徐艷群，蔣愛月，唐石云，李振杰，向能軍，劉志華，太志剛**

(1.云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科紫蘇屬藥用植物，性溫，味辛，紫蘇葉具有發(fā)散風(fēng)寒，行氣和胃之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)表明紫蘇具有抗過敏炎癥、抗衰老、抑制血小板凝聚、預(yù)防癌變和降血脂等活性[1].中國紫蘇資源豐富，在食品和化妝品等行業(yè)具有廣闊的市場空間.從紫蘇葉中獲取的揮發(fā)油具有抑菌、提高免疫功能、抑制中樞系統(tǒng)及抗氧化的藥理作用，其化學(xué)成分主要為單萜、倍半萜、芳香類、脂肪族類等[2].但以上成分均具有揮發(fā)性，在常溫常壓下，易氧化和損失.微膠囊技術(shù)可有效地解決以上問題，可延緩香氣釋放，在常溫常壓下，香味物質(zhì)被包裹在囊材中，釋放量較少，加熱時，香味物質(zhì)緩慢釋放出來[3-5].目前，已有相關(guān)文獻(xiàn)報道的紫蘇葉精油微膠囊多以噴霧干燥法進(jìn)行包裹，如蘇劉花等[6]以紫蘇精油為芯材，以殼聚糖、蔗糖、葡萄糖為壁材，采用噴霧干燥制得紫蘇精油微膠囊，常溫下保持紫蘇精油的穩(wěn)定性，在加熱時緩緩釋放香氣，其刺激感降低，香韻增加.李會珍等[7]公開了一種紫蘇精油微囊的制備方法，選用低黏度辛烯基琥珀酸淀粉酯作為壁材，通過噴霧干燥法成功制備其微膠囊，作為有效的保鮮劑，長效作用于果蔬.以上方法可有效包裹紫蘇精油，保證其穩(wěn)定性，但其制備方法多以噴霧干燥法為主，操作溫度較高，易使部分紫蘇精油揮發(fā)損失.

單凝聚是一種微膠囊包埋技術(shù)，通過在高分子囊材溶液中加入凝聚劑，降低高分子溶解度，促使其凝聚成囊，具有操作簡單，容易成囊，便于擴(kuò)大化生產(chǎn)的特點(diǎn)[8-9].有相關(guān)文獻(xiàn)報道采用單凝聚法制備微膠囊，可保持其中芯材的穩(wěn)定和緩釋性.如吳紹明等[10]以殼聚糖為壁材，橄欖油為芯材，采用單凝聚法制備了護(hù)膚保健功能的微膠囊，有效避免橄欖油的氧化，保持了其穩(wěn)定性.目前，還未發(fā)現(xiàn)單凝聚法制備紫蘇精油微膠囊的研究報道，本研究擬以明膠為壁材，采用單凝聚法對紫蘇葉精油進(jìn)行包埋，以包埋率為指標(biāo)，對其工藝進(jìn)行優(yōu)化，所得產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性研究，以期對其在煙草和食品應(yīng)用方面奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料與儀器明膠購自山東大凱生物科技有限公司，紫蘇葉油購自華新植物精油公司，乙酸、甲醛、氫氧化鈉和無水硫酸鈉均為分析純，購自于國藥集團(tuán)有限公司.SZCL2 數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LGJ10真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；t25 高速分散機(jī)，德國IKA 公司；Quanta200 掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI 公司；Agilent 7890A/MS5977B 氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS），美國安捷倫科技有限公司；TG/DSC 型熱重/差熱綜合熱分析儀，瑞士 Mettler Toledo 公司.

1.2 紫蘇葉精油微膠囊的制備及形貌觀察將適量明膠與蒸餾水混合后，保持60 ℃，時時攪拌，使其溶解，將適量紫蘇葉精油加入以上溶液中，乳化，持續(xù)攪拌，滴加10%乙酸，調(diào)pH 為3.3～3.8，緩緩滴加適量20 g/100 mL 硫酸鈉溶液，再適量滴加10 g/100 mL 的硫酸鈉稀釋液，持續(xù)攪拌，加冰冷卻，滴加適量甲醛溶液（12 mol/L），持續(xù)攪拌，采用20 g/100 mL 氫氧化鈉調(diào)pH 為8，攪拌一定時間，抽濾，蒸餾水反復(fù)洗滌，冷凍干燥得紫蘇葉精油微膠囊.取一滴紫蘇葉精油微膠囊懸浮液，將其置于載玻片上，于光學(xué)顯微鏡（IM）下觀察，拍照記錄.取少量紫蘇葉精油微膠囊固定于掃描電鏡平臺上（SEM），保持真空度小于10 Pa，電流大于15 mA，噴金120 s，樣品高度9.1 mm，電鏡電壓5 kVA，放大5 000 倍.

