葛 瀟,于 淼,武 偉,畢秀婷,吳小燕,于 晨,李 倜

鉭(Tantalum,Ta)是一種新興的金屬生物材料,其機械性能及生物學性能優(yōu)于鈦和鈦合金,在修復骨缺損方面得到廣泛應用,有潛力成為鈦及鈦合金的替代材料[1-3]。鉭的密度較大,價格昂貴,因此臨床上金屬鉭多以涂層的形式用于種植體表面改性[4]。等離子噴涂技術(shù)因其適用范圍廣、工藝參數(shù)可控、制備流程簡單等成為種植體表面涂層制備的常用方法[5]。有研究表明,在噴砂酸蝕(sandblasted,large-grit,acid-etched,SLA)處理的鈦種植體表面用等離子噴涂技術(shù)制備的鉭涂層結(jié)合緊密且具有多孔結(jié)構(gòu),且生物相容性較鈦種植體更好[6-7]。細胞在材料表面的表現(xiàn)是獲得良好骨整合的關(guān)鍵,決定了骨植入物的長期穩(wěn)定性和成功率[8-9]。人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)是一種具有多向分化能力的成體干細胞,且獲取方式簡單、微創(chuàng),其成骨潛能對種植體周圍的骨形成具有重要意義。本研究在SLA鈦金屬表面通過等離子噴涂技術(shù)制備鉭涂層,并在其表面培養(yǎng)hPDLSCs,以探究鉭涂層表面對hPDLSCs增殖和成骨分化的作用,為鉭涂層鈦種植體的臨床應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

純鈦片、鉭粉、胎牛血清(Gibco,美國)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)、胰蛋白酶(Gibco,美國)、CCK-8試劑盒(Dojindo,日本)、茜素紅染液(Solarbio,中國)、油紅O染色試劑盒(Beyotime,中國)、BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio,中國)、ALP/AKP測定試劑盒(南京建成,中國)、Trizol試劑(Ambion,美國)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Mix試劑盒(艾科瑞生物,中國)、引物(上海生工,中國)、小鼠抗人抗體(biolegend,美國)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(TM4000Plus,HITACHI,日本)、體視顯微鏡及倒置顯微鏡(Leica,德國)、流式細胞儀(Agilent,美國)、酶標儀(Thermo,美國)、PCR儀(BIO-RAD,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦試件的處理、分組及表征 ①將純鈦片用SiC砂紙逐級拋光得到表面光滑的鈦試件,命名為P組;②將經(jīng)過拋光的試件進行噴砂(噴砂粒徑400～600 μm,噴砂壓力0.4 MPa,噴砂角度45°)、酸蝕(混合酸溶液:49% HCl和19% H2SO4,60 ℃,30 min)處理,命名為SLA組;③用丙酮、無水乙醇、去離子水依次對經(jīng)SLA處理的試件超聲清洗3 min,然后在鈦試件表面用PRAXAIR3710等離子噴涂系統(tǒng)制備鉭涂層,命名為Ta組,具體噴涂參數(shù)如下:噴涂距離110 cm,電流820 A,電壓37 V,噴槍移動速度100 mm/s,送粉速度15 g/min,涂層厚度100 μm左右。用SEM觀察SLA組、Ta組的試件表面和Ta組的截面,用能譜分析儀(energy dispersive spectrometer, EDS)對其主要成分進行分析。

1.2.2 hPDLSCs的分離培養(yǎng) 實驗經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會批準(審批號KYLL20191114-2),取2021年10月16日—2021年11月27日臨床上無齲病、無牙周病的12～18歲患者正畸需拔除的前磨牙,立即置于含有5%青/鏈霉素的PBS液中,2 h內(nèi)在超凈工作臺上完成牙周膜分離操作。用無菌PBS液(含5%青/鏈霉素)反復沖洗離體牙,無菌刀片刮取牙根中段的牙周膜組織,分成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊,平鋪在25 cm2的培養(yǎng)瓶底,加入含有20%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液4～6 mL。放入培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2),瓶底向上培養(yǎng)3～4 h后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。顯微鏡下觀察,待有細胞游出后,每3 d更換培養(yǎng)基。當細胞生長至約80%融合時,用胰蛋白酶消化進行傳代。將第3代細胞進行凍存,在后續(xù)的實驗中使用。

