王靜蕾,祝國強(qiáng),陳毅凡,王紅艷

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院,山東 煙臺 264670)

0 引言

近年來,我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,產(chǎn)量由1978年的5.8 萬t提高至2020年的4 016.43萬t,已成為我國繼糧、油、蔬、果后的第5大種植業(yè)[1]。食用菌屬異養(yǎng)型生物,營腐生或寄生生活,生長發(fā)育過程中依靠自身分泌的胞外酶分解外界的有機(jī)物而獲得營養(yǎng)。野生食用菌多以腐木和腐葉等作為營養(yǎng)來源,人工栽培的食用菌多以木屑、棉籽殼、秸稈和麥麩[2]等作為栽培基質(zhì),其中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和淀粉等天然高聚物質(zhì),可誘導(dǎo)食用菌分泌纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶和淀粉酶等多種胞外降解酶,在胞外酶的作用下對外源營養(yǎng)物質(zhì)分解進(jìn)而獲得碳源和氮源[3]。因此,胞外降解酶在食用菌生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用,胞外酶活力的高低直接決定食用菌對培養(yǎng)基料中營養(yǎng)物質(zhì)的降解速率,影響食用菌對營養(yǎng)的吸收和利用速率,進(jìn)一步影響食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)。食用菌胞外酶的合成分泌主要受基因的控制,同時也受外界環(huán)境和自身代謝等因素的影響,因此,不同生長時期食用菌合成分泌的胞外酶種類和活力不盡相同。食用菌胞外降解酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、淀粉酶、果膠酶和蛋白酶等,可分解基質(zhì)中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、多糖和蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì),為食用菌的生長發(fā)育提供營養(yǎng)保障[4]。目前,關(guān)于食用菌胞外降解酶的種類、活性測定方法及其應(yīng)用等已有大量的研究報道。為我國食用菌胞外降解酶的研究與應(yīng)用提供參考,從食用菌的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶和淀粉酶4種主要胞外酶的研究概況、測定方法和應(yīng)用研究等方面進(jìn)行概述。

1 食用菌胞外酶的種類

1.1 纖維素酶系

食用菌纖維素酶是降解纖維素生成短鏈葡聚糖、寡糖或葡萄糖的一組酶系,根據(jù)催化反應(yīng)功能的不同分為內(nèi)切葡聚糖酶(C1酶)、外切葡聚糖酶(Cx酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL酶)。纖維素本身不溶于水,纖維素酶與纖維素難以形成酶-底物復(fù)合物(ES),因此需要借助纖維素酶的吸附作用形成復(fù)合物,在多種酶組分的協(xié)同作用下分解利用纖維素,為食用菌的生長提供碳源[4]。目前,有關(guān)食用菌胞外纖維素酶的研究多集中于不同食用菌品種的產(chǎn)纖維素酶能力、纖維素酶的篩選與鑒定和纖維素酶的活力提升方法等方面。丁玉萍等[5]研究表明,大白菇、金針菇、香菇、竹蓀、磷蓋紅菇和杏鮑菇6種食用菌的產(chǎn)纖維素酶能力以磷蓋紅菇最強(qiáng)。DEBNATH等[6]通過控制物理和化學(xué)參數(shù)影響野生食用菌Pleurotusgiganteus胞外纖維素酶的活性,篩選出胞外纖維素酶活性最適條件為溫度50 ℃、pH 5.0、底物濃度1.4%(羧甲基纖維素)和反應(yīng)時間30 min。馮光志等[7]研究發(fā)現(xiàn),鋅能促進(jìn)平菇胞外酶的分泌。