1.3 包封率測試按照Toure 等[11]的方法，稍作修改進(jìn)行包封率測試，將200 mg 紫蘇葉精油微膠囊置于40 mL 蒸餾水中浸泡，攪拌分散，加入40 mL正己烷，混勻，靜置，取正己烷層，補(bǔ)加正己烷定容至50 mL，得到游離紫蘇精油.余下的水液超聲5～15 min 充分分散，加入40 mL 正己烷，超聲5 min，并時時搖勻，密封，靜置30～60 min，4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心3 次，每次10 min，取正己烷萃取相并定容至50 mL，得膠囊核內(nèi)紫蘇葉精油.對游離和核內(nèi)紫蘇葉精油進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用測定，條件如下：色譜柱型號為HP-5 ms（30 m×?0.25 mm,0.25 μm），進(jìn)樣口280 ℃，氦氣流速1 mL/min，升溫梯度如：50 ℃（保持3 min），50 ℃→280 ℃（速率為3 ℃/min），280 ℃（保持10 min）.質(zhì)譜條件為：EI 離子源，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描范圍45～500.通過主要化合物峰面積對紫蘇葉精油微膠囊的包埋率進(jìn)行計算，公式如下：

式中：A內(nèi)為紫蘇葉油微膠囊核內(nèi)精油峰面積；A游為游離紫蘇精油峰面積.

1.4 單因素試驗

1.4.1 芯壁質(zhì)量比優(yōu)化 在其它同等條件不變的情況下，固定凝聚時間60 min，凝聚溫度40 ℃和pH 3.8，考察芯壁質(zhì)量比為1∶2、1∶1、1.5∶1、2∶1，按照以上制備方法，得到不同芯壁質(zhì)量比的紫蘇葉精油微膠囊，測定包埋率，重復(fù)3 次.

1.4.2 單凝聚時間優(yōu)化 在其它同等條件不變的情況下，固定芯材與壁材質(zhì)量比為1.5∶1，凝聚溫度40 ℃和pH 3.8，在單凝聚時間分別為 30、45、60、75、90、105 min 和120 min 的條件下，制備紫蘇葉精油微膠囊，測定包埋率，重復(fù)3 次.

1.4.3 單凝聚溫度優(yōu)化 在其它同等條件不變的情況下，固定芯材與壁材質(zhì)量比為1.5∶1，單凝聚時間60 min 和pH 3.8，在單凝聚溫度分別在35、40、45 ℃和50 ℃的條件下制備紫蘇葉精油微膠囊，測定包埋率，重復(fù)3 次.

1.4.4 凝聚 pH 在其它同等條件不變的情況下，固定芯材與壁材質(zhì)量比為1.5∶1，單凝聚時間60 min，凝聚溫度35 ℃，在凝聚pH 分別為3.0、3.3、3.5、3.8、4.1 和4.5 的條件下制備紫蘇葉精油微膠囊，測定包埋率，重復(fù)3 次.

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計為進(jìn)一步優(yōu)化單凝聚法制備紫蘇葉精油微膠囊的最佳工藝條件，本研究在以上單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[12]，對芯材與壁材質(zhì)量比、單凝聚時間、單凝聚溫度、凝聚pH 值等4 個因素進(jìn)行優(yōu)化，并以之為自變量，以包埋率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗.

1.6 穩(wěn)定性測試經(jīng)工藝優(yōu)化后，按照最佳條件制備的紫蘇葉精油微膠囊，取適量，精確稱重，常溫置于空氣中，定時稱量其質(zhì)量變化和包埋率，記錄數(shù)據(jù)，研究常溫穩(wěn)定性.

取以上制備的樣品和適量紫蘇葉精油，進(jìn)行熱重分析.儀器開機(jī)后，于800 ℃保持15 min，排除相關(guān)雜質(zhì).分別將紫蘇葉精油微膠囊和其精油置于坩堝中，起始溫度為30.0 ℃，在80 mL/min 的氮?dú)夥諊鷥?nèi)，以10 ℃/min 的速率升溫至800.0 ℃.通過以上試驗研究加溫穩(wěn)定性.