1.2.3 hPDLSCs的鑒定 ①流式細胞術(shù)檢測表面抗原:取1.2.2部分培養(yǎng)的第3代細胞,消化后PBS洗滌3遍,使細胞懸液密度為4×105個/mL,并向每個管加入250 μL細胞懸液,其中1管為空白對照,其余分別添加CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105抗體,避光孵育,PBS洗滌3遍,上機檢測。②成骨、成脂分化能力檢測:取第3代hPDLSCs,以每孔1.5×105個的密度接種于6孔板中,待細胞貼壁后,更換成骨誘導培養(yǎng)基(含抗壞血酸0.05 mmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、地塞米松1×10-7mol/L)培養(yǎng)21 d后棄去培養(yǎng)液,PBS沖洗,多聚甲醛固定,用茜素紅染色液染色。用成脂誘導培養(yǎng)基(含3-異丁基-1-甲基嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L、胰島素10 mg/L、地塞米松1 μmol/L)培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)液,PBS沖洗,多聚甲醛固定,用油紅O染色液染色。

1.2.4 CCK-8法測定hPDLSCs增殖情況 將第4～5代hPDLSCs以2×104個/孔的密度接種于放置有3組試件的24孔板,每組設(shè)3個復孔(n=3),隔天換液,培養(yǎng)1、3、5、7 d后,吸棄培養(yǎng)基,每孔加入600 μL培養(yǎng)基和60 μL CCK-8試劑,在37 ℃培養(yǎng)箱里孵育2 h,每孔吸取100 μL置于96孔板中,用酶標儀測定450 nm波長下的OD值。

1.2.5 ALP活性檢測 將hPDLSCs以2×104個/孔的密度接種于孔底置有各組試件(n=3)的24孔板中,待細胞貼壁后,棄去原培養(yǎng)液,更換為成骨誘導培養(yǎng)基,每2 d換液1次,誘導7、14 d。吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗3次,每孔加入100 μL RIPA裂解液,裂解30 min,BCA法測定蛋白濃度。按照ALP測定試劑盒要求,在520 nm波長處用酶標儀測定各孔吸光度值,計算ALP活性。

1.2.6 茜素紅染色 將hPDLSCs接種于置有各組試件(n=3)的24孔板中,細胞密度為2×104個/孔,待細胞貼壁后,棄去原培養(yǎng)液,更換為成骨誘導液,培養(yǎng)21 d后進行茜素紅染色,用體視顯微鏡拍照記錄。

1.2.7 實時熒光定量PCR(qPCR) 細胞接種于各組試件(n=3)行成骨誘導培養(yǎng)14 d后,用Trizol試劑裂解細胞,提取總RNA。RNA濃度通過核酸定量儀測定,按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR(qPCR)反應,引物序列如表1所示。qPCR反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,運行40個循環(huán),以GAPDH作為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法對成骨標志基因ALP、RUNX2、OCN進行基因相對表達倍數(shù)轉(zhuǎn)化。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 鈦試件表面觀察及成分分析

大體觀覆蓋鉭涂層的試件如圖1所示,呈黑灰色,表面較為粗糙。掃描電鏡下觀察,Ta組試件與SLA組試件的表面形貌如圖2所示。SLA組表面可見酸蝕、噴砂后形成的大小不一的坑槽樣結(jié)構(gòu);Ta組表面可見扁平狀的鉭顆粒相互連接,其間夾雜部分類球形微粒,形成尺寸不一的不規(guī)則氣孔,組成具有微納米結(jié)構(gòu)的涂層表面。Ta組試件截面圖像顯示鉭涂層與SLA鈦表面結(jié)合緊密,且涂層在垂直方向上可見層層堆積的鉭顆粒形成的孔隙(圖3)。EDS分析圖譜表明涂層的主要元素成分是鉭(圖4),證明了在鈦試件上成功制備了鉭涂層。

圖1 Ta涂層試件外觀

A:SLA組表面低倍鏡( ×200);B:Ta組表面低倍鏡( ×200);C:SLA組表面高倍鏡( ×1 500);D:Ta組表面高倍鏡( ×1 500);SLA組表面可見酸蝕、噴砂后形成的大小不一的坑槽樣結(jié)構(gòu);Ta組表面可見扁平狀的鉭顆粒相互連接,其間夾雜部分類球形微粒,形成尺寸不一的不規(guī)則氣孔,組成具有微納米結(jié)構(gòu)的涂層表面

圖3 Ta組試件截面SEM圖像( ×2 000)