1.2 半纖維素酶系

食用菌半纖維素酶簡稱HC酶,為β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和α-葡萄糖醛酸酶等酶協(xié)同作用下而形成的酶系,能將半纖維素降解為木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等單糖供菌絲體吸收利用。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶是水解半纖維素的關(guān)鍵酶,木聚糖酶將木聚糖水解為低聚木糖,降低聚合度,木糖苷酶通過水解木寡糖的末端催化木糖殘基的釋放[8]。目前,有關(guān)食用菌胞外半纖維素酶的研究多集中于半纖維素酶活性方面,包括產(chǎn)酶能力以及產(chǎn)酶條件優(yōu)化等。張紅剛等[9]研究發(fā)現(xiàn),在菌絲體階段和現(xiàn)蕾前期噴施三十烷醇、3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸和蕓苔素內(nèi)酯6種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后白靈菇不同生長發(fā)育階段半纖維素酶活性均有所提高,其中蕓苔素內(nèi)酯對半纖維素酶的影響最大。JURAK等[10]對從菌絲生長和子實體形成階段的雙孢蘑菇堆肥中提取的內(nèi)切木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡聚糖酶的活性分析表明,4種酶均存在內(nèi)切木聚糖酶和β-木聚糖酶的活性,以葡聚糖酶活性較小。張孔金等[11]研究富硒巴西蘑菇菌絲胞外酶活性發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的硒對半纖維素酶活性具有促進(jìn)作用。

1.3 木質(zhì)素降解酶系

食用菌木質(zhì)素降解酶主要包括過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(LaC)。木質(zhì)素過氧化物酶是木質(zhì)素降解過程中的主要酶類,可在木質(zhì)素聚合物內(nèi)形成自由基,導(dǎo)致化學(xué)鍵穩(wěn)定性變差從而破壞木質(zhì)素大分子。錳過氧化物酶和漆酶同屬于酚氧化酶。目前,有關(guān)食用菌胞外木質(zhì)素降解酶的研究已有大量報道,其中漆酶研究開展較早,是所有木質(zhì)素降解酶中研究最多的酶類,過氧化物酶也有學(xué)者進(jìn)行一定的研究。李鵬等[12]采用雙因素方差分析3個毛木耳菌株在木屑、玉米芯、棉籽殼和麥麩4種栽培基質(zhì)下的產(chǎn)漆酶活性發(fā)現(xiàn),毛木耳菌株中毛木耳781和玉木耳01分泌的漆酶活性最高,栽培基質(zhì)中麥麩對毛木耳菌株產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。張初署等[13]研究表明,食用菌SJ-1漆酶的最適反應(yīng)pH為3.0,最適反應(yīng)溫度為35 ℃;Cu2+能夠顯著激活食用菌SJ-1漆酶的活性,而 Fe2+、Ca2+、Mg2+、Na+和K+對SJ-1漆酶活性具有不同程度的抑制作用。肖冬來等[14]研究發(fā)現(xiàn),常見金屬離子Ca2+、K+、Mn2+、Mg2+和Fe2+等對木質(zhì)素過氧化物酶活性具有抑制作用,Na+對木質(zhì)素過氧化物酶活性具有促進(jìn)作用。

1.4 淀粉酶系

食用菌淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶的總稱,能夠分解淀粉糖苷鍵。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉和糖元等α-1,4-葡聚糖的α-1,4-糖苷鍵,水解生成葡萄糖、麥芽糖和含有α-1,6-糖苷鍵支鏈的糊精。目前,食用菌胞外淀粉酶的研究主要集中在活性方面,主要是探究不同條件變量下的淀粉酶活性。閆靜等[15]對不同溫度下秀珍菇胞外淀粉酶活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),相同處理溫度下,隨著處理時間延長,淀粉酶活性總體呈先升后降趨勢。肇瑩等[16]研究小麥、大米和柞蠶蛹3種栽培基質(zhì)下蛹蟲草胞外淀粉酶的活性及其與營養(yǎng)成分的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),小麥、柞蠶蛹和大米3種栽培基質(zhì)胞外淀粉酶活性依次遞減,且蛹蟲草子實體中蛋白質(zhì)的累積與淀粉酶活性呈極顯著正相關(guān)。BEDADE等[17]在不同的碳源、pH和培養(yǎng)時間條件下對斑塊塊菌菌絲體進(jìn)行液體深層發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的最優(yōu)條件為可溶性淀粉0.5% (w/v)、初始培養(yǎng)基pH 7.0和培養(yǎng)時間7 d,該條件下淀粉酶活力達(dá)1.41 U/mL,且該淀粉酶在pH 5.0和50 ℃時活性最強(qiáng)。