1.7 數(shù)據(jù)處理每次實(shí)驗測定3 次，以平均值±SD 表述結(jié)果，采用Origin8.5 對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6.1 對響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析.其中，P＜0.01 表示差異高度顯著，P＜0.05 表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 芯壁質(zhì)量比優(yōu)化 芯壁質(zhì)量比分別為1∶2、1∶1、1.5∶1 和2∶1 時，顯微鏡拍照顯示見圖1.

圖1 不同芯壁質(zhì)量比制備所得紫蘇葉精油微膠囊的形貌圖Fig.1 IM picture of PO/GE at different ratio of core to wall

如圖1 所示，芯壁質(zhì)量比在1∶2～2∶1 范圍內(nèi)，均能看到單壁紫蘇葉精油微膠囊，為球狀，當(dāng)包封率為1.5∶1 時，微膠囊數(shù)量最多.圖2 顯示，當(dāng)芯壁質(zhì)量比低于1.5∶1 時，隨芯壁質(zhì)量比增加，包封率逐漸增加，當(dāng)芯壁質(zhì)量比達(dá)1.5∶1 時，包封率達(dá)到89.4%；高于1.5∶1 時，隨芯壁質(zhì)量比增加，包封率降低.同時，在包封率最高處，即芯壁質(zhì)量比為1.5∶1 時，所對應(yīng)微囊的的掃描電鏡如圖3 所示，視野中，微膠囊數(shù)量較多，且微囊表面光滑，囊壁完整無裂紋，尺寸范圍多在20～40 μm，存在絮狀物.這是因為在凝聚過程中，有部分未包裹成功的凝聚態(tài)明膠.此結(jié)果說明紫蘇葉精油含量增加時，囊材相對變薄，致使部分紫蘇葉精油不能進(jìn)入壁材，即使進(jìn)入也有部分精油再泄漏出來.以上結(jié)果說明，芯壁質(zhì)量比的變化對單凝聚包裹紫蘇葉精油具有顯著影響，當(dāng)芯壁質(zhì)量比為1.5∶1 時，包封率達(dá)到最佳值89.4%.

圖2 不同芯壁質(zhì)量比時紫蘇葉微膠囊的包埋率Fig.2 Effect of different ratio of core to wall on embedding rate

圖3 芯壁質(zhì)量比為1.5∶1 紫蘇葉精油微膠囊掃描電鏡圖Fig.3 SEM picture of PO/GE at ratio of core to wall 1.5∶1

2.1.2 單凝聚時間 由圖4 可知，當(dāng)明膠凝聚時間在30～42 min 內(nèi)，紫蘇葉精油包埋率由83.5%微降至81.0%，排除誤差因素，聚合初期，因濃度差大，聚合速率相對較快，單位時間產(chǎn)生的微膠囊較多，隨著時間延長，包封率降低，部分膠囊再次解聚，致使包封率降低.當(dāng)明膠凝聚時間在42～63 min內(nèi)，紫蘇葉精油包埋率由81.0%升至88.7%，這可能是隨著時間的增加，明膠仍有較大濃度差，不斷凝聚，包埋率逐漸增加.當(dāng)明膠凝聚時間超過63 min 之后，包埋率反而降低，說明有部分明膠解聚致使已包裹的紫蘇葉精油釋放出來.由此可見，63 min 為紫蘇葉精油微膠囊包埋的最佳凝聚時間.

圖4 不同凝聚時間紫蘇葉精油微膠囊的包埋率Fig.4 Effect of coagulation time on embedding rate

2.1.3 單凝聚溫度 由圖5 可知，當(dāng)凝聚溫度處于35～50 ℃范圍內(nèi)時，包埋率先增大后減小，溫度達(dá)40 ℃時，包埋率達(dá)到最佳值85.8%.35～40 ℃時，溫度升高，聚合加速，包埋率增加，當(dāng)溫度為40 ℃時，聚合達(dá)到飽和，繼續(xù)升高溫度，明膠的分子熱運(yùn)動加劇，再次解聚，溶解，聚合朝逆向進(jìn)行，導(dǎo)致包埋率較低.以上結(jié)果表明，聚合溫度為40 ℃時為紫蘇葉精油微膠囊包埋的最佳凝聚溫度.

圖5 不同凝聚溫度下紫蘇葉精油微膠囊的包埋率Fig.5 Effect of coagulation temperature on embedding rate

2.1.4 凝聚pH 值 由圖6 可知，調(diào)pH 由3.0 至4.5 時，包埋率先增大后減小，當(dāng)pH 值為3.6 時，包埋率達(dá)到了最大值86.2%.以上結(jié)果說明，明膠凝聚過程中，pH 是一個重要因素，pH 值或高或低均不利于單凝聚包裹進(jìn)行，當(dāng)pH 為3.6 時，凝聚效率最佳，包埋率最高.