圖4 Ta組試件表面元素EDS分析圖譜

2.2 hPDLSCs的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果

原代hPDLSCs的分離、培養(yǎng)采用組織塊法,在培養(yǎng)5～7 d時可觀察到細胞從組織塊周圍貼壁爬出,倒置顯微鏡下觀察細胞呈星形或梭形,如圖5A所示。當細胞生長至80%融合時可進行消化、傳代,傳代后的細胞生長狀態(tài)良好,顯微鏡下觀察呈漩渦狀排列,如圖5B所示。

A:原代hPDLSCs( ×40);B:第3代hPDLSCs( ×40);標尺大小:500 μm

流式細胞儀檢測結(jié)果見圖6,細胞高表達間充質(zhì)干細胞標志物CD44、CD90、CD105、CD73,對造血干細胞標志物CD34、CD45幾乎不表達,證實培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)來源。

圖6 流式細胞儀檢測hPDLSCs表面相關(guān)抗原

成骨誘導21 d,茜素紅染色后可觀察到大量礦化結(jié)節(jié)形成(圖7A),表明細胞具有成骨分化的能力。成脂誘導培養(yǎng)14 d,油紅O染色后可觀察到紅色油滴(圖7B),證實其具有成脂分化的能力。

A:hPDLSCs成骨分化( ×100),標尺:200 μm;B:hPDLSCs成脂分化( ×400),標尺:50 μm

2.3 鉭涂層對hPDLSCs增殖能力的影響

通過CCK-8法檢測各組試件表面hPDLSCs增殖情況,結(jié)果見表2、圖8。在1 d時,三組細胞的OD值差異無統(tǒng)計學意義,在培養(yǎng)3、5、7 d后,Ta組OD值明顯高于SLA組及P組(P<0.05);在培養(yǎng)5、7 d后,SLA組OD值明顯高于P組(P<0.05)。

圖8 CCK-8檢測hPDLSCs增殖情況

表2 CCK-8檢測hPDLSCs增殖情況

2.4 ALP活性檢測結(jié)果

ALP活性檢測結(jié)果如表3所示,細胞的ALP活性呈現(xiàn)升高的趨勢。在第7天時,三組間的差距無統(tǒng)計學意義;第14天時,Ta組ALP活性明顯高于P組和SLA組,具有顯著差異(P<0.01),而P組和SLA組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表3 堿性磷酸酶活性檢測

2.5 茜素紅染色結(jié)果

細胞與3組試件共培養(yǎng)21 d后的茜素紅染色結(jié)果見圖9,三組材料表面都有紅色鈣化結(jié)節(jié)形成,SLA組和Ta組的紅染區(qū)域明顯多于P組,Ta組礦化結(jié)節(jié)相對于SLA組更為密集。

A:P組試件;B:SLA組試件;C:Ta組試件;標尺:1 mm

2.6 成骨相關(guān)基因表達結(jié)果

成骨誘導培養(yǎng)14 d時,qPCR檢測結(jié)果如表3所示。Ta組和SLA組的ALP基因表達差異無統(tǒng)計學意義,但Ta組高于SLA組,與P組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Ta組RUNX2、OCN基因表達水平高于SLA組和P組(表4),且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。SLA組ALP、RUNX2、OCN的基因表達顯著高于P組(P<0.05)。

表4 ALP、RUNX2、OCN mRNA相對表達量

3 討 論

種植體表面物理和化學性質(zhì)對早期形成穩(wěn)定的骨結(jié)合具有很大的影響[10],對種植體表面進行改性能夠提高其生物活性[11-12]。單純的SLA處理僅能改變種植體的表面形貌,且以往的回顧性研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SLA處理的鈦合金表面金屬微粒脫出,可導致細胞毒性且加速種植體的腐蝕[13]。涂層能夠改變種植體的表面生物學性能,同時能起到對鈦基底的保護作用。在SLA鈦表面通過等離子噴涂制備出具有微納米級表面特征的鉭涂層,既改變了表面形貌又改變了化學元素組成。鉭具有出色的機械性能、耐腐蝕性和良好的骨誘導性[14],能夠提高鈦板的生物活性和力學性能[15]。SEM、EDS分析結(jié)果表明,具有微納米結(jié)構(gòu)的鉭涂層覆蓋在SLA鈦表面,且結(jié)合緊密。