2 食用菌胞外酶活性的測定方法

2.1 定性分析

平板顯色法是定性分析食用菌胞外酶活性的主要方法,具有顯色快捷和操作簡易特點,常用于從大量食用菌菌株中篩選產(chǎn)目標(biāo)胞外酶的菌株,可為多種食用菌的產(chǎn)酶菌株篩選減少篩選工作量。平板顯色法包括平板透明圈法和平板變色圈法,透明圈和變色圈的出現(xiàn)速度、直徑大小以及變色圈的顏色深淺能夠直接反映菌株與營養(yǎng)物質(zhì)或指示劑等物質(zhì)反應(yīng)的能力,可初步判斷菌株生成的胞外酶數(shù)量及活性[18]。平板透明圈法是指在固體栽培基質(zhì)中加入營養(yǎng)物質(zhì),使試驗菌株生成的特定胞外酶分解營養(yǎng)物質(zhì),在菌落周圍產(chǎn)生透明圈[19]。如定性篩選產(chǎn)纖維素酶常用剛果紅選擇培養(yǎng)基,其原理是剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素(多糖)形成紅色復(fù)合物,但剛果紅并不與水解后的葡萄糖和纖維二糖形成復(fù)合物,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。徐源等[20]利用剛果紅染色法對生產(chǎn)中常見的6個食用菌菌種進(jìn)行高活性纖維素酶菌株篩選發(fā)現(xiàn),雞腿菇51的纖維素酶降解能力最強(qiáng),平菇各品種其次,茶樹菇TS1最弱。定性分析產(chǎn)半纖維素酶也常使用平板透明圈法,在培養(yǎng)基中添加木聚糖并用染色劑染色,木聚糖酶水解木聚糖后出現(xiàn)染色區(qū)和透明區(qū),透明圈直徑與酶量的對數(shù)呈正相關(guān)[21]。此外,定性篩選淀粉酶時,在含有淀粉的培養(yǎng)基中噴灑含碘染色劑,被染色的藍(lán)色平板上會出現(xiàn)以產(chǎn)淀粉酶菌種為中心的透明圈。平板變色圈法是指在固體栽培基質(zhì)中加入特定指示劑,使得實驗菌株生成的胞外酶與指示劑發(fā)生顯色反應(yīng)[19]。如定性分析食用菌木質(zhì)素酶主要采用平板變色圈法,漆酶(LaC)能使單寧酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚镔|(zhì),錳過氧化物酶(MnP)和Mn2+共同作用將愈創(chuàng)木酚氧化成棕紅色有機(jī)物,木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)能使RB-亮藍(lán)變?yōu)辄S色,通過平板的變色情況定性分析菌株產(chǎn)木質(zhì)素酶能力。高鋒等[22]通過平板變色圈法,分別利用RB-亮藍(lán)、單寧酸和愈創(chuàng)木酚為底物的培養(yǎng)基測定平菇、香菇和杏鮑菇中的木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和錳過氧化物酶。

2.2 定量分析

2.2.1 纖維素酶活性 纖維素酶是復(fù)合酶,其定量分析方法可分為單一纖維素酶組分酶活力測定和纖維素酶總酶活力測定。單一纖維素酶組分活力測定的方法主要是羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測定方法[23],纖維素酶作用于CMC-Na并將其分解為葡萄糖和纖維二糖等還原糖,DNS與還原糖反應(yīng)生成紅棕色化合物,以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制還原糖濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)液顏色強(qiáng)度與還原糖含量成比例,利用比色法得到還原糖濃度,從而確定酶活力。