圖6 不同pH 下紫蘇葉精油微膠囊的包埋率Fig.6 Effect of pH on embedding rate

2.2 試驗工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗 根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果，選擇對包埋率影響較為顯著的4 個因素，分別為芯壁質(zhì)量比（A）、凝聚時間（B）、凝聚溫度（C）、凝聚pH 值（D），將這4 個因素設(shè)為自變量，以包埋率為響應(yīng)值，設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗.其中，表1 為試驗因素和水平，表2 為試驗方案、數(shù)據(jù)及結(jié)果.

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Tab.1 Response surface design of factors and their levels

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 The test programme and results of response surface method

基于表2 的數(shù)據(jù)與結(jié)果，為了進(jìn)一步體現(xiàn)芯材與壁材的質(zhì)量比（A）、凝聚時間（B）、凝聚溫度（C）、凝聚pH 值（D）這4 個因素對紫蘇葉精油微膠囊包埋率的影響，根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進(jìn)行二次多項回歸分析，最終得到多元二次回歸方程，方程如下：

Y=90.64+1.02A+0.53B-1.31C+0.38D+0.33AB-0.45AC+0.100AD-1.18BC+0.60BD+2.50CD-4.47A2-2.38B2-1.92C2-4.75D2，其中，決定系數(shù)0.84，CV 為2.42%.

2.2.2 響應(yīng)面方差分析 回歸方程各項的方差分析結(jié)果如表3 所示.

表3 回歸方程各項的方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression equation

由表3 可知，方差來源中的模型項所對應(yīng)的P值為0.001 9，小于0.01；失擬項P值為0.119 1，大于0.05，即P=0.119 1＞0.05，說明該二次方程模型差異高度顯著，方程較理想，說明該方程擬合芯材與壁材的質(zhì)量比（A）、凝聚時間（B）、凝聚溫度（C）和凝聚pH 值（D）4 個因素，與紫蘇葉精油微膠囊包埋率之間的關(guān)系可行.該方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.84，這個結(jié)果說明以上所得模型與實(shí)際試驗之間具有良好的擬合度.綜合以上結(jié)果，參考文獻(xiàn)[14]，所得二次方程模型與實(shí)際情況擬合良好，可以用于預(yù)測紫蘇葉精油微膠囊包埋率的變化.

F值為均方的比值，越大說明差異越顯著.F值的大小可反映各因素對紫蘇葉精油微膠囊包埋率影響，F(xiàn)值增加，影響越顯著[15].由表3 所示，A（芯壁質(zhì)量比）、B（凝聚時間）、C（凝聚溫度）和D（凝聚pH）的F值分別為2.99、0.81、4.87 和0.42，因此，紫蘇葉精油微膠囊受各因素影響程度大小的次序為凝聚溫度（C）＞芯壁質(zhì)量比（A）＞凝聚時間（B）＞凝聚pH（D），其中凝聚溫度（C）對包埋率的影響顯著（P＜0.05）.

2.2.3 響應(yīng)面分析 進(jìn)一步通過交互影響分析各因素對紫蘇葉精油微膠囊包埋率的影響.具體如圖7 所示，圖7（a）為凝聚溫度與凝聚pH 的交互影響，圖7（b）為凝聚時間與凝聚pH 的交互影響，圖7（c）為芯壁質(zhì)量比與凝聚時間的交互影響，圖7（d）為凝聚溫度與芯壁質(zhì)量比的交互影響，圖7（e）為凝聚溫度與凝聚時間的交互影響，圖7（f）為芯壁質(zhì)量比與凝聚pH 的交互影響.三維曲面能有效直觀分析凝聚溫度、芯壁質(zhì)量比、凝聚時間和凝聚pH 因素及它們之間的交互作用對包埋率的影響.

圖7 各因素交互影響紫蘇葉精油微膠囊的包埋率響應(yīng)面Fig.7 Response surface of PO/GE embedding rate influenced by different factors

圖7（a）～7（f）等高線圖呈橢圓形，說明凝聚溫度、芯壁質(zhì)量比、凝聚時間和凝聚pH 對紫蘇葉精油微膠囊的包埋率的影響顯著，以上結(jié)果與表2 中的顯著性分析基本是一致的.