目前國內(nèi)外對于骨缺損修復的研究已趨向于將生物材料和細胞聯(lián)合的骨組織再生工程,干細胞在組織再生方面顯示出良好的前景,并被考慮應用于骨缺損的修復。以往的骨再生研究中多應用骨髓間充質(zhì)干細胞,但其分化能力會隨細胞傳代迅速減弱,而牙周膜干細胞的增殖、分化能力在傳代過程中較為穩(wěn)定,且取材相對容易。從牙周膜中分離的hPDLSCs可作為頜骨再生的成骨前體細胞的來源[16]。實驗通過CCK-8法檢測三組樣品對PDLSCs的增殖的影響,發(fā)現(xiàn)hPDLSCs與三組試件共培養(yǎng)1、3、5、7 d后,Ta組的hPDLSCs的增殖速度較SLA組和P組明顯提高,表明鉭涂層表面對于細胞的生長增殖具有促進作用。前期已有研究表明鉭涂層表面有更高的蛋白質(zhì)吸附能力,這決定了細胞早期能夠在材料表面獲得更好的黏附和鋪展[17],從而為細胞增殖和分化提供有利條件[18]。此外,結(jié)構(gòu)復雜的種植體表面具有更大的表面積,延長了形成細胞融合的時間,允許細胞在達到接觸抑制之前進行更大面積的增殖[19]。從仿生學角度來講,鉭涂層改性的微/納米結(jié)構(gòu)的表面與天然的骨結(jié)構(gòu)更為相近,合適大小的微窩結(jié)構(gòu)能夠使接觸的細胞獲得與成骨表型接近的長徑比[20-21]。且鉭涂層表面的Ta2O5具有生物活性,與微/納米結(jié)構(gòu)具有協(xié)同促進細胞黏附增殖的作用[22]。細胞的快速增殖使種植體表面與周圍組織的有效接觸面積增加,提高了組織-種植體表面相互作用強度,有利于形成良好的骨結(jié)合[23]。

成骨誘導性對提高種植成功率具有重要意義,是影響種植體早期穩(wěn)定的重要因素。堿性磷酸酶在骨礦化早期發(fā)揮功能,其水平升高與骨形成率呈正相關(guān)。本研究中,ALP活性檢測顯示在第14天時,各組的ALP活性最高,Ta組明顯高于SLA組和P組。這表示鉭涂層表面能夠促進hPDLSCs的早期成骨分化。過去的研究也表明,鈦鉭梯度材料相比純鈦材料,能提高成骨細胞的ALP活性[24]。在細胞與材料培養(yǎng)21 d后進行茜素紅染色,鉭涂層上的分化細胞群比粗糙或光滑鈦表面上的細胞產(chǎn)生更多的鈣結(jié)節(jié),這表明鉭涂層表面的骨誘導性增強,這與先前的研究結(jié)論一致[25-26]。而qPCR對成骨相關(guān)基因的檢測結(jié)果進一步證實了鉭涂層組的促成骨作用。通過對成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2、OCN表達的檢測來比較不同試件對細胞成骨活性的影響,結(jié)果顯示Ta組對成骨的促進作用最佳。ALP是成骨礦化機制中最重要的功能基因之一,在礦化周期的早期發(fā)生,能夠啟動骨細胞的鈣離子沉積[27];OCN是在細胞分化后期分泌的非膠原蛋白,在合成和重建骨組織過程中有著重要作用,能反映礦物質(zhì)的沉積情況[28];RUNX2是調(diào)節(jié)干細胞向成骨細胞分化和成熟的主要轉(zhuǎn)錄因子,誘導骨基質(zhì)蛋白基因的表達,在缺乏RUNX2的情況下不會發(fā)生成骨[29]。近年來,已發(fā)現(xiàn)鉭的成骨誘導性與許多經(jīng)典的成骨信號通路有關(guān)[30],這從發(fā)生機制上解釋了鉭能夠促進hPDLSCs成骨的原因。

綜上所述,SLA鈦表面制備的鉭涂層能夠促進hPDLSCs的增殖和成骨分化,具有良好的生物相容性,等離子噴涂技術(shù)能夠在傳統(tǒng)鈦種植體表面制備具有微納米級結(jié)構(gòu)的鉭涂層,為開發(fā)新型種植體提供了思路。本實驗研究提示,與傳統(tǒng)的鈦合金種植體材料相比,鉭涂層能更好地促進牙周干細胞的增殖和成骨分化,這為后期種植體表面設(shè)計的優(yōu)化提供了生物學指導。但是種植體的長期效果在體內(nèi)會受到更多因素的影響,因此鉭涂層鈦種植體的性能還需要進一步的體內(nèi)實驗證實。