醇)、不同提取方法(超聲提取、水浴回流)和不同提取時間(15、30、45、60min)下各待測組分的檢測效果,最終確定“2.2.2”項下的制備方法。

4 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜(HPLC)波長切換法快速測定莪棱膠囊中5種活性成分的含量,并對其進(jìn)行了方法學(xué)考察,結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定可行。運用此方法對三批樣品的檢驗結(jié)果顯示莪棱膠囊中芍藥苷含量為4.05～4.23mg/g、柚皮苷含量為1.48～1.63mg/g、橙皮苷含量為4.96～5.22mg/g、丹酚酸B含量為0.58～0.67mg/g、丹參酮ⅡA含量為0.18～0.26mg/g。測定出不同批次莪棱膠囊各組分的含量波動范圍較小,質(zhì)量較穩(wěn)定,可成為莪棱膠囊質(zhì)量控制的一種有效方法。