2.3 最佳工藝條件的驗證以包埋率為指標(biāo)，基于所得模型，利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，紫蘇葉精油微膠囊最佳工藝為芯壁質(zhì)量比（A）為1.5∶1、單凝聚時間（B）為63.9 min、單凝聚溫度（C）為39.1 ℃、凝聚 pH 值（D）為3.6，通過以上理論計算，在此條件下所得包埋率應(yīng)為90.1%.基于以上所得優(yōu)化條件，開展了3 組實(shí)際驗證試驗，最終所得平均包埋率為88.3%，誤差為±0.95%，接近于理論值，以上結(jié)果與單因素優(yōu)化結(jié)果基本一致，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝所得的最佳條件可靠.

2.4 穩(wěn)定性分析為了進(jìn)一步驗證紫蘇葉精油微膠囊的穩(wěn)定性，采取2 種方式研究其穩(wěn)定性.第1種方式為常溫穩(wěn)定性研究，將微膠囊置于常溫空氣中，研究其質(zhì)量和包埋率變化.隨時間推移，其質(zhì)量沒有減少，反而增加，其原因是微膠囊經(jīng)干燥后，其飽和水低于空氣中水汽飽和度，造成吸水效應(yīng)，第1 天吸收率達(dá)0.39%，第2～7 天吸水率呈微小上升趨勢，此結(jié)果與文獻(xiàn)[16]報道相符.基于以上，本研究進(jìn)一步測試了常溫下紫蘇葉精油微膠囊7 天內(nèi)的包埋率，結(jié)果如圖8～9 所示，在第1 天內(nèi)，包封率由88.4%降到85.1%，而第2～7 天變化微小，此結(jié)果說明有少量未被包裹的精油附在微膠囊表面，并在空氣中自由揮發(fā)，導(dǎo)致其包埋率降低.而膠囊內(nèi)部的精油被明膠所包裹，不易在常溫下釋放出來，故后續(xù)其包埋率不變.

圖8 常溫下紫蘇葉精油微膠囊質(zhì)量變化Fig.8 Weight-change curve of PO/GE in room temperature

圖9 常溫下紫蘇葉精油微膠囊包埋率的變化Fig.9 Content change of PO/GE in room temperature

第2 種方式是采用持續(xù)加溫的方式觀察其加熱穩(wěn)定性.如圖10 所示，圖10（a）和圖10（b）分別為紫蘇葉精油及其微膠囊的熱重和熱差曲線，圖10（a）顯示紫蘇葉精油失重的溫度在30～186 ℃區(qū)間，描述失重曲線和DSC 曲線的變化，數(shù)據(jù)表明失重率為82.5%.紫蘇葉精油微膠囊的失重范圍為110～440 ℃，描述失重曲線和DSC 曲線的變化，失重率為65%.以上結(jié)果說明紫蘇葉精油微膠囊較未包裹精油熱分解溫度增加，熱穩(wěn)定性大幅增加，可有效保持紫蘇葉精油的穩(wěn)定性.

圖10 紫蘇葉精油及其微膠囊的熱重和差熱分析Fig.10 TG/DSC curve of PO and PO/GE

3 結(jié)論

本文采用明膠單凝聚法制備單壁微膠囊，以紫蘇葉精油為芯材，結(jié)合冷凍干燥法成功制備了紫蘇葉精油微膠囊，通過顯微鏡和掃描電鏡觀察其形貌.進(jìn)一步以包埋率為指標(biāo)，采用單因素試驗，考察并初步優(yōu)化了芯壁質(zhì)量比、單凝聚時間、單凝聚溫度和凝聚pH，根據(jù)以上結(jié)果，采用 Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行了四要素三水平的響應(yīng)面試驗，得到最佳優(yōu)化條件為芯壁質(zhì)量比為1.5∶1、凝聚時間63.9 min、凝聚溫度39.1 ℃、pH 值為3.6，包埋率理論值達(dá)90.1%，實(shí)際驗證為88.3%，結(jié)果證明該結(jié)果合理.基于以上，進(jìn)一步研究紫蘇葉精油微膠囊的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常溫下，微膠囊穩(wěn)定，存放時間加長，包埋率沒有發(fā)生改變.加熱時，其熱穩(wěn)定性較未包裹紫蘇葉精油增強(qiáng).以上研究表明，經(jīng)過優(yōu)化工藝制備的紫蘇葉精油微膠囊包埋率較高，穩(wěn)定性增強(qiáng)，在食品、煙草和芳香療法產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用具有良好前景.