馮作山等[24]報道,白靈側(cè)耳栽培過程中各生長發(fā)育階段的羧甲基纖維素酶活性,以實體生長階段第107 天時達(dá)最大值。纖維素酶總酶活力測定方法主要是濾紙酶活(FPA)測定方法,濾紙是聚合度中等的纖維素材料,纖維素酶將其水解后生成的還原糖量的多少反應(yīng)酶活高低,通過加DNS試劑顯色后的OD值得出具體酶活數(shù)值,該方法由于濾紙結(jié)構(gòu)復(fù)雜,一般適用于酶活力較強(qiáng)的菌株[25]。趙長江等[26]采用羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測定方法和濾紙酶活測定方法分別測定不同碳、氮源對猴頭菌的單一纖維素酶活性和總酶活性得出,葡萄糖碳源和蛋白胨氮源下單一纖維素酶活性最強(qiáng),葡萄糖碳源和苯丙氨酸氮源下總酶活性最強(qiáng)。此外,熒光定糖法也可用于酶活力的測定[23],該法利用纖維素水解產(chǎn)物還原糖與反應(yīng)液反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度來表征酶活力,且其反應(yīng)靈敏、迅速,適于較低酶濃度的測定。

2.2.2 半纖維素酶 半纖維素酶主要包括木聚糖酶和木糖苷酶。木聚糖酶和木糖苷酶的活性均采用分光光度計法測定,但顯色原理有所不同。木聚糖酶的顯色原理是木聚糖酶分解木聚糖生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)發(fā)生顯色反應(yīng)。而木糖苷酶的原理是利用硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)與木糖苷酶反應(yīng)產(chǎn)生的對硝基苯酚(pPN)與Na2CO3反應(yīng)顯色[8]。馬懷良等[27]采用DNS顯色法測定猴頭菌糠、平菇菌糠和滑子蘑菌糠中的木聚糖酶在不同pH和溫度條件下的活性。林金盛等[28]采用pNPX測定了不同濃度MgSO4下草菇在含檸檬酸鈉的PDB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的木糖苷酶活性。

2.2.3 木質(zhì)素降解酶 木質(zhì)素降解酶活性的測定方法主要有分光光度計法、脈沖激光光聲分析法、高效液相色譜法和極譜法等,主要用于漆酶、過氧化物酶和錳過氧化物酶活性的定量分析。其中,分光光度計法具有操作簡單、測定迅速和儀器設(shè)備簡易等特點,在木質(zhì)素降解酶活性測定中應(yīng)用較多,根據(jù)所測酶的種類不同選擇不同的底物和緩沖溶液。測量漆酶活性常見的分光光度計法有ABTS法和愈創(chuàng)木酚法等,不同方法優(yōu)缺點各異。ABTS法以ABTS作為底物,優(yōu)點是漆酶對ABTS親和力高,反應(yīng)靈敏,但ABTS價格較高。愈創(chuàng)木酚法以愈創(chuàng)木酚為底物,價格較低但反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定,酶活數(shù)值偏低,且反應(yīng)時間較長[19]。測量木質(zhì)素錳過氧化物酶(MnP)酶活常采用愈創(chuàng)木酚法,MnP和Mn2+共同作用于愈創(chuàng)木酚可使其變?yōu)樽丶t色,根據(jù)其吸光度不同測定其酶活;木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)酶活的測定常采用藜蘆醇氧化速率法,以藜蘆醇為底物,H2O2進(jìn)行催化,測得310 nm下的吸光度值判斷LiP的酶活。郭艷艷等[29]利用ABTS、愈創(chuàng)木酚和藜蘆醇分別測定不同營養(yǎng)條件下斑玉蕈胞外漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性。張仕琦等[30]采用ABTS法和Mn2+混合溶液,通過分光光度計法測定阿魏側(cè)耳NB-1菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外漆酶和錳過氧化物酶活性,以優(yōu)化產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的培養(yǎng)基。

2.2.4 淀粉酶活性 分光光度計法是淀粉酶活性定量分析最常用的方法,可分為碘-淀粉比色法和DNS法。碘-淀粉比色法原理為α-淀粉酶催化水解淀粉,碘液與反應(yīng)后未被水解的底物淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物[31]。淀粉酶DNS法與纖維素酶DNS法原理相同,具有試劑易得和測定準(zhǔn)確率高等優(yōu)點。楊光等[32]采用碘-淀粉比色法測定微量直鏈淀粉含量,其具有準(zhǔn)確、簡便和快速等特點。范博文等[31]利用DNS法測定不同碳、氮源對猴頭菌胞外淀粉酶活性,并將生長指標(biāo)與淀粉酶活性聚類分析發(fā)現(xiàn),淀粉酶活性與液體培養(yǎng)菌絲干質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 食用菌胞外酶的應(yīng)用

目前,微生物來源的纖維素酶和半纖維酶已經(jīng)在食品加工、乙醇發(fā)酵生產(chǎn)、飼料加工和環(huán)境治理等多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,而食用菌來源的纖維素酶和半纖維酶的應(yīng)用研究較少且不夠深入,主要用于菌種活力的鑒定、栽培基質(zhì)的篩選和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢物的轉(zhuǎn)化再利用等。楊勇[33]研究發(fā)現(xiàn),食用菌胞外酶中的纖維素酶可作為降解刺梨果渣的主要催化劑,以提高刺梨果渣的利用率并解決刺梨果渣帶來的環(huán)境問題;徐瑞蔓等[34]報道,食用菌菌糠中含有大量微生物和纖維素半纖維酶,可加快牛糞堆肥的腐熟進(jìn)程。食用菌木質(zhì)素降解酶除在菌種培養(yǎng)和栽培中具有重要作用外,在食品安全、工業(yè)染料處理和抗腫瘤藥物等方面也有研究報道。婁海偉等[35]篩選出食用菌漆酶用以降解黃曲霉毒素B1(AFB1),每年可減少大量谷物因被黃曲霉毒素B1污染而造成的損失;楊建明等[36]從毛木耳粗酶液中分離純化得到Lac A、Lac B和Lac C 3種漆酶,其中Lac B對RB亮藍(lán)得脫色率達(dá)77.4%。馬茜茜等[37]從云芝發(fā)酵液中純化得到1種漆酶,其對乳腺癌MCF7細(xì)胞和肝癌HePG2細(xì)胞均有抑制作用。淀粉酶在以淀粉為原材料的工業(yè)中發(fā)揮著重要作用,包括淀粉深加工行業(yè)、洗滌劑業(yè)、紡織業(yè)、烘焙食品以及生物燃料等[38]。目前,商品化淀粉酶主要通過微生物發(fā)酵法制備,鮮見食用菌淀粉酶制備及應(yīng)用的研究報道。

4 展望

食用菌胞外酶種類豐富,在食用菌的營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育過程中具有重要作用。因此,對食用菌胞外酶的作用機(jī)理、生物學(xué)性質(zhì)和實際應(yīng)用等進(jìn)行研究具有重要現(xiàn)實意義。目前,有關(guān)食用菌胞外酶的研究多處于實驗室研究階段,僅有漆酶等少數(shù)胞外酶的研究較為深入。我國食用菌資源豐富,其蘊(yùn)藏的胞外酶及其酶基因具有重要的開發(fā)前景。今后可利用高通量篩選技術(shù)獲得胞外酶活性較高的食用菌菌株,開展對其產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)和編碼基因等方面的研究。一方面,通過發(fā)酵技術(shù)制備食用菌胞外酶;另一方面,可克隆其胞外酶基因,利用酶分子的定向進(jìn)化技術(shù)和基因工程手段對其進(jìn)行改造與生產(chǎn),使其更適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。